一种基于叶片表型组学的方法，用于估算北美甘草地下部分的特性

《American Journal of Botany》：A leaf phenomics approach for estimating belowground traits in North American licorice

　　摘要

研究前提
数千年的选择性育种主要集中在地上部分的产量上，而对地下部分的变化关注较少。根系是植物生长和抵御环境的能力的基础，但我们对这些关键结构的了解仍远远落后于对地上部分结构的认识。准确表型分析根系特征既耗时又昂贵，而且往往具有破坏性。需要高通量、非破坏性的方法来深入理解根系的基本生物学特性，并将这些难以测量的根系特征整合到育种计划中。

研究方法
我们选择了美国甘草（Glycyrrhiza lepidota Pursh.）这一具有丰富民族植物学历史的多年生豆科植物作为模型，来研究根系表型。我们评估了不同种群的根系特征，分析了地上和地下表型之间的关系，并测试了利用多维叶片特征（包括光谱反射率）预测根系特征的方法。

研究结果
美国甘草的根系特征在不同来源种群之间存在显著差异。根系特征之间存在强烈的相关性，每种根系特征都与地上某一种型相关。叶片的光谱反射率和元素组成能够预测地下特征；然而，由于植物尺寸与根系特征之间的等比例关系，某些特定特征的解读变得复杂。

研究结论
这些发现表明，利用高维叶片特征可以作为根系特征的代理指标，对理解植物生物学的基础问题以及针对多年生草本植物地下结构的育种计划具有潜在应用价值。为了改进预测模型，还需要进一步优化研究和扩大样本规模。在生物体内，植物体是独特的，因为它包含同时存在于两个截然不同环境中的不同器官系统。目前对植物生物学的理解主要集中在地上部分，因为根系隐藏在地下，描述起来非常困难。根系对于植物的固定和养分吸收至关重要，它们不仅影响植物的生长，还对生态系统属性（如土壤结构和组成、碳封存、土壤气体通量和元素循环）产生影响（Griffiths等人，2022；Lynch等人，2022；Lynch，2022；Mehra等人，2025）。目前关于地上植物结构与地下结构之间的关联了解甚少（例如，Barnaby等人，2019；Pastor-Pastor等人，2019），也不清楚是否可以根据地上观察结果预测地下结构。经过数千年的地上产量选择性育种，栽培物种的根系表型已经发生了变化（Martín-Robles等人，2019）。现代玉米经过适应性育种，具有更高的种植密度，其根系长度和生物量减少（Rinehart等人，2024），但养分吸收能力增强（York等人，2015；Sciarresi等人，2025）。类似的趋势也出现在一年生作物中，表明改变的根系系统降低了植物维持土壤健康、减缓侵蚀和支持养分循环的能力（Zhang等人，2011；Smaje，2015；Crews等人，2018）。尽管某些作物被选择性育种以获得可食用根或块茎等地下结构，但这些结构也经历了可食用组织与非可食用组织投资之间的权衡（Denham等人，2020）。这些研究及其他研究表明地上和地下植物结构之间存在关联，表明地上植物结构可能包含对描述植物根系有用的信息。准确的、高通量的根系特征表型分析仍然是植物生物学、生态学和育种研究中的一个关键限制。根系在形态、网络拓扑、土壤中的分布以及整个系统架构上存在差异（Lynch，1995；Seethepalli等人，2021），但在田间大规模测量关键表型（如根深）却非常困难（Hanlon等人，2024）。在受控条件下可以测量根深，但实验系统（如垂直琼脂板（Ogura等人，2019）和水培装置（Mathieu等人，2015）往往无法模拟田间条件。在田间，可以通过破坏性采样（挖掘）、土壤取芯、微型根系仪、大型仪器成像或使用示踪剂（Cabal等人，2021；Hanlon等人，2024）来研究根系。将根系表型分析整合到田间实验或育种计划中仍然充满挑战，因为通常破坏性地采集地下器官的样本（Kuijken等人，2015），这对多年生植物尤其成问题。需要快速、非破坏性的根系特征表征方法，以便将地下植物结构整合到基础植物生物学研究中，并更容易识别育种的目标（Maqbool等人，2022）。多维表型分析方法能够在单次观测中提供多个数据点，这对于测量复杂或昂贵的特征非常有前景。其中一个活跃的研究领域是利用地上（通常是叶片或叶冠）的光谱反射率来预测其他植物特征（Moreira等人，2020；Kothari和Schweiger，2022）。基于高光谱数据的模型已成功用于预测病害存在（Yu等人，2018）、代谢组成（Vergara-Diaz等人，2020）和植物发育阶段（Gutiérrez等人，2019；Kaur等人，2024）等。高光谱建模的理论基础是光与物体（如叶片）的相互作用取决于物体的物理和化学性质。植物叶片的总物理结构和化学组成决定了哪种波长的光会被反射、吸收或透过叶片（Sari?等人，2022）。因此，结构和组成的变化会反映在叶片与光的相互作用中的细微变化上。也有利用根系自身的高光谱反射率来建模根系特征的方法（Bodner等人，2018；Chang等人，2024；Faehn等人，2024），但这种方法具有破坏性，不适用于多年生植物。目前尚不清楚从叶片获得的高光谱数据是否可以用来预测植物其他部分的特征，如根系。本研究的目的是测试利用从地上部分（通常是叶片或叶冠）获取的多维数据（光谱反射率和元素组成）作为根系表型的代理指标的实用性。先前的研究表明，通过观察地上部分可以预测根系生物学的某些方面。由于根系直接负责大多数养分的吸收，元素组成已被证明可以直接预测根长（Hanlon等人，2024），但利用元素组成预测其他地下特征的情况尚不清楚。其他多维表型分析方法，如从光谱反射率衍生出的指数（如归一化差异植被指数NDVI；Rouse等人，1974）或水分指数（Pe?uelas等人，1993），在预测地上表型方面非常有用，并且最近才被发现可以预测根系数量（Alahmad等人，2025）。由于根系直接负责水分和养分的吸收，我们预计叶片的元素组成和光谱反射率会包含根系表型变化的信号。尽管这些植物未被早期农民驯化（Van Tassel等人，2010），但多年生草本植物作为一种有前景的作物越来越受到关注，因为它们能够生产经济上可行的产品并通过其根系提供重要的生态系统服务（例如，Zhang等人，2022）。许多多年生草本植物的根在历史上被用于食品和医药，表现出广泛的、可量化的变化。因此，这些植物为理解多维地上表型与地下表型变化之间的关系提供了宝贵的系统。其中，甘草属（Glycyrrhiza L.；豆科）的物种在世界各地已被人们种植了数个世纪（Kindscher，1992；Tang和Eisenbrand，1992；Richardson，2002）。最常见的甘草品种Glycyrrhiza glabra L.原产于南欧、东欧、中亚和西亚以及北非（GRIN-global，2025）。Glycyrrhiza glabra被用于食品添加剂（主要是作为甜味剂；Richardson，2002）、皮肤病学和化妆品（Burlando等人，2010）以及药理学（Tang和Eisenbrand，1992；GRIN-global，2025）。与其相关的美国甘草（Glycyrrhiza lepidota Pursh.）原产于北美大平原，也有类似的丰富民族植物学历史（Kindscher，1992；Moerman，1998，2009；Johnson等人，2023）。G. glabra和G. lepidota都被种植以获取其根系中的化合物，其中一些化合物与根系特征（如生物量和直径）直接相关（Hou等人，2018）。快速、非破坏性的根系表型分析平台对于未来研究和优化像甘草这样的多年生植物系统具有巨大价值，因为这些植物因其地下结构而受到重视。本研究旨在利用美国甘草作为模型，解决根系表型分析中的关键问题。虽然甘草的种植主要是为了获取其根系中的化合物，但我们关注的是所有植物物种共有的地下特征（如根生物量、长度、直径和表面积），同时保持其对甘草研究的相关性（Hou等人，2018；Li等人，2025）。具体来说，我们研究了（1）不同来源种群的地上和地下表型随植物大小的差异，（2）地上和地下表型之间的相关性，以及（3）多维叶片特征在预测地下特征方面的潜力。通过对来自不同地理来源的植物进行采样，我们能够捕捉到评估预测模型所需的广泛表型变异。利用异速生长模型，我们明确了地上和地下特征之间的关系，然后评估了考虑和不考虑地上生物量时光谱和元素叶片特征的预测能力。我们的结果表明，地上表型包含了地下变异的有意义信号，为未来基础植物生物学研究和开发支持育种计划中地下特征选择的预测模型提供了概念验证框架。

