J-Resolved分子指纹识别技术：基于超极化低场核磁共振（NMR）与仲氢（parahydrogen）的特性

《Journal of the American Chemical Society》：J-Resolved Molecular Fingerprinting by Parahydrogen Hyperpolarized Low-Field NMR

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J-分辨光谱依赖于强耦合区域的同核标量耦合和弱耦合区域的异核耦合，将复杂的峰形扩展到第二个维度。通过可逆交换信号放大（SABRE）技术，即使在0.82 mT的弱磁场下也能进行光谱测量。这种技术能够分辨出3-氟吡啶和3,5-二氟吡啶等分子的重叠峰。1H和19F自旋的密度矩阵模拟表明，峰形强烈依赖于J耦合常数的符号和数值，包括那些无法直接观测到的同核耦合。最佳匹配的峰位和强度可以预测出耦合常数，对于这两种分子，这些常数的大小范围在0.4到9.0 Hz之间。其他自旋系统的模拟也显示出独特的峰形，尤其是含有1H和19F或13C的分子。J-分辨峰形对所有耦合常数的依赖性为分子的便携式和低成本识别提供了一种新的方法。

核磁共振（NMR）光谱的化学特异性很大程度上来源于化学位移的观测。然而，其他参数也携带了分子信息。标量耦合常数（也称为J耦合常数）长期以来被用于预测生物大分子的二面角。
（1）长程耦合不仅对键长和角度敏感，还对立体化学结构敏感。
（2,3）特定的NMR实验可以测量分子中J耦合的幅度和符号。
（4,5）在低磁场下，J耦合常数仍然具有信息价值，因为此时无法测量化学位移。
（6）低场NMR需要更简单、成本更低的仪器，且更具便携性。
（7）它还能提供关于分子动力学的独特见解。
（8）J耦合常数还与分子间的结合相互作用和化学交换过程有关。
（9）由交换引起的线宽减小或消失。
（10）在低射频频率下，NMR可以穿透金属外壳进行观测。
（11,12）不同的自旋弛豫时间可以在磁共振成像中提供对比度差异。
（13）J耦合常数还能帮助区分材料的孔隙率。
（14）在低场下测量的J耦合常数可以识别分子的结构特征，并有助于研究代谢过程。
（15,16）二维光谱即使在地球磁场下也能关联原子类型并显示耦合模式。
（17）高磁场均匀性可以提高J耦合常数测量的准确性。
（18）在mT的磁场下，同核耦合属于强耦合区域，而异核耦合相对较弱。在强耦合下，光谱的复杂性增加。
（19）可以通过自旋锁定诱导的交叉或同步自旋回波（20,21）以及零场演化与低场检测的结合来测量耦合常数。
（20,21）J耦合常数的演化过程也可以在零场下直接观测到。
（23,24）长寿命自旋态在低场和零场下表现出独特特性，其弛豫特性与J耦合常数相关。

由于自旋极化程度低，化学分析所需的样品量可能不足以被检测到。SABRE技术通过增强信号（最多可增强10^6倍）使得在mT磁场下的测量成为可能。这种技术无需依赖笨重且昂贵的仪器，因此具有重复使用的优势。

我们的目标是通过J-分辨二维NMR光谱来实现分子指纹识别。与高场下基于化学位移的指纹识别方法相比，这种方法具有独特优势。
（32,33）选择吡啶衍生物作为模型化合物，因为它们容易通过SABRE技术进行超极化，并且在生物分子和药物中非常常见。

图1展示了在0.82 mT下测量的3-氟吡啶和3,5-二氟吡啶的超极化NMR光谱。非均匀展宽通过单次自旋回波序列得到重新聚焦，从而实现3.4秒的数据采集。19F和1H自旋的频率差异较大，无法用矩形射频脉冲精确激发，因此需要使用两个同时选择性的脉冲（见图S3–S5）。

图1：
(a) 在0.82 mT下测量的SABRE超极化3,5-二氟吡啶的1D时间域回波序列和光谱；
(b) 在0.82 mT下测量的SABRE超极化3-氟吡啶的光谱。FT范围和放大倍数用洋红色边界标示。时间域信号通过数字滤波器选择19F拉莫频率进行显示。
(c, d) 实验（蓝色）和模拟（洋红色）的19F光谱，经过4倍零填充处理后，以19F频率的位移形式展示。模拟未考虑B0和B1的不均匀性、B1的校准误差以及弛豫效应。

