一种简单高效的硝基芳烃化合物生物降解方法，该方法利用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）产生的硝基还原酶及其“类细胞”固定化形式实现降解

《Journal of Biotechnology》：A simple and efficient biodegradation route for nitroaromatic compounds using a nitroreductase from Bacillus subtilis and its “cell-like” immobilized form

　　

作者：Ze Li、Ziyi Yang、Liangyu Zheng

中国吉林大学生命科学学院，教育部分子酶学与工程重点实验室，长春 130012

摘要

硝基芳香化合物是持久性的环境污染物，对生态和毒理学构成重大风险。将这些化合物通过酶促还原为相应的芳香胺提供了一种高效且选择性的降解途径，同时还能生成用于制药和农化合成的重要中间体。本研究从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中分离出一种硝基还原酶（NRBs），该酶能够以极高的效率催化硝基芳香化合物的还原反应，2小时内产率超过99.0%，且无需使用V₂O₅等金属催化剂。为了提高酶的稳定性和避免频繁添加辅助因子，研究人员利用ZIF-67作为包覆材料，构建了一种“类细胞”的共包载系统，该系统包含NRBs、葡萄糖脱氢酶（GDH）和辅助因子NADH。在这种设计中，NRBs被纯化并固定在聚乙烯吡咯烷酮（PVP）改性的ZIF-L（P-ZIF-L）上，而NADH和GDH则共接枝到聚（丙烯酰胺-二烯基二甲基铵 chloride）（PADD）上，形成了一个PNG复合体。结果表明，NRBs@P-ZIF-L@PNG@ZIF-67复合体具有更强的催化活性、稳定性和更广的底物选择性。此外，“类细胞”共固定系统在经历七次反应循环后仍能保持65.0±3.5%的对苯胺生成产率，而NRBs–GDH重组全细胞催化剂在相同条件下则完全失活。这项工作建立了一种快速、简单、绿色且可持续的硝基芳香化合物生物降解策略，证明了“类细胞”共固定酶系统的可行性和高效性。

引言

硝基芳香化合物广泛应用于制药和爆炸物等行业，属于有毒的环境污染物（Kumar等人，2020年）。大多数硝基芳香化合物结构稳定，难以自然降解，因此开发通用的降解方法十分重要（Yuan等人，2017年）。在化学方法中，借助金属催化剂的选择性加氢是大规模还原硝基芳香化合物的主要策略（Ma等人，2019年）。生成的芳香胺是精细化学品和药品合成的重要中间体（Li等人，2023年）。然而，金属催化存在一些缺点，如贵金属成本高昂、选择性差以及操作条件苛刻，这些因素限制了其实际应用（Wang等人，2020a；Wang等人，2020b；Li等人，2019年）。氢供体还原剂如肼（N₂H₄）（Rajendran等人，2021年）和硼氢化钠（NaBH₄）（Cui等人，2020年）虽然相对安全，但难以在短时间内实现完全还原。因此，需要在环境友好的条件下开发替代性的还原途径。

生物转化提供了一种温和且高度选择性的方法，可以替代传统的化学催化（Shen等人，2021年）。依赖于黄素单核苷酸（FMN）的硝基还原酶，尤其是对氧不敏感的I型酶，能够还原多种硝基芳香化合物，在环境修复（Tiwari等人，2020年）、疾病治疗（Wang等人，2024年）和有机合成（Calle等人，2019年）领域具有巨大潜力。Wang等人报道了一种来自Psychrobacter sp. ANT206的耐寒硝基还原酶，能够在24–42小时内完全降解硝基芳香化合物，尽管反应时间较长（Wang等人，2021年）。Cosgrove等人证明了一种硝基还原酶与钒盐（V₂O₅）共催化系统能高效地将2-甲基-5-硝基吡啶还原为5-氨基-2-甲基吡啶，但V₂O₅的使用不可避免地会产生金属污染物（Cosgrove等人，2023年）。因此，探索能够实现硝基芳香化合物快速、简单和高效生物降解的新硝基还原酶至关重要。

由于酶在恶劣条件下容易失活，实际应用受到限制（Mulinari等人，2020年）。固定化是一种提高酶稳定性和重复使用性的有效方法（Akhlaghi和Najafpour-Darzi，2022年）。它还可以与酶纯化技术结合使用（Huang等人，2023a；Huang等人，2023b）。目前已研究了多种简单、廉价且安全的固定化载体，包括介孔二氧化硅（Zhang等人，2023年）、磁性纳米颗粒（Qiu等人，2021年）和有机框架（Zhou等人，2022年）。其中，金属有机框架（MOFs）是一类具有可调孔隙大小、可设计结构和拓扑结构以及强水稳定性的材料，非常适合用于酶的固定化（Du等人，2022年）。沸石咪唑酸盐框架（ZIFs），如ZIF-8和ZIF-67，可以通过Zn²⁺或Co²⁺离子和2-甲基咪唑在温和条件下制备（Huang等人，2023a；Huang等人，2023b；Zhao等人，2024年）。它们的低密度、大比表面积和高稳定性使其特别适合用于酶固定化（Duan等人，2023年）、气体吸附（Yin等人，2023年）和生物传感（Li等人，2021年）等应用。

