首次在葡萄藤中发现并鉴定出基于 brassinosteroid（油菜素内酯）的矮化突变体

《Theoretical and Applied Genetics》：First brassinosteroid-based dwarf mutant discovered and characterized in grapevine

　　摘要
在本研究中，我们调查了天然存在的葡萄矮化突变系中矮化的遗传控制机制。通过性状分离和标记-性状关联分析，我们确定了14号染色体上一个与矮化性状紧密相关的主基因位点。随后，我们进行了批量RNA测序分析，精确定位了矮化性状，并鉴定出VviBR6OX1基因——这是一种参与油菜素合成的细胞色素P450酶，作为观察到的矮化的候选基因。RNA测序序列分析显示该基因存在两个框内缺失：外显子1中的12个碱基对缺失和外显子4中的9个碱基对缺失。对Vitis种质资源的调查表明，9个碱基对的缺失很可能是导致该突变体矮化的原因。我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了VviBR6OX1基因，成功重现了类似的矮化葡萄植株，并证实了该基因在控制葡萄植株结构中的作用。此外，我们还观察到一些具有极端紧凑矮化表型的植株，发现这种紧凑的矮化表型是由于同时编辑了第二个BR6OX基因VviBR6OX2所致。在葡萄中发现与BR相关的矮化现象为开发具有理想植株结构的新型葡萄品种提供了重要的遗传途径。

引言
矮化是一种备受重视的农艺性状，它有助于提高多种田间作物的种植密度、抗倒伏能力和产量。同样，对于木本植物而言，矮化也有助于控制植株结构、大小和生产力。控制矮化的遗传因素多种多样。赤霉素（GA）和油菜素（BR）是两种主要的植物激素，它们作为植物发育的主要调节因子，通过影响细胞扩展、伸长和定向来控制植物高度。GA或BR的生物合成或信号通路发生紊乱会导致植物生长受阻并出现矮化现象（Tong等人，2014年）。20世纪60年代的第一次绿色革命利用了天然存在的水稻和小麦矮化突变体，这些突变体在GA生物合成或信号通路方面存在缺陷（Monna，2002年；Peng等人，1999年；Spielmeyer等人，2002年）。由于BR在植物结构、果实品质以及生物和非生物胁迫耐受性方面的多重作用，它们已成为第二次绿色革命的重点研究对象（Yang等人，2024a年）。已在包括拟南芥、水稻、玉米、小麦、大麦、番茄和豌豆等多种物种中鉴定出许多BR突变体（Alonso等人，2024年），其中大多数突变体是通过大规模诱变技术获得的。也发现了一些天然存在的等位基因（Gruszka等人，2016年；Tian等人，2019年），其中一些等位基因在提高种植密度、果实品质和产量方面显示出巨大潜力（Sakamoto等人，2006年；Tian等人，2019年）。BR还在许多园艺作物中发挥着关键作用，控制着许多经济上重要的性状（Li等人，2025年）。对于葡萄等木本果树来说，矮化可能是一个重要的性状。葡萄生产是一个复杂且具有挑战性的过程，需要仔细管理栽培和环境因素，这些因素往往需要人工干预。通过选择性育种可以减少或消除这些因素，从而使葡萄品种更易于机械化操作。减小植株整体大小是开发此类葡萄品种的关键步骤，而利用矮化现象可以实现这一目标。

此前曾报道过一种矮化突变葡萄植株。这种矮化突变体来源于葡萄品种Vitis vinifera Pinot Meunier的L1分生组织中的体细胞变异（Boss & Thomas，2002年）。矮化是由一个点突变引起的，该突变导致DELLA结构域中的第38位氨基酸从组氨酸替换为亮氨酸。VviGAI1（GIBBERELLIN INSENSITIVE 1）基因中的这一突变是小麦中Rht-D1/Rht-B1基因的同源物。这些基因的突变导致了矮化现象，这也是小麦绿色革命的遗传基础（Boss & Thomas，2002年；Franks等人，2002年；Peng等人，1999年）。除了节间缩短外，Vvigai1突变体植株的许多卷须还发育成了花序。然而，先前描述的葡萄VvGAI1突变体即使在杂合状态下也表现出极端的矮化表型（Boss & Thomas，2002年），因此其作为葡萄品种的商业应用受到限制。在许多其他物种中也发现了涉及不同GAI样基因域的突变体。我们在拟南芥中过表达了小麦、大麦、玉米、芸苔属植物、葡萄和拟南芥中已报道的十几种GAI突变体等位基因。研究中的大多数突变体都表现出节间长度和植株高度的显著减小，正如预期的那样，矮化的程度因具体突变体而异（Zhong & Yang，2012年）。也有报道尝试利用GAI等位基因的变异来改善植物结构（Chandler & Harding，2013年）。

在本研究中，我们报道了一种新的矮化突变葡萄植株的发现和特征描述。这种矮化植株来源于康奈尔大学葡萄育种与遗传学项目的杂交实验，其矮化特性与基于VviGAI1的矮化突变体有很大不同。基于遗传分离分析，我们确定该突变体的矮化是由14号染色体上的一个主基因位点控制的。通过标记-性状关联和批量RNA测序数据分析，我们得出结论：矮化可能是由于BR生物合成基因VviBR6OX1中的9个碱基对框内缺失所致。我们进一步通过CRISPR/Cas9基因敲除技术成功重现了类似的矮化植株表型，从而证实了该基因的作用。此外，我们还发现了另一个VviBR6OX2基因，其功能紊乱与VviBR6OX1的紊乱共同加剧了矮化现象。本研究中发现并阐明了基于BR的矮化突变体的遗传控制机制，为开发具有改良植株结构和其他BR相关性状的新葡萄品种提供了重要的遗传资源和知识基础，以满足各种育种需求，包括提高种植密度和减少葡萄园管理所需的劳动力。