在清除脉冲引起的瞬态干扰后，对所有回波进行了傅里叶变换（FT）。由于对两个核都施加了脉冲，J分裂现象得到分辨，非均匀展宽得到重新聚焦，同时允许耦合调制的相干性演化。复杂的重叠峰形无法用高场的多重峰规则解释，只能通过考虑自旋系统的演化来理解。

使用一组已报告的耦合常数（方程S1–S9）对所有耦合的1H和19F自旋进行了密度矩阵模拟（36,37）。模拟中的峰位与实验光谱相匹配，验证了该方法的有效性（见图1c,d）。信号强度的不对称性可能是由于数字分辨率和脉冲激发效应造成的。3,5-二氟吡啶的两个主要峰的积分在实验中相差8%，而在模拟中则完全相同。其他强度差异部分是由于模拟未包括自旋弛豫和场不均匀性效应。

图2中的实验旨在将J耦合信息分散到第二个维度，从而减少峰的重叠。在t1周期增加后记录了多个回波（见图3）。相位循环后剩余的射频脉冲干扰通过数字方式被消除。t1期间的相干性演化在连续的一维光谱中可见。

图2：
(a) 在0.82 mT下测量的SABRE超极化3,5-二氟吡啶的未屏蔽信号。FT范围用洋红色边界标示。
(b) 带有标记的演化时间和第一个回波时间的屏蔽范围。
(c) 2D NMR实验中前16个t1增量的3,5-二氟吡啶的一维光谱。

2D NMR光谱是通过所有扫描的t1维度的FT得到的。19F拉莫频率附近的谱区（见图4和图S8）仅包含目标分子的信号，排除了溶剂或SABRE过程中产生的1H信号。3,5-二氟吡啶的谱在直轴上呈现四个对称排列的峰，间距为9.6 Hz，分别位于4.54和9.53 Hz（见图4a）；而3-氟吡啶的谱在直轴上呈现两列对称排列的峰，间距为2.6 Hz，分别位于1.81、5.89、7.45、8.55和接近0 Hz（见图4b）。间接维度上的零频率信号是由于对实值幅度谱进行FT处理所致。间接维度上的噪声是由于扫描间的信号波动造成的。

图4：
(a) 在0.82 mT下，使用SABRE超极化技术测量的5 mM 3,5-二氟吡啶的二维J-分辨光谱；
(b) 在0.82 mT下，使用SABRE超极化技术测量的5 mM 3-氟吡啶的二维光谱。
(c) 使用与实验参数匹配的参数模拟的3,5-二氟吡啶和3-氟吡啶的光谱。所有1H和19F自旋都进行了模拟。强度以对数刻度显示，直轴上最大信号上限为4 Hz，下限为e^-1。红色“V”形状表示耦合较弱的自旋系统。

产品算子计算可以说明弱耦合区域脉冲序列的行为（方程S10–S14）。相对于t1，可观测的同相相干性的正弦调制从选定的反相相干性演化而来。两个异核耦合自旋的信号在二维谱中会呈现出独特的“V”形状。图5中，由于不存在同核耦合，系统被归类为弱耦合，从而可以通过产品算子预测结果。V形状中2(J1 + J2)的斜率和零频率信号来源于对幅度值的FT处理，处理方式与实验数据相同。未计算幅度的光谱见图S6。

图5：
(a) 在0.82 mT下，三个自旋系统（I, S1, S2）的模拟光谱，其中JIS1 = 5 Hz，JS1S2 = 0；
(b) JIS2 = 0；
(c) JIS2 = 0.5；
(d) JIS2 = 1 Hz。显示了I自旋的信号。红色“V”形状由产品算子预测得出。

