经验证的RP-HPLC–UV方法用于儿童嚼片中阿莫西林的定量分析及稳定性评价

《ELECTROPHORESIS》：Validated RP-HPLC–UV Method for the Quantitative Analysis and Stability Evaluation of Amoxicillin in Paediatric Gummy Tablets

　　**摘要**

开发能够获得儿科患者依从性的产品是制药技术面临的一个挑战，这项技术旨在开发出能够克服与口味、剂量灵活性以及患者接受度相关问题的制剂。在本研究中，应用了一种经过全面验证的反相高效液相色谱法（RP-HPLC–UV）结合紫外检测技术，用于定量测定专为儿科设计的创新软糖片制剂中的阿莫西林（AMX）含量。色谱方法主要是按照ICH Q2(R1)指南进行优化和验证的，评估了其特异性、线性、定量限（LOQ）、准确度、精密度以及稳健性和鲁棒性。在方法验证和定量分析过程中，使用了从空白制剂中提取的空白基质来模拟样品基质。该方法在0.0039–0.25 mg/mL的浓度范围内表现出优异的线性（R2 = 0.99），准确度令人满意（回收率在101.3%到102.4%之间），且精密度高（变异系数[CV] ≤ 1.6%）。定量限估计为0.0020至0.0039 mg/mL。由于青霉素G在化学和理化性质上与AMX相似，因此使用它作为模型化合物来评估提取回收率，结果为97.0% ± 0.1%。将该验证方法应用于含有AMX的软糖片后，确认其药物含量为理论值的94.7% ± 3.7%。在不同储存条件下进行的稳定性研究表明，软糖基质中的AMX含量会逐渐降低，在25°C真空条件下降解现象更为明显，而室温（RT）下储存时降解程度较轻。总体而言，所开发的RP-HPLC–UV方法被证明是可靠且适用于含AMX软糖片的常规质量控制及稳定性评估，为这种儿童友好型剂型的进一步开发提供了支持。

**1 引言**

开发能够获得儿科患者依从性的制药制剂仍然是制药行业面临的重要挑战。这一问题在抗生素治疗中尤为突出，因为目前可用的制剂形式通常由于口味不佳、使用不便以及剂量难以准确给予等原因，导致患者依从性较差[1]。阿莫西林（AMX）是一种广谱β-内酰胺类抗生素，在儿科临床中广泛用于治疗多种细菌感染。尽管AMX本身具有苦味，但目前市场上主要的AMX制剂形式为口服悬浮液和片剂。这些制剂在儿科中被推荐使用，因为它们具有优异的生物利用度，同时给药简单且无创，这些都是儿科治疗中的关键因素。然而，这些口服制剂往往因其不愉快的味道而不被儿童接受[1]。在这种情况下，软糖片可能成为传统制剂形式的一个有前景的替代品，因为它们有望改善口味、简化给药过程并提高患者的整体接受度。开发适合儿童年龄的制剂需要仔细考虑几个关键因素，包括给药便利性、基于体重的剂量灵活性、适口性以及在光、热和湿度条件下的稳定性[2-4]。最近，利用三维（3D）打印技术成功开发了含AMX的淀粉基软糖片，证明了生产具有可定制剂量的创新儿科制剂的可行性[5, 6]。为了确保这种新型制剂的有效性和质量，评估软糖片在制备后能否保持AMX的原始特性至关重要。因此，开发用于测定不同基质中AMX的可靠且稳健的分析方法是非常重要的。除了这些应用之外，还需要适当的分析方法来进行市售产品的常规质量控制，以及新开发的含AMX制剂的表征和评估。高效液相色谱法（HPLC）是迄今为止用于分析AMX的最广泛使用的分析技术[7]。许多文献报道了针对各种制剂中AMX定量的HPLC方法的开发和验证。这些方法大多在反相（RP）色谱条件下进行，通常使用十八烷基硅烷（C18）柱子结合传统的光谱检测器[8-10]，并应用于片剂、胶囊和口服悬浮液等不同制剂形式的分析[11, 12]。尽管较少见，但也有一些基于不同分离机制（如强阳离子交换色谱）的AMX分析方法[13]。此外，在检测系统的选择上也存在差异，一些研究使用传统的紫外（UV）-可见光光谱法以外的方法（如质谱法[MS]）来提高灵敏度和选择性[14]。Unutkan等人描述了一种灵敏的HPLC–UV方法，用于商业医药产品和环境基质中AMX的定量，获得了优异的线性（相关系数为0.9999），低检测限，并成功应用于片剂和悬浮液等固态和液态口服制剂[11]。这些发现进一步支持了HPLC方法在常规药品质量控制中的可靠性和广泛应用性。其他研究则致力于提高方法的选择性并开展稳定性研究。Konari和Jacob开发了一种能够同时分析AMX和氟氯西林的稳定性指示RP-HPLC方法，该方法对在不同应力条件下形成的降解产物具有高选择性，包括酸性、碱性、氧化和光解降解[12]。这项研究强调了能够有效区分活性药物成分（API）与降解产物和制剂辅料的分析方法的重要性。分析方法的最新进展还强调了环境可持续色谱程序和多组分分析策略的重要性。在这方面，Almalki等人引入了一种绿色HPLC-MS方法，用于测定AMX及其相关物质，旨在减少有机溶剂的消耗并改善分析程序的环境影响[14]。总的来说，这些研究突显了HPLC方法在缩短分析时间、提高灵敏度和增强环境可持续性方面的持续进步。尽管已有多种分析方法可供选择，但仍需要开发简单、快速且稳健的HPLC程序，以满足国际机构的要求，例如减少分析时间、简化样品制备过程和验证流程。此外，文献中报道的色谱参数（如流动相组成、检测波长和验证方案）存在差异，表明根据特定的制药制剂和分析目的，还有进一步的优化空间。在本研究中，作为一项更广泛研究项目的一部分，描述了应用全面验证的HPLC–UV分析方法对软糖片制剂中AMX进行定量分析的方法。同时，在受控条件下也对所制备的软糖片的稳定性进行了为期一段时间的研究。