材料与方法
为了捕捉根系表型的广泛形态变异，我们从芝加哥植物园（3个种群）、美国农业部种质资源信息网络（USDA GRIN；9个种群）、Arvid Boe博士（南达科他州立大学；4个种群）以及商业来源（Everwilde Farms（美国加利福尼亚州Fallbrook）、Prairie Moon（美国明尼苏达州Winona）和Sheffield's Seeds（美国纽约州Locke；附录S1）获取了19个G. lepidota种群的大米种。2021年5月5日，将每个种群的12粒种子种植在96孔繁殖盘中，使用Berger Bm7 35% Bark HP土壤（加拿大魁北克Saint-Modeste），并放置在Danforth植物科学中心（美国密苏里州St. Louis）的生长室中，光照条件为16小时/天（200 μmol·s–1·m–2）、温度22°C和湿度50%。每天记录发芽情况。发芽后3周，将代表18个种群的78株幼苗移植到3.7升的盆中，使用Berger Bm7 35% Bark HP + 14-14-14 Osmocote（每盆14克）培养基，并移至Danforth中心的户外苗圃。在苗圃期间按需浇水。

叶片光谱数据
生长5个月后（2021年10月；平均发芽时间约为4天），我们随机收集每株植物上的三片健康、完全展开的叶片进行多维茎系表型分析（N = 72株植物，每株3片叶片；图1A）。使用CropReporter（PhenoVation，荷兰瓦赫宁根）对叶片进行成像，该仪器测量了光谱的蓝光（约470 nm）、绿光（约530 nm）、SpcGreen（约550 nm）、红光（约660 nm）和近红外（NIR；约790 nm）区域。此外，CropReporter还报告了平均色调（360°色轮上的颜色）、饱和度（从白色到纯饱和的颜色强度）、值（从纯黑色到颜色的亮度）、F0（适应黑暗环境的叶片组织的叶绿素荧光）和Fm（最大荧光）。从这些图像中，我们提取了光谱指数，包括光系统II的最大量子产率（Fv/Fm）、Fv/Fm的变化（dFv/Fm）、归一化差异植被指数（NDVI）、叶绿素指数（ChlIdx）、ChlIdx的变化（dChl）和花青素指数（AriIdx）。为了简化处理，所有CropReporter特征通过主成分分析（PCA）进行了降维，保留了约75%的Total CropReporter变异（cPCs 1–3；附录S2）。