结果
来自康奈尔大学葡萄育种杂交实验的矮化突变植株后代分离分析
在康奈尔大学葡萄育种与遗传学项目的PI 200569（Yugoslav 5–24）后代中，我们发现了具有小而深绿色叶片、短叶柄和短节间的矮化突变葡萄植株。初步观察表明，这种突变表型由一个隐性基因位点控制。为了验证这一假设并提供更多用于研究该突变性状遗传控制的遗传材料，我们收集了PI 200569自交种子的种子并进行了分离实验。在温室中用10厘米小盆种植的自交种子中，首批70株幼苗中有14株表现出深绿色叶片和矮化的植株高度。卡方（X2）拟合度检验确认矮化个体与正常个体的分离符合3:1的孟德尔比率（X2 = 0.33）。这一结果验证了之前的观察结果，表明矮化可能由一个基因位点控制。在随后田间种植的第二批700株幼苗中，有141株为矮化植株。这一分离比率与第一批幼苗的结果一致，进一步证实矮化是一种由单个基因位点控制的隐性性状。当这些植株长到七个月大时，我们对20株正常植株和20株矮化植株进行了叶脉长度（以下简称叶大小）、叶柄长度和节间长度的表型测定。正常植株和矮化植株在这三个性状上存在显著差异（P值<0.01）。与正常植株相比，矮化植株的叶大小显著较小（约为正常植株的64%），节间长度较短（约56%），叶柄长度也较短（约20%），卷须发育不全（图1）。

图1
（该图像的替代文本可能是使用AI生成的。）
自交PI 200569获得的代表性葡萄植株表型。(a) 一株正常植株（N1）和一株矮化突变植株（D122）在田间的情况。(b) 代表性叶片。(c) N1和D122的卷须。a、b和c中的条形图比例尺为10厘米。(d) 正常植株和矮化植株的叶脉长度、叶柄长度和节间长度的测量结果。分别从每株植株上剪取了一到两个枝条，从第6节到第12节测量叶脉长度、叶柄长度和节间长度。叶脉长度是从叶片尖端到叶片基部测量的，如(b)图中的橙色线条所示。对每个枝条的测量结果进行了平均处理，然后使用平均值计算平均值和标准差。正常植株和矮化植株分别测量了38个和36个枝条。“**”表示t检验中两组之间的P值<0.01。

确定VviBR6OX1为矮化表型的候选基因
对PI 200569首批70株自交后代的基因组进行测序，构建了用于定位矮化基因位点的基因分型文库（GBS）。使用V. vinifera基因组PN40024 v2作为SNP鉴定的参考（Canaguier等人，2017年）。共鉴定出8,355个有信息量的标记，曼哈顿图分析显示矮化突变性状与14号染色体上的GBS标记有强烈关联（图2a）。与矮化突变性状最相关的前5个标记覆盖了约497 kb的区域（S14_23160943至S14_23658381），其中S14_23425563标记的关联最为显著（图2b）。

图2
（该图像的替代文本可能是使用AI生成的。）
GBS标记与矮化突变表型的关联。a. 显示14号染色体上显著标记-突变性状关联的曼哈顿图（虚线P<5×10^-8）。b. 与矮化突变性状最相关的前5个标记的关联统计信息。

为了进一步精确定位候选区间，我们研究了在温室中生长的首批70株自交后代的RNA测序表达谱。根据植株高度的视觉评估，将这些70株幼苗分为三组：14株矮化植株标记为D1–D14，24株中等高度植株标记为M15–M38，32株高株植株标记为T39–T70。我们从每组矮化、中等高度和高株植株中各收集了三个茎尖样本和两份叶片样本。每个样本包含三株独立的植株，共构建了15个RNA测序文库（9个来自茎尖，6个来自叶片样本）（表S1）。我们将RNA测序读段与葡萄参考基因组PN40024 v2对齐，并在14号染色体上发现了许多矮化植株和高株植株之间的RNA测序SNP，包括上述假定的矮化基因位点所在区域（S14_23160943至S14_23658381）（表S2）。我们在S14_23419894和S14_23557098位置鉴定出两个RNA测序SNP标记，这两个标记覆盖了约137 kb的区域。该区域包含之前提到的与矮化突变性状最相关的GBS标记S14_23425563。尽管这两种RNA-seq标记在区分矮化品种和中高品种的块茎样本时没有诊断价值，但许多被S14_23419894和S14_23557098基因侧翼的RNA-seq SNP标记却具有诊断作用，这一点从以下事实可以证明：所有矮化品种的块茎样本中都存在相同的诊断标记等位基因，而中高品种的块茎样本中则存在另一种等位基因或两种等位基因（表S2）。在137-Kb区域内有9个基因被注释（表1）。其中，VIT_214s0083g01110基因编码一种细胞色素P450酶，该酶与拟南芥、水稻和其他植物中的油菜素-6-氧化酶具有高度相似性（图S1）。由于油菜素-6-氧化酶在调节多种植物发育中的重要作用，VIT_214s0083g01110成为观察到的矮化突变表型的明显候选基因。事实上，先前的研究表明，当VIT_214s0083g01110（在此使用葡萄基因命名系统称为VviBR6OX1（Grimplet等人，2014年））被转基因过表达时，可以挽救番茄突变体（dx/dx）的极端矮化表型（Symons等人，2006年），这进一步表明VIT_214s0083g01110（VviBR6OX1）可能是本研究中观察到的矮化的潜在遗传原因。