**2 材料与方法**

**2.1 化学品和试剂**

HPLC级丙腈（ACN）、青霉素G、无水氯化钙和二水合磷酸钾（K2HPO4·3H2O）购自Merck Life Science（Merck KGaA，德国达姆施塔特）。用于HPLC分析的水通过Millipore的Milli-Q Plus 185系统进行纯化（美国马萨诸塞州米尔福德）。流动相组分在使用前通过超声波处理10分钟以除去气泡。玉米淀粉和AMX三水合物购自ACEF S.p.A.（意大利菲奥伦祖奥拉达）。有机金合欢蜂蜜由当地农场采集并购买自当地市场（意大利佩鲁贾）。模拟胃液（SGF）按照意大利药典（Fu XII Ed.）制备，其组成为：2 g NaCl、80 mL 1 M HCl和双蒸水至1000 mL。

**2.2 仪器和色谱条件**

HPLC分析使用Shimadzu（日本京都）LC-20A Prominence仪器进行，配备CBM-20A通信模块、两个LC-20 AD双活塞泵、SPD-M20A光电二极管阵列检测器和Rheodyne 7725i进样器（美国加利福尼亚州科塔蒂），进样器带有20 μL不锈钢环。使用的柱子为Inertsil ODS-3柱（GL Sciences Inc.，日本），规格为250 × 4.6 mm2内径、5 μm孔径、100 ?。使用选定的流动相，将柱子在1.0 mL/min的流速下预处理至少60分钟。柱温通过Phenomenex（美国加利福尼亚州托伦斯）Thermasphere HPLC柱冷却/加热器（型号TS-430）进行控制。进样体积设置为20 μL，色谱分析在230 nm波长下进行。选择这一检测波长是根据文献[8, 11]确定的。研究发现K2HPO4·3H2O 0.1 M水/ACN（90:10，v/v；水相pH值为8.70）混合物是最佳的流动相。流速设定为1.0 mL/min，柱温设定为25°C。每次分析后，对柱子进行空白进样以评估前一次分析可能产生的残留物质。为了评估柱子的性能，使用Merck Life Science（德国达姆施塔特）提供的NaNO2作为非保留标记物。由于钠硝酸盐在水中的高溶解度、低成本和良好的紫外可检测性等优点，它被选为RP系统中的死时间估计标记物。然而，在低波长下的检测和潜在的次要相互作用可能会限制其稳健性。尽管存在这些限制，钠硝酸盐仍可作为使用C18柱的RP色谱应用中的合适标记物。