Glycyrrhiza lepidota及其根系表型的可视化。（A）收获后用于表型分析的样本，根系中的培养基已被移除。（B）分析前的根系扫描示例。（C）使用RhizoVision Explorer处理后的干净且分割的根系扫描结果。叶片的光谱反射率使用LinkSquare 1手持光谱仪（LinkSquare，美国加利福尼亚州San Jose）进行测量，该光谱仪可以测量400至1050 nm范围内的反射率。LinkSquare 1包含两个光源：LS0，适用于可见光到红边的测量；LS1，适用于红边到近红外范围的测量。LinkSquare被放置在四个完全展开的随机小叶的腹面叶子上，这些小叶被压在一张恒定的黑色织物包裹的纸板衬背上。LinkSquare通过蓝牙与运行Prospector应用程序的Android平板电脑配对（Rife等人，2021年）。使用R包waves（Hershberger等人，2021年）根据每个样本与光谱总分布之间的马氏距离分布检测并移除了异常扫描数据，筛选标准基于自由度等于波长数量的卡方分布。然后，我们使用waves包对所有根系表型进行了九种光谱预处理测试，以了解哪种预处理可能产生最佳的根系表型模型。这九种预处理方法包括原始反射率、通过Savitsky-Golay滤波器（SG，窗口大小[w] = 11）的反射率、标准正态变量滤波器（SNV）、前三种处理的第一导数以及前三种处理的第二导数（附录S3）。平均而言，需要31个主成分（PCs）来解释每种预处理下的约75%的光谱变化。对每种预处理下的每个表型计算了多元回归模型，并选择了产生最高平均R2值的预处理（SNV）。尽管前三十一个PCs解释了约81%的总变异，而不是其他方法的75%，但我们选择保留所有经过SNV预处理的光谱PCs，因为减少选择的数量会导致不同的“最佳”预处理结果（附录S4）。

我们总共采集了204片叶子（68株植物×每株植物3片叶子=204片）用于元素组成分析。每片叶子在60°C的烤箱中干燥后研磨，尽可能将其质量控制在75至100毫克之间。样本使用Donald Danforth植物科学中心建立的分析流程进行分析（Ziegler等人，2013年），采用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）同时定量20种离子的浓度：钙、钴、铜、铁、镁、锰、钼、磷、钾、硒、钠、硫、锌、铝、砷、硼、镉、镍、铷和锶。组织质量小于20毫克的样本被排除在进一步分析之外，每种元素的数值是来自每株植物的三个重复实验的平均值。如上所述，选择了能够捕获约75%元素变异的主成分（ePCs 1-5；附录S5）。

我们收获了植物的地上生物量。样本在65°C下干燥三天后称重。

虽然人类使用甘草根主要关注其化学性质，但在这里我们更广泛地关注了在不同物种中普遍存在且可量化的根系特征。我们选择了可以可靠地在不同根系系统之间量化的特征，这些特征捕捉了根系结构、大小和分配的互补维度。选择这些根系特征作为初步的概念验证，以测试地上特征是否能预测地下结构。地下生物量的收获与地上生物量同时进行。将花盆倒置， gently移除所有的栽培介质和整个根系。根部被浸泡在水中以去除介质，然后在-20°C下保存在塑料袋中，待扫描时使用。解冻后，从样本中冲洗掉剩余的栽培介质，并将根系放在装有水的透明托盘中，使根彼此分离。透明托盘放置在Epson 12000XL平板扫描仪上（美国加利福尼亚州洛斯阿拉米托斯），使用透明单元以1200 dpi进行扫描，并使用Epson Scan 2软件保存为高质量JPEG文件。之后将根部在65°C下干燥三天并称重至最接近0.01克（地下生物量；LabForce TS-B-502天平，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）。地上和地下生物量的比率被作为一个额外的表型进行计算。根系扫描被分割，使用Rhizovision Explorer提取特征，其参数设置如下：根类型=断裂的根，最大背景噪声组件大小=2，启用边缘平滑=true，启用根修剪=true，根修剪阈值=20（图1B，C）（Seethepalli等人，2021年）。从每次扫描中，利用图像分辨率将像素转换为毫米。由于根的功能类别通常可以通过直径差异来近似（McCormack等人，2015年），因此将直径范围类别设置为0.25毫米的增量，直到直径范围类别11（Rhizovision的最大值），其中包括所有直径大于2.5毫米的根。由于根系扫描是在多张图像上进行的，因此使用RhizoVision Explorer配套脚本合并了根系特征（Seethepalli等人，2024年）。特征分布表明11个直径范围类别是不必要的，因此将直径类别6之后的所有类别合并为DR6+（>1.25毫米）。通过减少特征列表，去除了在三维中推断出的特征（体积和所有直径类别中的体积）、由于根系在扫描仪上的分割方式而不准确的特征（周长、根尖数量、分叉点和分叉频率），以及已知与其他特征几乎完全相关的特征（投影面积和网络面积，这些特征与表面积几乎完全相关）。经过这一减少后，分析了以下根系特征：总根长、平均根直径、最大根直径、每个直径类别中的根系表面积，以及每个直径类别中的表面积。此外，我们还计算了特定根长（SRL，总根长与地下生物量的比率）、每个直径类别中的根长比例以及每个直径类别中的表面积比例。这一广泛的特征集使我们能够测试地上表型特征是否可以预测地下根系结构的多样方面。

