糖基化诱导的Biliverdin IXβ还原酶活性位点破坏：一种分子动力学研究方法

《Journal of Molecular Graphics and Modelling》：Glycation induced active site disruption of Biliverdin IXβ reductase. A molecular dynamics approach.

　　

Jayanth Jeevanandam|P. Esackimuthu|K. Bhuvana|A.S. Ruupha Shree|V.R. Harshini|Srikanth Raghavendran|N.T. Saraswathi

分子生物物理学实验室，化学与生物技术学院，SASTRA大学（泰米尔纳德邦，Thanjavur-613401）

摘要

黄素还原酶（FR），也称为Biliverdin IXβ还原酶（BLVRB），是一种属于短链脱氢酶/还原酶（SDR）蛋白家族的单体酶，其特征是通过NADPH依赖性催化作用将biliverdin转化为bilirubin，后者是胎儿血红素代谢和细胞防御中的关键抗氧化剂。在结构上，BLVRB具有Rossmann折叠结构，其中包括动态环区（Loop80和Loop120）以及对底物和辅因子结合至关重要的辅酶夹子（Arg14，Arg78）。在高血糖条件下，BLVRB会与甲基乙二醛（MG）发生糖基化反应，从而因Advanced Glycation End-products（AGEs）的产生而加剧糖尿病并发症。本研究利用分子动力学模拟来检测糖基化引起的结构变化。结果表明，BLVRB从开放构象转变为封闭构象，Thr12–Arg78之间的夹子紧密结合变得更加紧密，NADPH结合口袋变窄，溶剂可及性降低，螺旋间取向也发生变化。主成分分析（PCA）和自由能景观（FEL）分析证实了构象空间和稳定性的显著变化。这些发现表明糖基化会破坏BLVRB的动态特性，可能影响其活性和抗氧化功能。

引言

黄素还原酶（FR），也称为Biliverdin IXβ还原酶（BLVRB），是一种属于短链脱氢酶/还原酶（SDR）蛋白家族的单体酶，能够催化NADPH依赖性的biliverdin向bilirubin的转化。与成人血红素降解途径不同，BLVRB在胎儿血红素代谢中起着核心作用，并通过生成强效抗氧化剂bilirubin来参与细胞防御。BLVRB由八个α螺旋、十个β折叠片和八个独特的环组成，共同形成一个特征性的Rossmann折叠二核苷酸结合结构。其功能的重要特征是环区的动态构象灵活性，尤其是Loop80和Loop120，在无辅因子状态下会封闭底物结合口袋，而在辅因子结合时会发生重排以允许底物进入。此外，其活性位点在“辅酶夹子”（尤其是位于14和78位的精氨酸残基）方面存在进化变异，这些残基调节辅因子的结合和释放动力学，从而影响底物的转化速率。

突变研究表明BLVRB对结构和功能具有敏感性。天然存在的Ser111Leu突变会丧失氧化还原活性，增加活性氧（ROS）的生成，并使造血方向偏向血小板生成；而实验性的Ser111Ala突变会降低稳定性、酶活性和黄素亲和力。Arg35处的突变会破坏NADPH/NADH的选择性，Arg35Ala突变则完全消除对NADPH的偏好。辅酶夹子残基的改变进一步调节构象动态：Arg78Ala增加环的灵活性但降低转化速率，而Gln14Arg增强辅因子结合亲和力。Q14R–R78G双重突变可再现其他哺乳动物同源物中的夹子排列。同样，His153Ala突变会降低活性并增加黄素亲和力，而Thr164位远端别构位点的突变会影响辅因子亲和力和转化速率（如人类T164S和蹄兔S164T突变所示）。除了这些突变外，BLVRB还被发现具有S-亚硝基化酶活性，能通过翻译后S-亚硝基化修饰目标蛋白，但自修饰的具体影响尚不明确。

部分摘录

材料与方法

本研究使用GROMACS 5.1.4软件和GROMOS 54a7力场进行分子动力学模拟。用于Apo黄素还原酶模拟的PDB结构为1HDO[25]。通过WHAT IF服务器添加了缺失的原子来制备蛋白质结构（去除了NADP配体和水分子）。此外，还针对甲基乙二醛在R39、R78、R92、R134等精氨酸残基处引起的修饰进行了质谱分析。

环区构象

BLVRB的环区在调节辅因子和底物的动态结合与释放过程中起着关键作用。特别是Loop80、Loop120、β6a以及αE螺旋的N端区域共同构成了底物结合口袋，它们的构象灵活性对催化功能至关重要。先前的研究表明，无辅因子的BLVRB处于开放构象，而结合了辅因子的BLVRB则转变为封闭构象，从而促进底物的有效结合。

讨论

本研究探讨了甲基乙二醛（MG）在Biliverdin IXβ还原酶特定位点引起的糖基化对其构象的影响。糖基化以特定方式破坏了BLVRB的天然几何结构，尤其是在靠近NADPH结合裂隙的Arg78和Arg170部位影响最为显著。这些修改导致Thr12–Arg78之间的残基距离缩短，表明存在持续闭合的夹紧构象。

结论

总体而言，分子动力学模拟显示甲基乙二醛的特异性糖基化会导致黄素还原酶（BLVRB）发生深刻的结构和动态变化：Loop80和Loop120从天然开放构象转变为封闭构象，限制了底物的可及性，并增强了Thr12–Arg78之间的辅酶夹紧作用，使NADPH结合口袋变窄。

CRediT作者贡献声明

Srikanth Raghavendran： 形式分析。Saraswathi N. T.： 文稿撰写与编辑、初稿撰写、审稿与编辑、数据验证、研究方法设计、项目资助申请、形式分析、数据管理、概念构思。Esackimuthu P： 文稿撰写与编辑、方法设计、形式分析、数据管理。Bhuvana K： 文稿撰写与编辑、方法设计、研究方法设计、形式分析。Ruupha Shree A S： 方法设计、形式分析。Harshini V R： 形式分析。Jayanth：

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利益冲突声明

作者声明没有任何已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢印度政府（BT/PR9167/BRB/10/1268/2013）下属的生物技术部（DBT）提供的资助。同时感谢印度浦那先进计算发展中心的生物信息资源与应用设施（BRAF）提供的超级计算资源支持MD模拟研究。Jayanth Jeevanandam还感谢印度政府科学和工业研究委员会（CSIR）授予的资深研究奖学金（文件编号：09/1095(0052)/2020-EMR-I）。