为了研究VviBR6OX1如何导致矮化表型，我们进行了RNA-seq分析，结果发现VIT_214s0083g01110（油菜素-6-氧化酶）是137-kb区域内唯一的差异表达基因（DEG），在矮化品种和高品种的块茎组织中其表达量增加了两倍以上（表1）。我们进一步将VviBR6OX1的RNA-seq读段与参考基因组对齐，发现了两个插入缺失（indels）：第一个插入缺失位于开放阅读框（ORF）或外显子1的起始处，为12个碱基对的缺失（“ATGGCTGTTTTC”对比“ATGGCGGTTTTT”）；第二个插入缺失位于外显子4，导致4个氨基酸“AVKY”被替换为“D”（图3a和4a）。所有矮化品种的葡萄藤中的读段都包含这两个缺失，而中高品种的葡萄藤中则同时存在野生型和缺失型读段。相反，在高品种的葡萄藤中主要检测到野生型读段。

为了探究VviBR6OX1如何导致矮化表型，我们进行了RNA-seq分析，发现VIT_214s0083g01110是137-kb区域内唯一一个在矮化品种和高品种样本之间表达量增加超过两倍的DEG（表1）。我们进一步通过将VviBR6OX1的RNA-seq读段与参考基因组对齐，发现了两个插入缺失：第一个缺失是开放阅读框起始处的12个碱基对缺失；第二个缺失是外显子4中的9个碱基对缺失，导致4个氨基酸被替换。所有矮化品种的葡萄藤中的读段都包含这两个缺失，而中高品种的葡萄藤中则同时存在野生型和缺失型读段。在高品种的葡萄藤中主要检测到野生型读段。

为了研究VviBR6OX1如何导致矮化表型，我们进行了RNA-seq分析，结果发现VIT_214s0083g01110（油菜素-6-氧化酶）是137-kb区域内唯一的差异表达基因（DEG），在矮化品种和高品种的块茎组织中其表达量增加了两倍以上（表1）。我们进一步将VviBR6OX1的RNA-seq读段与参考基因组对齐，发现了两个插入缺失：第一个缺失位于开放阅读框起始处的12个碱基对缺失；第二个缺失位于外显子4中的9个碱基对缺失，导致4个氨基酸被替换。所有矮化品种的葡萄藤中的读段都包含这两个缺失，而中高品种的葡萄藤中则同时存在野生型和缺失型读段。在高品种的葡萄藤中主要检测到野生型读段。

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表2 本研究中描述的转基因葡萄藤及其表型和编辑谱型

VviBR6OX2基因的编辑谱型在不同类型的矮化葡萄藤之间存在显著差异。7株紧凑型矮化葡萄藤以及BR18和BR51的紧凑型矮化枝条（即BR18C和BR51C）的编辑比例均达到95.5%或以上（见表2）。其中6株只有2个变异体，另外3株有3-5个编辑变异体，其中前两个变异体占总映射读数的70%以上。相比之下，20株轻度矮化葡萄藤以及BR18和BR51的轻度矮化枝条（即BR18M和BR51M）有5个或更多主要编辑变异体，其中7株有10个或更多。在这些葡萄藤中，前两个编辑变异体所占的VviBR6OX2编辑比例约为总映射读数的20-30%，尽管也存在少数例外。这与紧凑型矮化葡萄藤的情况形成鲜明对比，后者大多数只有2个主要VviBR6OX2编辑变异体，但超过70%的编辑变化是由这些变异体引起的。

我们比较了同时存在于BR18和BR51中的紧凑型矮化和轻度矮化枝条的编辑谱型（见表2和表S7）。在BR18和BR51中，所有扩增子测序样本显示VviBR6OX1和VviBR6OX2的编辑比例均接近100%，无论DNA样本来自紧凑型还是轻度矮化枝条。紧凑型和轻度矮化枝条都有一个或两个主要VviBR6OX1编辑变异体。然而，BR18和BR51中的轻度矮化枝条包含的VviBR6OX2编辑变异体更多。具体来说，BR18C只有2个VviBR6OX2编辑变异体，而BR18M有6个；BR51C有2或3个，BR51M有7到8个（见表S7）。此外，我们发现了两组具有相同VviBR6OX1编辑谱型但VviBR6OX2编辑谱型不同且表型不同的葡萄藤（见表2和表S7）。一组包括3株葡萄藤：BR2、BR4和BR6，它们都只有一个主要VviBR6OX1编辑变异体，表现为“A”插入。紧凑型矮化葡萄藤BR2只有2个VviBR6OX2变异体，而两个轻度矮化葡萄藤BR4和BR6有多个VviBR6OX2编辑变异体（BR4有6个，BR6有10-16个）。另一组包括5株葡萄藤：BR10、BR13、BR25、BR30和BR46，它们的VviBR6OX1编辑谱型相同，表现为“G”缺失。该组中的紧凑型矮化葡萄藤BR30只有2个VviBR6OX2变异体，而四个轻度矮化葡萄藤则有3到15个VviBR6OX2变异体。这些观察结果一致表明，当VviBR6OX2编辑变异体作为显性等位基因存在时，会加剧矮化表型的严重程度，并且是本研究中观察到的紧凑型矮化表型的原因。