大多数基于氧化还原酶的生物催化系统需要添加昂贵的辅助因子，如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 [NAD(P)H]（Han和Liang，2018年）。虽然使用葡萄糖脱氢酶（GDH）等辅助酶再生NAD(P)H是一种理想策略，但NAD(P)H本身无法持续回收，这限制了这类系统的可持续性（Mordhorst和Andexer，2020年）。在全细胞生物合成系统中，辅助因子的原位再生可以在空间受限的微环境中精确调控，从而实现高效且可持续的生物催化。然而，全细胞催化系统由于固有的脆弱性，在耐有机溶剂性和可回收性方面存在局限性（Sun等人，2024年）。共固定化技术为解决这些问题提供了有前景的方案。

通过将具有协同或顺序功能的酶共固定化，多种生物催化剂可以在受限的空间内协同作用（Hwang和Lee，2019年）。特别是，MOFs可以通过合理设计来模拟天然细胞的 compartmentalization 和微环境稳态，从而在有限空间内实现多酶级联的空间组织和辅助因子再生模块的整合（Tan等人，2023年）。例如，Zhang等人将辣根过氧化物酶和乳酸氧化酶共包载到ZIF-8中，构建了一个具有高选择性和活性的“仿生细胞器”。催化效率的提高归因于两种酶之间扩散距离的缩短（Zhang等人，2022年）。

此外，带负电荷的酶分子可以与带正电荷的聚合物（如聚（二烯基二甲基铵 chloride）强烈相互作用（Fan等人，2024年）。同样，NAD(P)H辅助因子可以结合到聚乙烯亚胺（Ren等人，2020年）、聚（烯丙基胺盐酸盐）（Liu和Sun，2023年）和阳离子微凝胶（Liu等人，2024年）上。这些静电相互作用有助于酶和辅助因子的稳定共固定，无需在催化循环中反复补充辅助因子。此外，聚合物提供的亲水微环境类似于细胞质，有助于保持酶的生物活性（Li等人，2011年；Weng等人，2021年）。

在本研究中，从枯草芽孢杆菌中提取了一种硝基还原酶（NRBs），并将其用于硝基芳香化合物的降解。为了提高其稳定性并避免频繁添加辅助因子，研究人员使用ZIF-67作为载体构建了一种“类细胞”共包载系统。首先使用P-ZIF-L作为支架纯化NRBs，得到NRBs@P-ZIF-L。随后选择带正电荷的聚合物PADD作为NADH和GDH的支撑物，形成PADD-NADH-GDH（PNG）复合体。最后，将NRBs@P-ZIF-L和PNG共包载到ZIF-67中，得到“类细胞”NRBs@P-ZIF-L@PNG@ZIF-67（方案1）。使用扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对游离和固定化的NRBs的结构进行了表征，并将其催化活性和稳定性与游离NRBs和NRBs@P-ZIF-L进行了比较。此外，还评估了NRBs@P-ZIF-L@PNG@ZIF-67与NRBs–GDH重组全细胞的重复使用性。因此，本研究提供了一种基于硝基还原酶的硝基芳香化合物降解策略，并展示了“类细胞”共包载设计在提高生物催化应用可持续性方面的优势。

节选内容

NRBs@P-ZIF-L的制备

P-ZIF-L的制备和NRBs的表达方法见支持信息。对于NRBs@P-ZIF-L的制备，将250毫克P-ZIF-L和25毫克/毫升浓度的粗NRBs溶液混合在Tris-HCl缓冲液（100 mM，pH 8.5，2.0毫升）中，在4°C下以200 rpm搅拌3小时。所得NRBs@P-ZIF-L通过离心（13,680×g，3分钟，4°C）收集，用Tris-HCl缓冲液（100 mM，pH 8.5，2.0毫升）洗涤三次，然后储存在4°C下

NRBs催化1a降解

为了实现硝基苯（1a）的降解，研究人员鉴定出一种名为NRBs的硝基还原酶，该酶具有催化这种转化的潜力。游离NRBs（13毫克/毫升）在过夜条件下可将1a还原为2a，产率为13.4%，而在缺乏NRBs的情况下1a未发生转化，这证实了NRBs介导的降解的可行性，尽管反应条件仍有优化空间。

由于NRBs是一种氧化还原酶，首先使用NADH和NADPH评估了其辅助因子的偏好。

结论

总之，通过开发“类细胞”固定化系统NRBs@P-ZIF-L@PNG@ZIF-67，建立了一种快速、简单、环保且高效的硝基芳香化合物生物降解途径，该系统表现出优异的催化活性和稳定性。NRBs能够高效地将硝基苯（1a）还原为2a，2小时内产率超过99.0%，且无需额外添加金属催化剂。P-ZIF-L作为NRBs的有效支架

CRediT作者贡献声明

Liangyu Zheng：撰写、审稿与编辑、项目管理、方法学设计、实验研究、资金申请。Ziyi Yang：方法学设计、数据管理。Ze Li：撰写初稿、方法学设计、实验研究、数据管理。

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

作者感谢吉林省科学技术发展计划（项目编号：20250204064YY）提供的财务支持。