使用地上表型预测地下特征的关键挑战之一是区分仅属于根系特征的变化，而不是仅仅是植物大小的反映。我们针对四种植物大小测量方法测试了根系特征的等比关系。首先，我们将对数变换后的根系特征与对数变换后的地上生物量进行回归分析。其次，我们将对数变换后的根系特征与对数变换后的地下生物量进行回归分析。第三，我们拟合了一个线性模型，将地上生物量与地下生物量进行回归，并使用该模型的对数变换残差来表示仅属于地上生物量的变化，换句话说，排除了地下生物量的变化。最后，我们对排除了地上生物量变化的地下变化进行了同样的分析。在所有情况下，都评估了线的斜率是否接近1，这表明存在等比关系。接近零的值表示没有关系。中间值表示存在异速生长关系。

固定效应线性模型被用来理解地上和地下特征的变化，同时考虑了地上生物量（作为非交互作用的固定效应）。由于样本量较小，我们仅将群体效应记录为预期变化的描述性来源。使用R包Hmisc（Harrell，2022年）和corrplot（Wei和Simko，2021年）计算了双变量相关性。由于特征预计具有高度相关性（例如，同一大小类别内的根系特征），因此没有应用多重双变量特征相关的P值校正，因为多重检验校正可能会过于保守，可能掩盖生物学上有意义的关系。线性模型将特征与波长对波长光谱反射率进行回归，其中根系特征根据特定波长的SNV光谱预处理后的缩放反射率进行建模。

这项研究的样本量（N=72）排除了需要学习大量系数或其他模型超参数的多变量建模技术。因此，我们选择了一种技术，该技术构建了一个简化的预测变量集，总结了完整表型预测变量集的大部分变化。多变量主成分回归将根系特征根据在每种地上表型测量方式（CropReporter指数、高光谱反射率或元素谱）内分别衍生的主成分进行建模。对于每种数据类型，保留了大约75%累积方差的主成分，并将其作为固定的、加性的、非交互作用的预测变量包括进来。根系特征没有包括在任何PCA中，而是直接作为响应变量进行建模。模型使用留一法交叉验证框架进行拟合，在此框架中，(N-1)个观测值用于训练模型，每个折叠中的保留观测值被预测。通过将每个特征的真实值与其被排除的CV折叠中的预测值进行回归来评估这些模型的拟合优度，并从中计算R2值。模型通过将每个特征作为缩放值进行回归，并在调整地上生物量后进行拟合。所有分析均使用R 4.2.1版本完成（R Core Team，2022年）。

**结果**

**地下特征在不同来源的种群中存在差异**

在这项研究中，我们量化了地上生物量和31个根系特征的变化，包括地下生物量、地上与地下生物量的比率、特定根长、总根长、平均根直径、最大根直径和根系表面积。两个特征（总根长和根系表面积）在0到1.25毫米的六个直径类别中进行了分析，每个类别的变异范围包括最小值、25%分位数、中位数、平均值、75%分位数和最大值，详见附录S6。为了考虑总体植物大小的潜在差异，我们在控制地上生物量的情况下对每个地下表型进行了建模。正如预期的那样，本研究测量的大多数地下特征与地上生物量显著相关（图2A）。几乎所有根系特征，包括总根长和表面积，都与较大的地上生物量相关，地上生物量解释了根系特征变化的7.2%到32.7%。然而，某些特征，如地上与地下生物量的比率、特定根长以及直径类别2和5中的根长和表面积比例，并没有显示出这种相关性，这表明仅凭植物大小无法解释这些特征的变化。

**来源种群的影响和双变量特征相关性。（A）热图显示了通过固定效应线性模型评估的每个特征中由来源种群和地上生物量解释的百分比变异（PVE）。从这个图中排除的特征对于任何来源种群或地上生物量都不显著。（B）本研究所有特征的相关性矩阵。皮尔逊相关系数反映在每对特征的圆的大小和颜色上。从这个图中缺失的基于地上PC的特征与任何其他特征都没有显著相关性。相关性矩阵的其余部分，仅代表地上特征内部的相关性，可以在附录S8中找到。除了植物大小外，我们还观察到不同来源种群中几个根系特征的显著变化（图2A）。来源种群的最强影响出现在地上与地下生物量的比率上。其他受来源种群影响的特征包括地下生物量、特定根长、总根长和表面积。直径类别1-3内的根长和表面积因种群而异，直径类别6+中的根长和表面积比例在不同来源种群中也有所不同。当显著时，来源种群解释了根系特征变化的28.0%到53.6%。多维地上表型数据捕捉了变化的关键轴线。

