基于均匀图像的数字免疫测定方法，具有较高的容错能力

《npj Imaging》：Homogeneous image-based digital immunoassays with high error tolerance

　　摘要：全球健康领域存在一个重要需求，即将更多体外诊断测试从临床实验室转化为现场应用，包括即时检测（POC）和自我检测格式。这些应用通常需要更小的样本量，限制了样本处理和测量能力，并引入了更大的操作变异性。容错能力是成功设计现场检测方法的关键因素之一。在这里，我们研究了机器学习（ML）策略，以提高基于图像的纳米粒子免疫测定的容错能力。在微升样本体积中随机分散纳米粒子，并对图像进行处理，根据纳米粒子的形态来确定分析物浓度。我们使用两种常见的血液分析物——C-反应蛋白（CRP）和抗SARS-CoV-2 IgG——来评估检测性能。我们比较了传统图像分析、基于像素分割的混合ML-传统方法以及使用目标正则化策略的端到端图像回归方法的结果。使用SARS-CoV-2阳性个体的血清样本，基于分割的方法实现了96%的特异性和90%的敏感性，与血清转化率相匹配。端到端回归模型在无需样本预处理的情况下，实现了优于ELISA水平的定量性能（5.2 ng/mL），检测范围为0.01–10 ng/mL，具体取决于捕获抗体的亲和力。数字分子检测的检测限不是固定的，我们进行了理论分析，展示了如何通过调整粒子计数和多分散性来实现任意灵敏度，直至泊松极限。全图像回归方法的训练图像只需要一个标签——分析物浓度——从而消除了劳动密集型的像素级标记。最终，基于图像的读数在动态范围、灵敏度和重复性方面显著优于传统读数。

引言：酶联免疫吸附测定（ELISA）是敏感和定量生物标志物检测的临床金标准，但它们需要集中式的实验室基础设施、多个洗涤步骤以及较长的周转时间，这限制了其在临床实验室之外的应用。相比之下，侧向流动测定（LFAs）能够在即时检测点进行快速、低成本的检测，但通常会牺牲分析灵敏度、定量准确性和重复性，尤其是在全血等复杂基质中。实验室级性能与现场可部署的简易性之间的差距仍然是开发可及诊断技术的一个核心挑战。免疫测定的数字化——从批量信号测量转向逐个粒子的分析——是生物标志物检测中一个快速发展的趋势。这种从模拟到数字的转变在许多方面反映了电子行业的类似转变。同样，它在分子诊断中具有实现更高灵敏度、精度和特别是抗误差能力的巨大潜力。诸如单分子阵列（Simoa）或单分子计数（SMC）等技术通过在飞摩尔大小的孔或液滴中隔离单个目标分子来实现超高灵敏度，从而实现测定的数字化。现有的数字测定方法仍然需要精密设计的孔阵列、液滴生成器或高端成像设备来最小化非特异性结合、光学散射和图像伪影等背景噪声——所有这些都会严重影响准确性。容错能力并不是分子测定数字化的自动结果。然而，基于粒子的测定的高像素计数图像包含了超出分析物检测信号本身的大量信息。这些额外信息可以用来识别和过滤噪声和误差源，否则这些误差将不可避免地混入测定结果中。虽然历史上灵敏度的提高推动了免疫测定发展的创新，但对于POC和自我检测来说，可靠性和容错能力往往更为关键。许多临床相关的蛋白质生物标志物的浓度在皮摩尔（pM）或更高，许多免疫测定格式可以轻松检测到这些标志物。由分析前因素（如样本污染和不当处理）和分析后因素（如读数解释不明确）引起的诊断错误对现场测定开发构成了更大的挑战。原则上，基于图像的格式可以允许ML模型检测某些分析前错误，如溶血或样本量低，否则这些错误会混入样本读数中。在实际应用中，测定的变异系数（CV）通常比在受控条件下建立的检测限（LOD）更为重要。因此，迫切需要技术进步来提高测定的容错能力和简易性。在这项研究中，我们探索了基于ML的误差过滤方法，以提高基于图像的数字免疫测定的容错能力和性能。我们研究了基于金纳米粒子（AuNPs）聚集行为的生物标志物测定，但所采用的策略也广泛适用于其他信号报告分子，如形状等离子体纳米粒子、胶体粒子、荧光团或其他类型的报告分子。我们使用微升体积的血清和全血样本进行了CRP和抗SARS-CoV-2 IgG的功能化AuNP测定。通过暗场显微镜直接成像纳米粒子聚集，与批量光谱读数相比，灵敏度和动态范围都有了显著提高。虽然标准图像处理算法在某些情况下能够正常工作，但它们往往不够稳健，需要仔细的样本准备来最小化误差。我们尝试使用两种不同的ML策略来提高基于图像的数字测定性能。首先，基于像素分割的ML辅助策略在传统图像分析之前过滤图像伪影，虽然有所改进，但仍需要繁琐的训练。最后，通过将修改后的ResNet图像分类模型与目标正则化策略相结合，我们仅使用一个标签——分析物浓度——就高效地训练出了模型，消除了像素级标记的需要。使用大约10,000张图像和单个GPU就可以完成有效的训练。这种端到端图像回归方法与传统或混合ML分析有显著不同，因为它不需要用户定义的图像解释标准。图像中包含的所有有用信息都被利用起来，在高误差环境下提供了显著的性能提升。通过完整的ML分析，我们在全血微样本上实现了临床实验室级别的性能（例如与ELISA相当）（图1a）。这些发现突显了基于图像的数字免疫测定利用快速发展的ML能力的潜力。在保持高诊断准确性的同时，减少硬件和工作流程复杂性的能力是开发下一代POC诊断的关键步骤，这些诊断方法应具有鲁棒性、广泛可及性，并能满足全球健康需求。