在16株外观正常的葡萄藤/枝条中，有9株的VviBR6OX1和VviBR6OX2编辑比例均低于1%（见表2）。6株葡萄藤的VviBR6OX1编辑比例在1%到13.2%之间，VviBR6OX2编辑比例在0%到3.3%之间。然而，BR53N（指BR53的一株外观正常的枝条）的VviBR6OX1和VviBR6OX2编辑比例均接近100%（见表2、表S7和图S5）。进一步分析BR53N的编辑谱型发现了一个有趣的VviBR6OX1变异体，即“A”被替换为“T”，导致第83位氨基酸位置的错义突变（GAT变为GTT），并且天冬氨酸被缬氨酸取代。这个错义突变占总VviBR6OX1映射读数的30.39%（见表2和表S7）。显然，尽管这个错义突变仅占总VviBR6OX1读数的30.39%，但它仍能基本维持VviBR6OX1的功能，支持葡萄藤的正常发育。值得注意的是，尽管BR53N中的VviBR6OX2被100%编辑，但葡萄藤仍能正常发育，这表明VviBR6OX2并非决定矮化的主导因素。

在PI 500269自交后代和Vitis种质资源中VviBR6OX基因的表达模式和插入/缺失变异体

先前的研究表明，除了未成熟种子和绿色果实（VviBR6OX1）或未成熟和成熟种子（VviBR6OX2）外，大多数组织中VviBR6OX基因的表达几乎检测不到（Parada等人，2022年）。我们研究了PI 500269自交后代的矮化、中等和高大葡萄藤/幼苗的枝条和叶片中VviBR6OX1和VviBR6OX2的RNA-seq表达谱型（见表S1）。VviBR6OX1在枝条和叶片中都有表达，其在叶片中的表达水平高于枝条，尤其是在矮化葡萄藤中（见图S6）。如前文所述，矮化葡萄藤的VviBR6OX1表达水平高于中等和高大葡萄藤（见表1）。9-bp的框内缺失可能破坏了VviBR6OX1的功能，从而导致BR合成途径相关基因（包括VviBR6OX1）的上调。这与已建立的BR生物合成基因的反馈调节机制一致（He等人，2005年；Tanaka等人，2005年）。我们分析了来自其他项目的一些内部RNA-seq数据，发现VviBR6OX1在来自不同Vitis物种和基因型的叶片、枝条、根部和发育中的果实中也有表达。从基于微阵列的基因组转录组图谱中可以看出，几乎所有葡萄组织（包括果实、叶片、枝条和卷须）中VviBR6OX1的表达水平都高于VviBR6OX2（见表S8）（Fasoli等人，2012年；M. Wang等人，2014年）。相比之下，在28个胚胎发生性愈伤组织的RNA-seq文库中，VviBR6OX2的表达水平非常高，与枝条和叶片中的VviBR6OX1相当，而同一愈伤组织中的VviBR6OX1表达水平非常低。

为了检测在PI 200569中观察到的VviBR6OX1插入/缺失是否存在于其他葡萄藤中，我们将VviBR6OX1基因序列与NCBI上的葡萄藤基因组数据库进行了比对（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）。我们发现一些测序的葡萄藤基因组（如“Tannat”）在N端具有相同的12-bp缺失（Da Silva等人，2013年），这与PI 200569中的缺失一致。我们进一步检查了葡萄基因组网站（https://www.grapegenomics.com/）上列出的21个V. vinifera基因组中是否存在12-bp和9-bp的插入/缺失。超过一半的这些V. vinifera基因组至少包含一个具有相同12-bp缺失的VviBR6OX1等位基因，包括“Riesling”、“Zinfandel”、“Chardonnay”和“Pinot noir”（见表S9）。此外，我们分析了NCBI上可用的数百个葡萄基因组序列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/），发现390个样本中有82个包含相同的缺失。然而，在我们分析的任何基因组中均未观察到本研究中报告的第二个9-bp框内缺失。

12-bp的框内缺失会去除N端的四个氨基酸，但似乎对VviBR6OX1的功能并不关键。例如，“Malbec”品种的两个VviBR6OX1等位基因都包含12-bp缺失（见表S9），但它并不表现出矮化性状。我们还调查了几个野生Vitis物种中的VviBR6OX1插入/缺失，这些物种的基因组可在葡萄基因组网站上找到（https://www.grapegenomics.com/）。在这些野生物种中，没有发现12-bp缺失（见表S9）。此外，在四个Vitis vinifera ssp. Sylvestris的测序基因组中也没有发现12-bp缺失，后者是栽培V. vinifera的雌雄异株野生祖先。这些数据表明，12-bp缺失是栽培V. vinifera样本的独特特征。除了VviBR6OX1 ORF起始处的广泛12-bp缺失外，我们还在一些品种的VviBR6OX1编码区域发现了其他插入/缺失（见表S9）。例如，“Chardonnay”中的一个VviBR6OX1拷贝在外显子3中有2-bp插入，而“Merlot”中的一个VviBR6OX1拷贝在外显子1中有2-bp缺失，在外显子4中有1-bp缺失（见表S9）。预计在它们的自交后代中可能会发现一些矮化葡萄藤。