为了研究地上结构预测地下特征的能力，我们减少了每种地上预测方式的维度。为此，我们生成了三组PCA衍生的预测变量：cPCs（来自CropReporter的数据）、sPCs（来自LinkSquare的光谱数据）和ePCs（元素组成数据）。为了解释这些PCs的组成，我们查看了每个PC所解释的变化以及加载到每个PC上的特征。前三个主成分（cPCs）解释了大约75%的CropReporter数据。cPC1（44.4%；附录S2）主要受绿反射率（正相关）和叶绿素及花青素指数（负相关）的影响。cPC2（24.3%）主要受宽带近红外反射率（正相关）和饱和度（负相关）的影响。cPC3（8.8%）主要受远红反射率（正相关）和dChl（负相关）的影响。对于光谱数据，前三个主成分解释了约51.8%的观测变异（PC1解释了37.9%，PC2解释了8.8%，PC3解释了5.1%）。LinkSquare中两个传感器的波长负荷在附录S7中进行了可视化展示。对于元素组成数据，前三个主成分解释了61.7%的变异（附录S5）。所有元素在ePC1上的负荷均为负值，其中硫和硼的负荷最大。钾和磷主导了ePC2上的负负荷（10.2%），镍和锶的负荷为正。cPC3（7.5%）主要受钼和镍（正相关）以及砷（负相关）的影响。ePC4（6.1%）中钴是正负荷最强的元素，而钠是负负荷最强的元素。最后，ePC5（5.2%）主要受铜（正相关）和锌（负相关）的影响。每个主成分预测因子也针对地上生物量和源群体的变异进行了评估。有趣的是，地上生物量和源群体的影响通常小于根系特征的影。显著的例外包括cPC1、sPCs 1–2、sPC18和ePCs 2–3，它们与地上生物量相关（解释了4.9–13.7%的变异）。在这些中，只有sPC2显示出显著的群体变异（解释了44.9%的变异）（图2A）。地上和地下特征之间存在强相关性。

接下来，我们测试了所有可能的特征对之间的相关结构（图2B）。在1431个可能的相关性中，我们发现有570个（39.8%）是显著的（P<0.05）。其中，378个（66.3%）呈正相关，192个（33.7%）呈负相关。研究中发现的大部分相关性要么是在地下特征内部，要么是在地下和地上特征之间。本研究很少发现地上特征内部的相关性（附录S8）。总体而言，我们发现了一组根系特征彼此之间存在正相关。这组特征包括地下生物量、特定根长、总根长、最大直径、表面积、所有六个直径范围内的根长以及所有直径范围内的表面积。例如，总根长与总根表面积呈正相关（r=0.98，P<0.01），最大直径与表面积也呈正相关（r=0.46，P<0.01）。值得注意的是，地上和地下生物量的比率以及平均根直径并未包含在这组特征中，它们与大型根系特征的不同表型呈负相关。在根系特征内部，其他负相关主要出现在表示比例的特征中。例如，直径类别2（0.25–0.50毫米）的根长比例与较大直径类别中的根长呈负相关。根长和直径类别6+（>1.50毫米）的表面积也与大多数直径类别中的根长和表面积呈负相关。这种负相关关系表明在根系资源分配上存在权衡——更多的资源分配给主根意味着较小直径类别的资源分配较少。本研究中测量的每个根系表型都与至少一个地上预测因子特征相关（来自CropReporter、光谱和/或元素数据的PCs）。例如，sPC1和sPC2与一组相关的根系特征呈负相关，而sPC10和ePC2与那组特征呈正相关。微妙但有趣的关系包括SRL与sPC2、3和20的相关性，以及平均根直径与sPC9、20和24的相关性。根系特征随着植物整体大小的增加而变化，但也独立变化。

为了确定根系特征的变化是否与植物整体大小不同，我们将对数转换后的根系特征与四个对数转换后的植物大小组成部分进行回归分析（见方法部分）。我们发现，总根长、表面积、五个直径范围内的根长以及五个直径范围内的表面积与地上和地下生物量呈等比例变化（图3A）。直径类别1的根长和表面积在两个方向的生物量上都表现出介于0和1之间的中间值，这表明相对于这些特征，生物量的积累速度更快。没有特征与仅限于地上或地下生物量的变化呈等比例关系，但有一些关系似乎既不类似于0（无关系）也不类似于1（等比例），代表了负异速生长。没有基于比例的特征与任何植物大小特征呈等比例关系。有趣的是，从CropReporter、LinkSquare光谱仪或元素组成分析中获得的地上多维预测因子特征均未与任何植物大小特征呈等比例关系（附录S9）。这种预测因子特征的缺乏表明，虽然需要根据植物大小调整由多维表型建模的根系特征，但多维预测因子本身不需要调整。图3展示了异速生长分析和多变量模型。（A）根系特征与四个不同方面植物大小之间的异速生长关系斜率：地上（AG）生物量、地下（BG）生物量、仅地上生物量特有的变异（AG resid）以及仅地下生物量特有的变异（BG resid）。粗垂直线表示斜率等于0（无关系）和1（等比例或等缩放）。（B）来自CropReporter（c）、光谱反射率（s）和元素组成（e）主成分的多变量预测模型的性能。每个模型都使用原始值（颜色较深）进行拟合，然后在调整地上生物量后（颜色较浅）进行拟合。模型性能通过使用留一法交叉验证将真实表型与预测表型进行比较并计算决定系数（R2）来评估。多变量模型能够准确预测根系特征。