**2.3 软糖片的制备**

软糖片是通过浇铸法制备的，所用凝胶的组成已在之前的研究中进行了优化[5]，包括30% w/w的金合欢蜂蜜、10% w/w的玉米淀粉和剩余的超纯水。蜂蜜在室温（RT）下加入超纯水中，在磁力搅拌（600 rpm）下溶解10分钟。然后将玉米淀粉分散到制备好的溶液中。所得分散液在80°C的水浴中搅拌（400 rpm），以引发淀粉凝胶化。凝胶化完成后，继续在磁力搅拌下保持10分钟。随后，将凝胶在室温下冷却（100 rpm）。通过Cito Unguator将2% w/w的AMX粉末分散到冷却后的凝胶中，搅拌2分钟（2000 rpm），然后将凝胶倒入“泰迪熊”形状的硅胶模具中，在室温下用CaCl2干燥72小时。之后，将软糖片从模具中取出，并在CaCl2中再干燥24小时。干燥后，将软糖片单独包装在真空环境中保存。对于50克凝胶，可得到34片软糖片，因此每片软糖片的理论AMX含量为29.4 mg。在验证过程中，制备了含有青霉素G的软糖片。凝胶的制备方法如上所述。为了确定每片软糖片中的药物确切含量，按照以下步骤操作：使用调羹将固定量的青霉素G手动分散到固定量的凝胶中（1.47 g/片），直至均匀。然后将凝胶倒入“泰迪熊”形状的硅胶模具中，并按上述方法进行干燥。

**2.4 方法验证**

所开发的HPLC方法主要是根据ICH Q2(R1)指南进行验证的（但并非完全严格遵循），并基于部分作者之前的研究[15]。评估了以下参数：特异性、线性、定量限（LOQ）、准确度（重复性和中间精密度）、稳健性和鲁棒性。此外，还建立了准确度曲线。方法验证使用传统的UV–可见光检测器进行。通过评估AMX三水合物保留时间（约9分钟）处可能出现的制剂辅料干扰来评估方法的特异性。为此，分析了组成与药品相同但不含AMX的空白制剂。空白制剂切成小份，在1 L双蒸水中磁力搅拌24小时。随后，将得到的悬浮液取约15 mL样品在4000 rpm下离心10分钟，收集上清液。取0.5 mL上清液，用等体积的流动相稀释，并通过0.45 μm尼龙注射过滤器过滤，以去除任何不溶性颗粒，然后按照第2.2节描述的程序进行RP-HPLC分析。在药物制剂中，通过使用七点校准曲线对AMX进行了定量测定。准备了AMX的标准贮备液（0.5 mg/mL），并依次稀释得到以下浓度：0.0039、0.0078、0.0156、0.0313、0.0625、0.125和0.25 mg/mL。所有校准溶液都是在流动相和提取液的50:50（v/v）混合物中制备的。为了更好地模拟实际样品基质，将空白制剂中获得的提取液（以下简称空白基质）加入到所有制备液中。选择了0.05 mg/mL的目标测试浓度。在分析之前，所有溶液都经过1分钟的超声处理。每个浓度水平分析了三个独立的重复样品。LOQ（检测限）被确定为方法精度（以变异系数CV表示）低于5.0%的最低浓度。LOQ的测定是使用在空白基质中制备的AMX溶液进行的，该基质由流动相和空白制剂提取液的50:50（v/v）混合物组成。通过在不同天数对两个浓度水平（分别为选定测试浓度的80%和120%）进行三次独立测定来评估准确度和精度。使用在空白基质中制备的溶液来评估重复性和中间精度。作为精度评估的一部分，还研究了方法的稳健性和鲁棒性。通过故意改变三个色谱参数来评估稳健性：流动相流速、柱温以及紫外检测波长。通过分析流速为0.9、1.0和1.1 mL/min的0.05 mg/mL AMX溶液来评估流速变化对峰面积的影响。在24°C、25°C和26°C下评估了柱温的微小变化的影响。此外，通过比较在229、230和231 nm下对测试浓度进行三次独立分析得到的峰面积来评估检测波长的小变化的影响。通过评估两名不同操作者在两个AMX浓度水平（0.04和0.06 mg/mL）下的分析结果来研究方法的鲁棒性。对于每个浓度水平，由两名不同的操作者在连续三天内各进行三次分析。还使用了含有已知量青霉素G的三片软糖片来评估提取回收率。这些软糖片经过制造并分散后，得到了三个独立的溶液，其制备过程与装载AMX的软糖片相同。选择青霉素G作为参考化合物，是因为它在化学和物理化学性质上与AMX相似。青霉素G在软糖片中的定量是使用根据与AMX标准溶液相同的协议制备的六点校准曲线来进行的。