材料与方法

PI 200569及其自交后代群体

PI200569（Yugoslav 5–24）作为亲本系在康奈尔大学葡萄育种计划中保存，并作为遗传资源保存在位于纽约日内瓦的美国农业部农业研究服务葡萄种质资源库中。2015年和2019年收集了PI200569的自交种子。这些种子在2016年发芽并在温室中培育成幼苗。2016年的幼苗在长到大约10片叶子时被分类为矮化、中等和高大型。2019年的自交种子在2020年2月发芽，并于春季移植到纽约日内瓦的McCarthy苗圃。2020年9月对这些田间葡萄藤进行了节间长度、叶柄长度和叶脉长度（称为叶大小）的表型分析。每组（矮化和正常）选择了20株植物进行评估。从每株葡萄藤上收集一到两个枝条，测量第6到第12个节段的长度。将每个枝条的测量值平均后，用于计算平均值、标准差并进行t检验。正常葡萄藤共测量了38个枝条，矮化突变体共测量了36个枝条。这20株正常葡萄藤还使用引物组1507F/M1475R进行了矮化VviBR6OX1等位基因的存在与否的基因分型（见图S3和表S4）。

GBS文库、RNA-seq文库和数据分析

从单个葡萄藤中收集叶片组织，使用Qiagen DNeasy Plant Kit提取基因组DNA。使用甲基化敏感的限制酶ApeKI（NEB）和样品特异性条形码接头构建了基因分型-by-测序（GBS）文库（Elshire等人，2011年）。文库在康奈尔生物技术资源中心（BRC）进行合并和测序。原始读数通过条形码进行解复用和质量过滤，然后合并为唯一的序列标签。标签与Vitis vinifera参考基因组PN40024 v2对齐，使用基于参考的TASSEL-GBS流程调用SNP基因型（Glaubitz等人，2014年）。SNP经过过滤，移除了缺失率高的位点和次要等位基因频率低的位点，并在关联测试前排除了数据缺失过多的个体。

对于RNA-seq，相同的70株幼苗根据植株高度被分为矮化、中等和高大三类。从枝条顶端（每类三个样本）和叶片（每类两个样本）中收集大量样本（总共15个RNA-seq文库：9个枝条顶端样本和6个叶片样本；见表S1）。使用Plant Spectrum RNA Kit（Sigma）提取总RNA。文库的制备遵循我们之前的协议（Yang等人，2015年），并在康奈尔BRC进行单端1×100 bp的测序。RNA-seq读数经过质量过滤并对齐到PN40024 v2，使用STAR（Dobin等人，2013年）进行比对。使用featureCounts（Liao等人，2014年）生成基因水平的计数。使用DESeq2（Love等人，2014年）检测矮化和非矮化组之间的差异表达。基因的差异表达基于FDR调整后的p值阈值padj < 0.01（主要；还评估了padj < 0.05），以及最小倍数变化阈值≥1.5×（|log2FC|≥log2(1.5) ≈ 0.585）。通过比较矮化和非矮化植株群体之间的等位基因状态，从RNA-seq比对中鉴定出了SNP标记，重点关注第14号染色体，包括由GBS关联信号支持的候选区间（S14_23160943–S14_23658381；表S2）。通过视觉检查Qiagen CLC Genomics Workbench中的读取比对，分析了优先级基因中的候选插入/缺失/变异（例如VviBR6OX1）。在TASSEL v5.0中使用混合线性模型（MLM）框架（Bradbury等人，2007年）进行了标记-性状关联分析，其中标记基因型作为固定效应。使用前五个主成分（PCs）对种群结构进行建模，并在MLM框架中使用亲缘关系项来解释相关性；TASSEL中的高效MLM实现（包括压缩的MLM/P3D概念）被广泛用于全基因组扫描（Zhang等人，2010年）。根据每个标记计算关联p值，并使用–log10(p)在基因组位置上可视化（图2a），并按p值对关联最强的位点进行排名和总结（图2b）。

### 引物设计与基因组PCR
引物W1474R用于特异性扩增野生型VviBR6OX1基因，而引物M1475R用于特异性扩增具有9 bp缺失的突变型VviBR6OX1等位基因（图4和表S4）。预期1507F/W1474R或1507F/M1475R扩增子的大小为961 bp。对于基因组PCR，使用5 ng的基因组DNA在20 μl的反应体系中与GoTaq DNA聚合酶（Promega）进行反应。PCR条件如下：初始变性95°C 3分钟，随后是35个循环，每个循环包括95°C 30秒、58°C 30秒和72°C 60秒，最后在72°C下延伸5分钟。取5 μl的PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行检测。

### 编辑构建
选择了两个VviBR6OX1的Cas9靶点（图4）。这两个靶序列由tRNA序列分隔，由GenScript合成并克隆到受拟南芥U3启动子（141B-BRO）控制的入口载体（YPQ141B）中。通过gateway克隆使用pMDC32目的载体YPQ167与Cas9和141B-BRO组装成二元载体（pBROGE）（Lowder等人，2015年）。