两种分子的信号模式都偏离了“V”形状（见图4）。在0.82 mT下，同核耦合使自旋系统进入强耦合区域，这超出了产品算子形式的范围。1H和19F自旋之间的多重耦合产生的模式无法通过解析方法轻易预测，它们作为每个分子的独特指纹。二维光谱是通过数值计算密度矩阵演化得到的（见图4b,d）。耦合常数是通过匹配模拟和实验光谱中的模式来确定的。从文献中的耦合常数开始，手动调整符号值以再现最强峰的位置和强度。模拟的二维光谱峰形强烈依赖于耦合常数的符号和数值（见图S10）。通过计算最强峰相对于J耦合值的位置导数来估计匹配值的误差（见图S11）。最终匹配的光谱值与起始值相差在0.25 Hz以内（误差值的1.5倍范围内），有两个例外：
1. 3,5-二氟吡啶的19F同核耦合常数J35被匹配为非零值4.76 Hz。尽管在化学上等效，但这两个19F自旋在磁场上不等效，因此允许它们形成标量J耦合，这在文献中的一维光谱中无法观察到。
2. 3,5-二氟吡啶的1H–1H J25、J26和J36耦合常数在文献中报告为零，但实际上对模拟光谱影响很小，可能是因为它们在19F自旋演化中起双重间接作用。

由于并非所有文献值都反映了耦合常数的符号，因此进行了高场NMR实验以独立获取这些信息（见图S14–S18）。在所有情况下，模拟结果与实验结果一致。如所示，密度矩阵模拟还可以间接确定化学等效自旋之间的耦合常数。

在许多情况下，预测强耦合自旋系统的行为需要模拟（38）。在这里，J-分辨频率维度使得分析更加容易。t1演化产生的峰位对耦合值非常敏感，可以用来估计耦合常数的误差范围，并与弱耦合情况（如“V”形状）进行比较。这种方法不同于其他低场下确定J耦合的方法，如SLIC和同步自旋回波（20,21），后者通过操纵能级反交叉来实现。

实验将标量耦合常数确定性地转换为复杂的模式，这种模式可以视为分子分析的NMR“哈希函数”。其他稳定单氟和二氟吡啶的模拟也得到了独特的指纹（见图S19）。2-氟吡啶在零频率下呈现垂直模式；2,3-和2,6-二氟吡啶在不同位置呈现两个水平对称的主峰；2,5-二氟吡啶在间接轴上呈现四个类似矩阵的峰，频率约为6 Hz。

含有其他NMR活性同位素（如31P、13C或15N）的分子也适合进行模式匹配。在低场下，只需改变射频脉冲的频率即可激发任何自旋，无需修改仪器（40）。这些方法通过模拟易于超极化的代谢物丙酮酸和乳酸来说明（41,42）。1-和2-13C标记形式的分子可以通过其独特的指纹进行识别（见图S20）。一项采用较低J分辨率的模拟研究表明，这些模式可能在不到一分钟的时间内被测量出来（见图S21）。通过哈达玛德光谱技术（Hadamard spectroscopy），可以进一步提高含有多种类型核的混合物的指纹识别效率。（43）利用训练有素的人工神经网络，可以加速密度矩阵模拟的计算过程。（44）使用特斯拉级别的永磁体，可以通过台式核磁共振（NMR）设备以高灵敏度检测氟吡啶类化合物。（45,46）相比之下，毫特斯拉级别的磁场仅由电磁铁产生（见图S1），这种设备有望被开发成一种价格低廉且便于携带的仪器。该技术在工业过程控制、安全领域、生物医学识别等多个方面都有应用潜力。该方法在具备关于预期分子类型的部分先验知识的情况下效果最佳，这些信息可以存储在模式数据库中。仲氢（parahydrogen）适用于远程应用，因为可以通过冷却氢气来廉价制备并长期储存。一个限制因素是SABRE极化的非均匀性，这需要一个专门的极化催化剂结合位点。在某些情况下，选择性极化能够简化观察到的光谱模式；而在其他情况下，可以通过接力方法或异核极化转移（heteronuclear polarization transfer）来诱导目标分子及其自旋的超极化现象。（47,48）总之，通过J分辨率的二维核磁共振实验和SABRE信号增强技术，研究人员比较了3-氟吡啶与3,5-二氟吡啶的耦合常数，并发现其结果与已报道的实验值一致。观察到的光谱和密度矩阵模拟结果均显示出对J耦合常数符号和数值敏感的独特模式。借助这种光谱指纹技术，可以利用低成本、低场强条件的核磁共振设备来确定已知分子的存在，甚至可能推断出未知分子的结构。