2.5 AMX含量软糖片的HPLC–UV分析

HPLC–UV分析通过分析三片独立的软糖片进行了三次重复实验。简要来说，每片软糖片用手术刀切成小块，分散在1升水中，并以600 rpm的速度搅拌24小时。然后，将所得悬浮液的一部分在4000 rpm下离心10分钟。取0.5 mL的上清液用等体积的流动相稀释。所得溶液进行涡流混合，通过0.45 μm尼龙注射器过滤器过滤，最后在2.2节描述的色谱条件下进行分析。

2.6 软糖片的稳定性

为了评估AMX在软糖片制剂中的稳定性，进行了长期稳定性研究。软糖片在两种不同条件下储存了6个月：一种是在25°C下真空包装；另一种是在室温下的干燥柜中储存。在预定义的时间点（0、7、30、90和180天），按照2.5节中的描述将制剂切碎并分散在水中，然后使用2.2节中描述的HPLC–UV分析法测定AMX的含量。药品的包装应选择能够保持药物的原始物理化学性质和稳定性的类型。对于液体制剂（如AMX口服悬浮液），通常采用4°C的储存条件。相比之下，本研究中研究的制剂是在通常适用于固体剂型的条件下储存的（例如，片剂），这些制剂不需要冷藏。固体剂型可以多剂量或单剂量包装；然而，单剂量包装（例如，泡罩或单剂量袋）通常更受青睐，因为它能更好地保护药物和制剂。此外，为了提高稳定性，通常会去除空气（特别是会导致许多降解途径的氧气），并用惰性气体替代。在实验室规模条件下，单剂量制剂在减压（真空）下储存，以尽可能模拟固体剂型的常用储存条件。

3 结果与讨论

最初的实验步骤是确定一种能够有效分析所研究制剂中API的RP-HPLC–UV方法。为此，选择了其他作者先前为商业药品产品和废水样品中AMX的测定以及SGF中其稳定性评估开发的色谱方法[11]，并稍作修改以适应本研究中可用的色谱柱。有关所应用色谱条件的详细信息在2.2节中提供。随后，该方法主要按照ICH Q2(R1)指南进行了验证，该方法采用了一些现有作者之前报告的方法[15]。2.4节提供了验证参数和程序的全面描述。

3.1 系统适用性

在将分析方法应用于真实样品的分析之前，首先通过分析在流动相中制备的AMX标准溶液来评估系统适用性。进行系统适用性测试是为了验证色谱系统在选定的实验条件下正常运行。所有评估的参数都符合预定义的验收标准，确认了该方法适用于常规分析（更多细节见2.2节）。具体来说，拖尾因子为0.95（验收标准≤2.0），表明峰的对称性良好；保留因子为2.42（验收标准≥2.0），表明分析物的保留适当；理论板数超过8000（验收标准≥2000），反映了柱子的效率令人满意。这些验收标准虽然不是ICH指南规定的，但经常在美国药典、欧洲药典和印度药典的专论以及经过验证的分析方法中指定[16]。图1a显示了AMX三水合物标准溶液的分析所得到的色谱图。作为对比，图1b显示了从所研究的制剂中提取的API的色谱图。两个色谱图之间的相似性进一步证实了该方法 的适用性。