### 转基因葡萄藤的转化和表型特征分析
使用携带pBROGE构建物的农杆菌菌株EHA105，按照我们之前的协议（Yang等人，2024b）转化V. vinifera cv Scarlet Royal的胚胎发生愈伤组织。本研究产生了超过60株转基因葡萄藤。选择了六株外观正常的植株（Normal）、八株轻度矮化植株（mild dwarf）和六株紧凑型矮化植株（compact dwarf）（在胚胎诱导后约8.5个月），其表型分析方法与田间生长的葡萄藤相似。对每根枝条的测量值进行平均处理，然后用平均值计算均值和标准差。使用T检验统计确定平均差异。

### 扩增子文库构建、测序和数据分析
设计了引物以覆盖VviBR6OX1的两个靶点（图4和表S4）。为了评估转基因愈伤组织中VviBR6OX1基因的编辑效率，从七个耐潮霉素的转基因愈伤组织池中提取基因组DNA。使用引物1505/1506构建T1的扩增子文库，使用引物1507/1508构建T2的扩增子文库，遵循我们之前的协议（Yang等人，2024b）。这些DNA样本后来还使用引物集（1749/1750）评估了VviBR6OX2的编辑效率。扩增子数据使用Cas-Analyzer进行分析，参数设置为比较范围50 bp、最小频率>1以及WT标记5 bp（http://www.rgenome.net/cas-analyzer/）（Park等人，2017年）。

为了评估不同转基因葡萄藤中VviBR6OX1和VviBR6OX2的编辑效率，使用与愈伤组织基因组DNA相同的协议从提取的叶片基因组DNA样本构建扩增子文库，或者直接使用叶片组织进行第一轮PCR。对于第二种方法，我们使用了PHIRE Plant Direct PCR试剂盒（www.Thermofisher.com）。从每株植物的幼叶中收集一小块叶片组织，切碎并重新悬浮在30 μl的稀释缓冲液中。使用半微升的重新悬浮液进行20 μl的PCR反应，其中包含10 μl的PCR混合液、0.5 μl的重新悬浮的叶片组织、0.1 μl的100 μM正向引物、0.1 μl的100 μM反向引物和9.3 μl的H?O。PCR条件如下：98°C 5分钟，随后是38个循环，每个循环包括98°C 5秒、62°C 5秒、72°C 20秒，最后在72°C下延伸1分钟。PCR产物（5 μl）在1%琼脂糖凝胶上进行检测。剩余的PCR产物使用1.2体积的Ampure beads（Beckman）纯化，然后用20 μl的水洗脱。第二轮PCR的条形码化方法与第一种方法相同。

### 讨论
#### 葡萄藤矮化突变体的表型表现和遗传控制
在这里，我们报告了在康奈尔大学葡萄育种计划中的育种杂交中发现的第一个与BR相关的矮化突变体葡萄藤。通过关联映射、RNA-seq分析和种质调查，我们确定VviBR6OX1（一种 brassinosteroid (BR) 合成基因）中的9 bp缺失导致了观察到的矮化现象。本研究发现，BR的矮化效应在不同性状上有所不同，表现为叶柄长度显著缩短，而节间长度和叶大小的变化相对较轻。

与之前发现的由VviGAI1基因DELLA结构域点突变引起的矮化突变体葡萄藤（Boss & Thomas 2002）相比，本研究中报道的矮化突变体葡萄藤的矮化特征不那么明显。GAI1突变体即使在杂合状态下也表现出极端的矮化表型。相比之下，当突变的VviBR6OX1处于杂合状态时，BR突变体并未表现出明显的矮化现象（图S3）。当突变的VviBR6OX1处于纯合状态时，矮化效应变得更加明显（图1a），但仍然比杂合的VviGAI1突变体（图S7a）要轻得多。遗传背景并不是造成这种显著差异的主要因素，因为当突变的VviGAI1引入不同品种时也观察到了类似的严重矮化特征（Arro等人，2024年）。除了总体矮化特征（如节间长度缩短和深绿色叶片）外，VviGAI1突变体葡萄藤还表现出卷须转化为花序的现象（Boss & Thomas 2002）。然而，在具有相同Vvigai1突变拷贝的转基因葡萄藤（Arro等人，2019年）以及拟南芥或VviBR6OX1突变体中并未观察到这一特征。此外，携带VviGAI1 DELLA点突变的种子通常需要特殊的GA3处理才能发芽（Boss & Thomas 2002）。在某些情况下，GA?处理无效，需要通过胚胎 rescue来获得幼苗（Chatbanyong & Torregrosa 2015）。纯合的BR突变体矮化葡萄藤表现出卷须发育不良和生育力降低，但仍然能够产生可育种子。尽管本研究发现自交的PI 500269种子中有约20%为纯合矮化葡萄藤，低于预期的25%，但突变VviBR6OX1对种子发芽的影响尚未得到充分研究。虽然赤霉素（GA）和brassinosteroids (BR) 在控制种子发芽中都起积极作用，并且有报道BR和GA在共同调节水稻种子发芽中可能存在相互作用（Xiong等人，2021），但在葡萄藤中，BR相对于GA可能在种子发芽中起次要作用。VviBR6OX1突变体种子中种子发芽受到的影响较小，也可能是因为存在活性较高的VviBR6OX2，已知其在未成熟和成熟种子中都有表达（Parada等人，2022），这可能对种子发芽有一定作用。