对于每个特征，我们使用来自CropReporter（3）、LinkSquare光谱仪（31）和元素组成（5；图3B）的主成分进行回归分析。总体而言，使用光谱或元素组成参数化的模型表现更好（CropReporter与元素组成：P<0.01；CropReporter与光谱：P<0.01；元素组成与光谱：ns）。例如，元素组成主成分预测地下生物量的R2=0.47（P<0.01），光谱主成分预测总根长的R2=0.36（P<0.01）。值得注意的是，在几乎所有根系特征模型中，调整地上生物量后会降低主成分回归的性能。以上为例，元素主成分预测调整后的地下生物量的R2=0.15（P<0.01），光谱主成分预测调整后的总根长的R2=0.15（P<0.01）。有趣的是，在几乎所有根系特征中，调整地上生物量后，光谱主成分的预测能力优于元素组成主成分（CropReporter与光谱：P<0.01；元素组成与光谱：P=0.02）。从比例派生的特征在任何直径类别中都无法通过任何主成分模态得到令人信服的预测结果，无论是是否调整地上生物量。尽管我们目前的预测能力有限，但我们注意到光谱主成分模型具有相当大的解释能力。例如，当我们使用所有样本来回归不同直径范围内的根长和表面积特征时，我们在原始光谱和SNV转换光谱中看到的R2值在0.625到0.675之间（附录S3）。此外，我们发现通过优化技术可以提高这种解释能力。例如，通过加入更多主成分，总表面积的预测能力得到提升（附录S10）。通过自助法估计真实R2，一个包含10个主成分的模型平均R2为0.41，而一个包含37个主成分的模型平均R2为0.90。我们提醒不要过度解读超过37个主成分的模型性能，因为模型会过参数化，但额外主成分提供的信息表明仍有改进空间。特定光谱区域与根系特征有很强的相关性。

由于我们已经证明从叶子获得的光谱即使在考虑了地上生物量后也具有一定的预测能力，我们试图了解哪些光谱反射率区域可能有助于预测地下特征。为此，我们针对每个SNV转换后的波长分别拟合了线性模型（图4）。每个波长都是针对光谱仪中的每个传感器独立拟合的，并且模型既适用于缩放后的特征值，也适用于调整过地上生物量的特征值。我们发现根系特征与分析的光谱范围内的反射率相关。例如，地下生物量、总根长和表面积在LinkSquare光源0捕获的425、475、550和650纳米处有峰值。在每种情况下，缩放后的特征与反射率的关系都比调整后的特征更强，但两种形式的模型的平滑平均值都有显著性。这些特征也与900纳米附近的反射率相关。这种效应在LinkSquare光源0上表现得最明显，但在LinkSquare光源1上则较弱。地上和地下生物量的比率在这些峰值中有一部分体现出来，特别是在475、650和740纳米处。我们还在850纳米处注意到一个信号，但这个信号在调整后的特征模型中最为明显。有趣的是，平均直径在750纳米附近有一个大的峰值，但仅在调整后的特征模型中检测到。最后，平均直径与许多波长下的反射率相关，但这些相关性通常位于非常狭窄的波段内，而不是光谱的广泛区域（图4）。

在这项研究中，我们探讨了美国甘草地上和地下表型随植物大小的变化情况，以及这些变化在不同源群体间的差异。我们证明了叶光谱反射率和叶元素组成是合理的多维表型，可以作为根系表型的代理进行调查，并用于构建稳健的表型估计模型。建立容易测量的地上特征与难以测量的根系特征之间的相关模式，为评估植物隐藏一半的变化提供了一种方法。虽然甘草在生态和农业上具有重要意义，但我们将这项工作作为使用地上表型估计地下变异模式的测试案例。这种方法为根系特征的进化和生态分析提供了机会，并为未来可以大规模调查根系特征的育种流程带来了希望。根系特征在不同源群体间的变化为作物改良和驯化奠定了基础。

我们描述了美国甘草地上和地下表型在不同源群体间的变化程度。虽然大多数地上表型在不同源群体间没有显著变化，但根系特征确实存在变化（图1）。例如，包括地下生物量、SRL、总根长、表面积、最窄直径类别中的长度和表面积，以及最宽直径类别中的长度和面积比例在内的许多根系特征在不同群体间都有所不同。遗憾的是，我们没有关于源群体原始位置的详细信息；然而，我们知道种子来自美国的不同气候区域，包括亚利桑那州、俄勒冈州和中西部地区（附录S1）。这些植物的根系会在不同的土壤条件下生长；因此，我们观察到的根系特征差异是预期的。这项研究的一个重要局限性是在盆栽条件下进行的，而盆栽大小已知会影响根系特征（Poorter等人，2012a）。此外，我们有限的样本量只能提供美国甘草种内变异的快照。未来需要基于田间种植的个体和根系化学分析来进行更全面的表型研究。遗传变异是进化的基础，也是育种所必需的（Swarup等人，2021）。不同种群中关键根部特征的变异表明，育种计划可以选择能够提高作物性能和抗性强化的根系特征，例如增加根系质量以提高养分吸收能力或发展更深根系以提高耐旱性（Comas等人，2013年；Lynch，1995年，2019年）。此外，与根长和结构相关的特征变异可能直接影响生态系统服务（Den Herder等人，2010年）。能够容易地检测根部特征多样性可以加速甘草及其他因地下属性而被选中的作物的改良，从而培育出针对特定农业目标或更好地适应特定环境条件的品种。这一过程的关键部分将是建立根部特征变异与所需作物改良目标之间的机制联系，包括在根系（例如甘草等植物的根部化学组成提升，以及更广泛地说，根系提供的生态系统服务）和地上部分（产量增加）之间的联系。为了更好地选择地下特征，有必要更深入地了解根部特征观察到的遗传基础，并在多个生长季节中对田间变异进行表征。地上和地下特征之间的相关性表明，通过地上部分特征有可能增强根系功能。