3.2 方法验证

对含AMX三水合物的标准溶液进行分析，无论是否含有辅料，都证明了共溶剂不会影响色谱响应。特别是，从含有相同API浓度的溶液中获得的峰面积值相似度大于98.5%。这两种溶液都是使用流动相和空白基质溶液（详见2.4节）或纯水以50:50（v/v）的混合物在选定的AMX测试浓度下制备的。在所应用的实验条件下，分析物的保留时间约为9分钟（图1a,b）。确保足够的色谱选择性，充分的分析物保留是必不可少的。通过注射从空白制剂中获得的提取溶液（即空白基质溶液）来评估方法的特异性，该制剂被定义为与所研究的制剂相同但不含AMX的制剂，其制备方法如2.3节所述。在对应于AMX三水合物的保留时间处没有观察到色谱峰（图1c）。为了定义所开发色谱方法的工作范围，评估了一个广泛的浓度区间，从2%（0.0010 mg/mL）到大约1000%（0.5 mg/mL）的选定测试浓度。所有标准溶液的制备方法如2.2节中用于构建校准曲线的溶液所述。AMX三水合物标准溶液是通过将API溶解在流动相和从空白制剂中获得的提取液的50:50（v/v）混合物中制备的。对于每个测试的浓度水平，计算了峰面积值的CV%。基于这些结果，选择了一个更窄的浓度范围来确定方法的线性。该范围包括0.0039–0.25 mg/mL区间内的七个浓度水平，相当于选定测试浓度的7.8%–500%，并用于构建定量回归模型。选择这个浓度范围是为了覆盖大约两个数量级。使用所有10个浓度水平或选定的七个浓度水平进行回归分析，得到的校准曲线的决定系数（R2）均为0.99。当应用留一法交叉验证程序（R2_cv）时，也获得了相似的结果。对于选定的七个浓度水平，CV%值≤5%，而在最低浓度（0.0010和0.0020 mg/mL）处观察到更高的变异性（表S1）。使用最小二乘法，七点校准曲线由以下方程描述：

其中y代表峰面积，x代表分析物浓度。根据在最低浓度处获得的CV%值，估计定量限（LOQ）在0.0020和0.0039 mg/mL之间。这个LOQ被认为是令人满意且适合该方法预期应用的。通过分析相当于选定测试浓度80%（0.04 mg/mL）和120%（0.06 mg/mL）的两个浓度水平来评估方法的准确性和精度。结果报告在表1中。更多细节在支持信息文件中提供。表1. 开发的方法的准确度（%）、重复性（%CVW）、中间精度（%CVIP）和容忍区间（%）。

3.1 系统适用性

在将分析方法应用于实际样品的分析之前，首先通过分析在流动相中制备的AMX标准溶液来评估系统适用性。进行系统适用性测试是为了验证色谱系统在选定的实验条件下是否正常运行。所有评估的参数都符合预定义的验收标准，证实了该方法适用于常规分析（更多细节见2.2节）。具体来说，拖尾因子为0.95（验收标准≤2.0），表明峰的对称性良好；保留因子为2.42（验收标准≥2.0），表明分析物的保留适当；理论板数超过8000（验收标准≥2000），反映了柱子的效率令人满意。这些验收标准 zwar不是ICH指南定义的，但经常在美国药典、欧洲药典和印度药典的专论以及经过验证的系统适用性评估分析方法中指定[16]。图1a显示了AMX三水合物标准溶液的色谱图。图1b显示了从所研究的制剂中提取的API的色谱图。两个色谱图之间的相似性进一步证实了该方法的适用性。