#### VviBR6OX1和VviBR6OX2在导致矮化中的作用
VviBR6OX属于CYP85A家族的细胞色素P450单加氧酶。像许多其他细胞色素P450一样，CYP85A家族在同一物种中通常有多个同源基因（Kim等人，2005；Nomura等人，2005）。例如，拟南芥基因组包含两个CYP85A基因。Cyp85A1的突变导致轻度矮化表型，而Cyp85A2的突变导致更明显的矮化、叶片颜色更深绿和生育力降低。然而，双重突变体（cyp85a1cyp85a2）表现出严重的brassinosteroid (BR) 缺乏，极度矮化（Castle等人，2005；Kim等人，2005；Nomura等人，2005）。除了VviBR6OX1外，之前还在BR相关基因的表达研究中发现了另一个BR6OX基因VviBR6OX2（Parada等人，2022）。当我们设计两种gRNA来编辑VviBR6OX1以确认其在葡萄藤矮化中的作用时，无意中忽略了VviBR6OX2。结果发现，针对构建物中T1位点的gRNA对两个VviBR6OX基因都不起作用，但针对T2位点的gRNA对两者都非常有效。这种意外的VviBR6OX2编辑为我们提供了研究这两个BR6OX基因在葡萄藤矮化中作用的机会。

在转基因编辑的葡萄藤中发现了两种不同类型的矮化葡萄藤。一种为轻度矮化，另一种为非常紧凑型（图5和表2）。所有轻度矮化和紧凑型矮化葡萄藤的VviBR6OX1都在T2靶点被编辑。然而，所有紧凑型矮化葡萄藤的VviBR6OX两个基因在T2位点几乎都被100%编辑。这表明，当VviBR6OX1也被完全敲除时，敲除VviBR6OX2是导致葡萄藤呈现紧凑型矮化表型的关键因素。一个有趣的发现是，超过一半的轻度矮化葡萄藤的两个VviBR6OX基因也几乎都被100%编辑（表2）。进一步审查这些葡萄藤的编辑谱型发现，轻度矮化葡萄藤和紧凑型矮化葡萄藤在主要编辑的VviBR6OX2变体数量上存在差异。几乎100%编辑VviBR6OX2的轻度矮化葡萄藤包含多个VviBR6OX2的编辑变体，每个变体的总映射读数百分比相对较低，而大多数紧凑型矮化葡萄藤只显示两个主要编辑变体，且总映射读数的百分比较高（表2和表S7）。我们假设早期敲除VviBR6OX2会加剧VviBR6OX1敲除葡萄藤的矮化程度。当VviBR6OX2在葡萄藤早期发育阶段被编辑和破坏时，几乎所有细胞都会携带少数显性的、相似的编辑等位基因。由于两个VviBR6OX基因都被破坏，这些细胞将几乎没有或完全没有BR活性，从而导致紧凑型矮化表型。另一方面，如果在葡萄藤早期发育阶段VviBR6OX2没有在大多数细胞中双等位基因编辑，那么未编辑VviBR6OX2的细胞可能仍能提供一些BR功能。一旦葡萄藤度过关键发育阶段（如节间伸长开始），即使编辑了额外的VviBR6OX2等位基因，也可能观察不到矮化效果的增强。显然，这一假设需要进一步验证。