本研究中发现的最持久的一个模式是，甘草的根部特征与地上生物量相关，这表明可以通过测量地上特征来评估甘草的根部特征。这种关系可能是某些系统的独特特征，因为资源分配可能根据发育情况、环境条件或系统发育偏好根系或地上部分的生长（Brouwer，1962年；Bloom，1985年；Poorter等人，2012b年；Ma等人，2021年）。本研究测量的每个根部特征都与一个或多个多维地上预测变量相关。特别值得注意的是，我们观察到根部特征与叶片光谱反射率和叶片元素组成之间存在相关性。考虑到大多数元素是通过根部吸收的，叶片元素组成与根部表型变异相关并不令人惊讶。先前的研究表明，叶片中的元素积累与不同深度的根长积累相关，这可能部分归因于不同土壤深度下的独特元素特征（Hanlon等人，2024年）。叶片光谱与地下特征的相关性更为意外。虽然宽带指数（如NDVI，Huang等人，2021年）已被证明与地上植物大小相关，但从CropReporter数据得出的主成分（cPCs）与根部特征相关，但与植物大小无关（图2B）。窄带光谱测量结果分为三类：与地上特征相关但不与地下特征相关的（sPC17）、与地上生物量和地下特征都相关的（sPC2），以及仅与根部特征相关的（sPC1、sCP10、sPC24）。虽然叶片光谱已被用于预测叶片特征（Kothari等人，2023年），但预测地下发生的情况更具挑战性。从高光谱反射率得出的模型可能表现更好（Li等人，2020年），但这些模型受到样本大小和模型复杂性的权衡。使用叶片光谱和元素数据的预测模型在估计根部特征方面显示出潜力，但需要进一步优化以提高准确性。

根部特征如何与地上生物量（或更一般的植物大小）相关的问题的重要性在于，我们可以从两个潜在目标出发来进行这项研究：（1）独立于已知的相关性预测地下特征；（2）通过考虑已知的相关性来识别每个地下特征特有的地上特征签名。为了正式分析地下特征与代表植物大小的不同特征之间的相关性，我们检测了特征异速生长关系（Niklas，2004年），并将其与四个植物大小组成部分进行了比较：地上生物量、地下生物量、地上结构独有的大小以及地下结构独有的大小。我们发现，尽管不是全部，但本研究中测量的几个根部特征与地上和地下生物量都呈等速生长关系，特别是与根长和表面积相关的特征（图3A）。这些特征都与总大小呈等速生长关系，而不是与地上或地下生物量特有的变化相关。我们选择地上生物量来代表植物大小，因为异速生长结果显示，虽然地上和地下生物量都与某些根部特征呈等速生长关系，但没有一种特征的特殊变化是与地下特征呈等速生长的。在本研究中，我们测试了是否可以使用CropReporter、LinkSquare光谱仪或叶片元素组成分析所得的多维地上表型来预测地下特征（图3B）。为了考虑与植物大小的等速生长关系，我们对所有模型进行了两次拟合：一次是针对原始（缩放后的）根部特征值，另一次是在调整地上生物量后针对根部特征值。我们发现叶片光谱反射率和元素组成是预测地下特征的最强预测因子，但在调整植物大小后模型的预测效果显著下降。有趣的是，在校正植物大小后，除了地下生物量外，所有地下特征（包括地上生物量与地下生物量的比率、最大直径以及一些根长比例特征）都通过叶片光谱反射率预测得更好。这一观察结果，加上光谱主成分回归在纳入所有光谱变异之前就已经饱和的观察结果（附录S10），表明未来的研究，最好是在更大的样本量下进行建模方法探索，可能会能够独立于植物大小适当预测根部特征。为了理清根部特征与光谱主成分之间的关系，我们将每个根部特征与逐波长光谱反射率进行了回归分析。我们发现，测试的每个根部特征（那些未按直径范围分类的）都与较大的光谱窗口相关，这可能为我们提供了关于哪些光谱部分对预测建模最有信息价值的见解。例如，大约425、475、550和650纳米处的峰值通常与蓝光、绿光和红光相关。这些波长通常与叶绿素吸收和反射有关（Gitelson和Merzlyak，1996年；Lichtenthaler和Buschmann，2001年），这表明它们可能间接捕捉到了与植物活力或光合作用活动相关的信号，而这些可能与根部特征相关。此外，在近红外区域（大约900纳米）观察到的强相关性特别值得关注。近红外反射率通常与水分含量、细胞结构和生物量有关，这可能解释了为什么地下生物量、总根长和表面积等特征在这里表现出强烈的响应（Pe?uelas和Filella，1998年；Clevers等人，2010年）。