3.2 方法验证

对含有和不含辅料的AMX三水合物标准溶液的分析表明，共溶剂不影响色谱响应。特别是，从含有相同API浓度的溶液中获得的峰面积值相似度大于98.5%。这两种溶液都是在选定的AMX测试浓度下使用流动相和空白基质溶液（详见2.4节）或纯水以50:50（v/v）的混合物制备的。在所应用的实验条件下，分析物的保留时间约为9分钟（图1a,b）。充分的分析物保留对于确保足够的色谱选择性是必要的。通过注射从空白制剂中获得的提取溶液（即空白基质溶液）来评估方法的特异性，该制剂定义为与所研究的制剂相同但不含AMX的制剂，其制备方法如2.3节所述。在对应于AMX三水合物的保留时间处没有观察到色谱峰（图1c）。为了定义所开发色谱方法的工作范围，评估了一个宽广的浓度区间，从2%（0.0010 mg/mL）到大约1000%（0.5 mg/mL）的选定测试浓度。所有标准溶液的制备方法如2.2节中用于构建校准曲线的溶液所述。AMX三水合物标准溶液是通过将API溶解在流动相和从空白制剂中获得的提取液的50:50（v/v）混合物中制备的。对于每个测试的浓度水平，计算了峰面积值的CV%。基于这些结果，选择了一个更窄的浓度范围来建立方法的线性。该范围包括0.0039–0.25 mg/mL区间内的七个浓度水平，相当于选定测试浓度的7.8%–500%，并用于构建定量回归模型。选择这个浓度范围是为了覆盖大约两个数量级。使用所有10个浓度水平或选定的七个浓度水平进行的回归分析得到的校准曲线的决定系数（R2）均为0.99。当应用留一法交叉验证程序（R2_cv）时，也获得了类似的结果。对于选定的七个浓度水平，CV%值≤5%，而在最低浓度（0.0010和0.0020 mg/mL）处观察到更高的变异性（表S1）。使用最小二乘法，七点校准曲线由以下方程描述：

其中y代表峰面积，x代表分析物浓度。根据在最低浓度处获得的CV%值，估计定量限（LOQ）在0.0020和0.0039 mg/mL之间。这个LOQ被认为是令人满意且适合该方法预期应用的。通过分析相当于选定测试浓度80%（0.04 mg/mL）和120%（0.06 mg/mL）的两个浓度水平来评估方法的准确性和精度。结果报告在表1中。更多细节在支持信息文件中提供。表1. 开发的方法的准确度（%）、重复性（%CVW）、中间精度（%CVIP）和容忍区间（%）。

需要注意的是，这里指出的容忍区间是指预期包含具有指定置信水平的未来结果的统计范围。缩写：CV，变异系数。如表1所示，方法的准确度以回收率表示，在0.04 mg/mL浓度水平为102.4%，在0.06 mg/mL浓度水平为101.3%。关于方法的精度，重复性（CVw）和中间精度（CVIP）的变异系数在两个浓度水平上都≤1.6%；详细结果在表S2和S3中提供。鲁棒性测试（表S4）表明，检测波长的微小变化对分析性能没有显著影响，表现为CV%为1.6%。同样，柱温的轻微波动对结果也没有显著影响，CV%为1.1%。相反，流速被确定为唯一的关键参数，因为±10%的变化导致CV%显著升高至8.1%。鲁棒性评估（表S5）显示，不同操作者进行的分析对分析结果没有显著影响。峰面积值仅显示出微小变化，证实了方法的鲁棒性，分别为0.04和0.06 mg/mL浓度水平的CV%值为1.7%和1.4%。总体而言，所有验证参数都符合验收标准，表明开发的方法可靠且适用于所研究的创新制剂中AMX的定量分析。通过确定软糖片中的AMX含量并将其与相应的理论值进行比较来最初评估API的回收率。在这些实验的背景下，始终观察到回收率超过94%。为了进一步确认活性化合物从药物制剂中的定量回收，随后使用2.2节中描述的RP-HPLC–UV方法分析了含有青霉素G的软糖片，以评估提取回收率。选择青霉素G作为模型化合物，是因为它在化学和物理化学性质上与AMX相似。关于含有青霉素G的软糖片的制备方法和用于标准溶液的浓度的方法细节分别报告在2.3节和2.4节中。青霉素G软糖片的分析结果显示，提取回收率为97.0% ± 0.1%。