#### BR53N是一个独特的案例，提供了关于VviBR6OX1和VviBR6OX2如何共同导致矮化的一些重要见解
BR53N的枝条看起来正常，但其VviBR6OX1和VviBR6OX2都被完全编辑（表2和表S7）。仔细检查编辑谱型后，我们发现第二常见的VviBR6OX1编辑是一种错义编辑，导致天冬氨酸被缬氨酸替换。尽管这种错义编辑等位基因仅占所有编辑VviBR6OX1读数的30.39%，但它仍然能够在很大程度上支持葡萄藤的正常发育。非常有趣的是，在衍生出BR53N的原始年轻葡萄藤BRO53中，约17.65%的VviBR6OX1发生了错义突变。然而，原始的BRO53葡萄藤表现为轻度矮化（表S7）。显然，错义编辑等位基因需要达到一定的剂量阈值才能完全补偿正常VviBR6OX1等位基因的功能。另一个重要发现是，尽管VviBR6OX2在葡萄藤中被完全编辑，但葡萄藤并未表现出任何明显的矮化特征（图S5），这表明VviBR6OX2不是导致葡萄藤矮化的决定性因素，尽管它可以增强VviBR6OX1的矮化效应。在拟南芥中也有类似的发现，两个冗余的BR基因中的一个起主导作用（CYP85A1和CYP85A2），其中一个CYP85A基因的突变导致轻度矮化表型，而另一个CYP85A基因的突变没有生长缺陷；只有双重突变体表现出严重矮化（Nomura等人，2005）。与拟南芥不同，在黄瓜、水稻和玉米等物种中，这些物种只有一个BR6OX基因或一个高表达的基因，相应基因的单一突变可能会导致严重的生长缺陷和不育（Gruszka等人2016年；Hong等人2002年；Makarevitch等人2012年；Wang等人2017年）。VviBR6OX1和VviBR6OX2在改善葡萄植株结构方面的潜力：虽然BR类固醇（BRs）的发现相对较晚，但由于它们在抗逆性和调节农艺性状（如植株结构、产量、果实品质和非生物胁迫响应）中的关键作用，已成为第二次绿色革命的焦点（Yang等人2024a）。在水稻、小麦和玉米等作物中，破坏BR合成或信号传导的突变已被用于开发适合高密度种植的矮化品种，从而提高产量而无需额外施用氮肥（Morinaka等人2006年；Sakamoto等人2006年；Song等人2023年）。这些成功案例强烈支持通过修改和优化BR信号传导/合成作为未来田间作物品种开发的有希望策略（Yang等人2024a）。在许多苹果矮化砧木中，由于转录因子MdWRKY9抑制了BR合成限速酶基因MdDWF4的表达，导致BR水平降低（Zheng等人2018年）。然而，这种品种改良策略尚未在葡萄植株结构改良中得到充分探索。在这项研究中，VviBR6OX1和VviBR6OX2都导致了矮化现象，但VviBR6OX1起了关键作用。这并不令人意外，因为VviBR6OX2主要在愈伤组织中被检测到，在其他检查的组织中其表达水平非常低。因此，与VviBR6OX1相比，VviBR6OX2不太适合作为改良葡萄植株结构的靶点。尽管如此，仍需要进一步研究以更好地理解VviBR6OX1和VviBR6OX2之间的功能差异及其组织特异性表达。在拟南芥中，已经证明有两个CPY85A基因在BR合成中具有不同的表达模式和催化能力：AtCYP85A1只能催化合成castasterone（CS），而AtCYP85A2可以同时合成CS和BL（brassinolide），后者具有更高的生物活性（Castle等人2005年；Nomura等人2005年）。鉴于在所有检查的葡萄组织中均未检测到BL，并且VviBR6OX1是这些组织中主要表达的BR6OX基因（表S8）（Parada等人2022年），我们推测VviBR6OX1可能像AtCYP85A1一样无法催化BL的合成。目前尚不清楚VviBR6OX2是否能够像番茄中的CYP85A3或拟南芥中的CYP85A2那样合成BL。由于在本研究中发现VviBR6OX2在胚胎发生愈伤组织中的表达水平非常高，确定愈伤组织中是否能检测到BL将非常有趣。了解VviBR6OX2在特定葡萄细胞类型中的功能作用，可以为其对葡萄植株早期发育的贡献及其与VviBR6OX1的相互作用提供宝贵的见解。有许多例子展示了通过探索BR基因的突变变化来创造具有不同矮化程度的理想植株。例如，在水稻中，具有特定氨基酸替换的d2突变体比具有早终止密码子或在更保守残基处发生替换的突变体表现出更轻微的表型（Hong等人2002年）。另一个例子是在Brachypodium distachyon中，Bdbrd1-1杂合体比野生型植株短约30%，纯合突变体则更矮（Xu等人2015年）。此外，通过TILLING和化学诱变技术，在大麦中鉴定出了几个BR6OX基因HvDWARF的错义突变（Gruszka等人2011年，2016年）。这些突变导致了从轻微到严重的各种矮化表型，可用于进一步育种。在这项研究中，杂合BR突变体葡萄藤（wt/df）与纯合野生型葡萄藤（wt/wt）相比，叶柄长度较短（图S3）。可以设想我们可以通过调节VviBR6OX1的表达水平或创建不同类型的VviBR6OX1突变体来产生不同程度的矮化葡萄藤。本研究中同一葡萄藤上存在两种不同表型表明BRs的作用是局部的，这证实了先前的结论，即BRs不能长距离运输（Symons等人2007年）。BRs的这种局部特性可以为在不影响葡萄藤接穗性状的情况下改良砧木的非生物胁迫抗性性状提供机会。本研究主要关注突变VviBR6OX基因对几种葡萄植株结构性状的影响，但BRs也被证明会影响许多其他经济上重要的园艺植物性状，包括葡萄（Li等人2025年）。例如，外源施用epibrassinolide可以增加内源性BR水平，促进花青素积累和果实着色，并通过上调花青素生物合成基因以及改变果胶和细胞壁相关过程来促进果实软化（Liu等人2025年）。另一个例子是，外源施用epibrassinolide可以减轻氧化损伤，提高光合能力并调节碳和氮的吸收，从而提高葡萄对干旱胁迫的耐受性（Zeng等人2024年）。通过基因编辑增强VviBR6OX和其他BR相关基因的表达，这些与BR相关的性状改良机会可能得以实现。总之，我们发现了VviBR6OX1作为首次在葡萄中报道的与BR相关的矮化突变的主要遗传因子，并对其进行了表征和验证。我们进一步证明，可以通过CRISPR–Cas9技术高效编辑VviBR6OX1来产生矮化葡萄藤。这项工作为利用BR基因提供了一个重要步骤，正如在许多田间作物中所展示的那样，以开发具有改进植株结构和其他园艺性状的新葡萄品种，以满足各种育种需求，例如用于高密度种植。这里报告的知识也可能对其他木本果树（如苹果）有益，在这些果树中，矮化砧木和接穗非常受欢迎。作者声明没有竞争利益。