这里呈现的数据表明，美国甘草的地上观测结果，包括地上生物量、叶片光谱特征和叶片元素浓度，与根部特征相关。这些结果令人兴奋，因为它们表明基于地上收集的数据可能可以获得有关地下结构变异的信息。然而，应该考虑这项研究的局限性，并需要进一步的工作来更全面地发展这种方法。对于以根部药用化合物为种植目标的植物（如美国甘草），需要将根部的化学分析与地上观测结果联系起来。甘草种植中主要感兴趣的化合物是三萜皂苷甘草苷（或称甘草酸）（Hayashi等人，2005年；国家生物技术信息中心，2026年），它主要存在于根部。甘草属植物（Glycyrrhiza glabra）和甘草苷具有丰富的民族植物学历史，经常被引用为传统中药的重要组成部分（Ding等人，2022年）。除了G. glabra之外，其他甘草属物种分布于除南极洲外的所有大陆（Duan等人，2020年），具有不同的化学组成和民族植物学历史。几个世纪以来，美国甘草因其根部的药用特性而受到关注，因为根部是甘草苷和其他潜在有用皂苷化合物的主要储存部位（Hayashi等人，2005年）。尽管本研究的范围不包括甘草根部的化学成分分析，但根据观察到的根部分型变异，我们预计化学成分和/或浓度会存在变异（Li等人，2025年）。此外，在像甘草这样的系统中，优化特定根系结构（如主根）是有价值的。未来的工作应考虑更明确地划分根系统的功能。在美国甘草等物种中，根部特征的变异仍有许多尚未探索的地方，其中根部化学属性是选择的主要目标（Jiang等人，2020年；Wang等人，2020年；Li等人，2025年），以及在其他多年生草本植物中，根部因对生态系统服务的贡献而受到重视，这些系统需要复制这项工作。需要进一步的工作来了解哪些根部特征是潜在的选择目标，以及这些特定根部特征的变化如何与可测量的地上特征相关。继续深入了解根系各个方面如何与作物产量相关以及它们如何为地下重要的生态系统服务（例如碳封存）做出贡献将非常重要。有了这些信息，地上观测结果可以用来改进和优化根系的特定方面。

本研究强调了利用光谱反射率和元素组成来预测难以测量的美国甘草地下根部特征的潜力。通过将地上表型与根系特征相关联，我们展示了非侵入性、非破坏性的可扩展方法来估计根部特征。叶片光谱数据与根部特征之间的强相关性表明，这些方法可以作为评估根系的宝贵工具。然而，植物大小异速生长的复杂性及其对预测建模的影响强调了在这些分析中对植物大小进行仔细调整的必要性。需要更大规模、更全面的研究来改进这些模型，因为这里呈现的工作表明，在调整地上生物量后，预测准确性存在局限性。增加样本量并纳入更多的叶片光谱变异可以帮助开发出更稳健的模型，从而更好地捕捉根部特征的独特变异。这一研究方向作为捕捉根部特征变异的新方法具有前景，有可能促进对地下结构的进化和生态分析，以及选育提高作物性能、抗性和适应性的特征的育种工作。

**作者贡献**
M.J.R.构思了实验，并与A.J.M.共同监督了项目参与者。方法开发和研究工作由M.J.R.、V.T.、M.T.H.和E.P.完成。M.J.R.、Z.N.H.、M.T.H.和V.T.参与了数据管理、正式分析和数据可视化。M.J.R.和A.J.M.起草了原始手稿。M.J.R.和A.J.M.获得的资助支持了这项工作。A.J.M.管理资金并提供了支持工作的资源。所有作者均参与了手稿的审阅、编辑和修订，并对这里描述的工作负责。

**致谢**
我们感谢Donald Danforth植物科学中心、食品和农业基金会（CA20-SS-0000000123）对A.J.M.和M.J.R.的支持，美国草本植物学会、美国国家科学基金会（BII 2120153）对A.J.M.的支持，The Perennial Agriculture Project与Malone Family Land Preservation Foundation和The Land Institute的合作，以及Saint Louis大学的资助，以及Taylor Geospatial Institute为Z.N.H.提供的博士后奖学金。我们还要感谢Arvid Boe博士提供种子支持，Miller实验室的成员（Katherine Korein、Puja Patel、Jackson Braley、William Keaggy、Zoraya Piedra、Samantha Selby和Felix Vatman）在数据收集方面的协助，Danforth中心植物生长设施（RRID:SCR_024902）、Danforth中心表型分析设施（RRID:SCR_019049）和Danforth中心生物分析化学设施（RRID:SCR_001047）的支持。最后，我们感谢审稿人对我们手稿的仔细评估和建设性评论，这些评论帮助我们澄清了概念框架并提高了工作的整体质量。

**利益冲突声明**
作者声明没有利益冲突。

**数据可用性声明**
原始根部扫描数据可在Zenodo上找到（https://zenodo.org/records/18852041）。RhizoVision Explorer输出特征、CropReporter及相关元数据、光谱反射率数据、元素组成数据以及重现本文分析所需的所有R代码均可在Figshare上找到（https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28742870）。