3.3 含AMX的软糖片分析及稳定性评估

最终，将经过验证的方法应用于分析2.5节所述制备的含AMX的软糖片。结果显示，软糖片中AMX的总含量为27.9 ± 1.1毫克，相当于预期含量的94.7% ± 3.7%。AMX在软糖片基质中的稳定性曲线（见表2）表明，在两种测试储存条件下，色谱可检测到的活性物质在180天的监测期间逐渐减少。在初始7天时间点，储存于25°C真空条件下的样品中AMX含量（以初始峰面积的百分比表示）下降得更剧烈（81.9%），而储存于室温干燥柜中的样品下降幅度较小（94.5%），这表明真空环境及其相关的微环境因素可能在储存初期加速了降解过程。这种在真空条件下更快的降解趋势在整个储存期间都持续存在，180天后的AMX残留量分别为：真空条件下58.6%，干燥柜条件下70.3%（见表2）。表2显示了在不同储存条件（室温干燥柜和25°C真空）下软糖片稳定性的变化情况，结果以初始峰面积的百分比表示。

这些观察结果与已知的AMX在非冷藏储存条件下的化学不稳定性以及环境因素对降解动力学的影响一致。AMX通过β-内酰胺环的开裂发生水解降解，其降解速率随温度升高而加快，在缺乏稳定条件的情况下更为显著[17]。同样，对不同储存温度下复溶后的AMX悬浮液进行的长期稳定性研究表明，在较高温度下降解更加迅速，如果未进行冷藏，浓度在1-2周内就会降至初始值的80%以下。这些发现支持了在软糖片中观察到的趋势，即较高的储存温度以及真空条件下可能改变的湿度条件可能会加速降解过程。值得注意的是，与真空储存相比，室温干燥柜储存条件下AMX的保留率更高，这表明在缺乏极端干燥的情况下，诸如水分扩散、软糖基质中的残留水分活性以及微环境pH值的潜在变化等因素可能在稳定β-内酰胺环方面起到了一定作用。软糖片配方中包含了吸湿性辅料，这些辅料可以调节局部的水分活性，从而相对于完全干燥或高度受压的储存条件减缓水解降解。尽管与传统片剂等固体口服剂型的直接比较有限，但针对AMX固体剂型的加速和实时稳定性研究通常旨在证明在受控温度和湿度条件下长期储存时，其含量能够保持在药典规定的范围内（90%–110%）。

4 结论

本研究成功应用并验证了一种稳健可靠的RP-HPLC–UV方法，用于定量测定适用于儿童的创新软糖片配方中的AMX含量。该方法根据ICH Q2(R1)指南进行了验证，证明了其足够的特异性、线性、灵敏度、准确性、精确度、稳健性和鲁棒性。使用来自空白配方的空白基质有助于真实模拟样品基质，从而确保定量分析的可靠性。此外，使用青霉素G作为模型化合物进行了提取回收率的评估，结果显示回收率约为97%，从而证实了提取程序的适用性。将验证后的方法应用于含AMX的软糖片分析，证实了生产过程中所得药物的含量接近理论值，证实了这种配方方法的可行性。稳定性研究进一步表明，AMX在软糖基质中会随时间逐渐降解，储存条件对此过程有显著影响。特别是在25°C真空条件下的储存效果较差，导致AMX含量下降更为明显。总体而言，研究结果表明，所开发的RP-HPLC–UV方法适用于含AMX软糖片的常规质量控制及稳定性评估。此外，研究结果还强调了软糖片作为“儿童友好”剂型的潜力，同时也指出了需要进一步优化配方和包装以提高长期稳定性。这项工作可能有助于推动创新儿科抗生素疗法的分析策略和配方开发。

作者贡献

Samuele Bonafè：方法学研究、数据分析、初稿撰写。

Anna Imbriano：方法学研究、数据分析、初稿撰写。

Anna Migni：数据分析。

Elisa Bianconi：数据分析。

Laura Mercolini：撰写、审稿和编辑。

Luana Perioli：撰写、审稿和编辑、资料收集。

Cinzia Pagano：撰写、审稿和编辑、资料收集。

Roccaldo Sardella：概念提出、方法学设计、验证、数据分析、初稿撰写、监督、资料收集。

致谢

作者感谢欧盟——下一代欧盟计划（Next Generation EU）通过意大利大学与研究部（MUR）的国家创新生态系统拨款ECS00000041—VITALITY—CUP J97G22000170005的支持，以及佩鲁贾大学（Università degli Studi di Perugia）和MUR在该项目Vitality中的支持。开放获取出版由佩鲁贾大学根据Wiley - CRUI–CARE协议提供。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可向通讯作者提出合理请求后获取。