图1：成像方法比光谱方法具有更好的动态范围。

基于功能化AuNPs的生物分子测定在诊断中得到广泛应用，包括侧向流动测定（LFAs）和批量溶液比色测定。在这些格式中，与AuNP结合的捕获剂（例如抗体、适配体、纳米体等）与目标分析物结合。两种捕获剂结合目标上的不同表位会导致粒子的交联或定位（例如夹心免疫测定）。或者，多价目标可以通过单个捕获剂使粒子交联。在LFAs中，信号通过将纳米粒子集中在指定的测试条位置来产生增强的光学密度；而在基于溶液的测定中，信号则通过纳米粒子寡聚化引起的颜色或光散射变化来检测。LFAs和基于溶液的测定通常通过批量光学读数进行分析，其中无法分辨单个粒子——只读取所有粒子的平均光学响应。然而，可以使用简单的技术（如暗场显微镜）直接成像单个纳米粒子。基于图像的测定利用显微镜直接解析整个纳米粒子分散，从而可以单独评估每个纳米粒子或簇。然后使用图像分析步骤来解释图像中的纳米粒子特征（例如平均纳米粒子簇大小、颜色或亮度），这些特征可以与分析物浓度相关联。基于图像的测定读数的一个重要优势是可以根据可定义的图像特征过滤掉各种形式的误差（例如灰尘、气泡、预聚集的粒子等）。为了评估基于图像的读数的性能优势，我们首先研究了一种经典的两种抗体夹心AuNP免疫测定方法，用于CRP的检测。直径为80 nm的AuNPs与两种CRP特异性抗体结合（图1b）。CRP分析物导致的抗CRP粒子聚集会产生一个红移的吸收-散射峰，这可以通过肉眼观察到，并通过紫外-可见光谱定量读取。通过将抗CRP粒子与不同浓度的CRP在血浆或全血中孵育来进行测定。随着CRP浓度的增加，吸收-散射光谱中的555 nm峰值减小（图1c）。555 nm吸收峰值的定量提供了可靠的测定结果，但由于较大聚集物的析出以及随着聚集物大小增加光谱变化变得不那么明显，其动态范围有限（图1d）。当直接成像同一样本溶液中的AuNPs时（图1e），可以看到许多聚集物，并且可以通过简单的图像处理技术进行量化。平均簇大小对CRP浓度提供了稳健的线性响应，其范围超过了比色测定的饱和极限30多倍（图1f）。成像读数轻松覆盖了CRP诊断的临床浓度范围（<1 mg/L至200 mg/L），而批量光谱读数无法覆盖这一范围。此外，我们展示了通过直接成像纳米粒子-样本混合物来进行分析物推断的方法——无需洗涤或分离步骤（图2）。商业人血样本中添加了外源性C-反应蛋白，孵育30分钟后进行成像。得到的图像中由于血红蛋白的存在而出现了明显的红色晕圈效应（图2b, c）。尽管如此，通过调整图像处理参数（阈值、高斯模糊半径等），可以轻松分离出纳米粒子。观察到CRP添加量与功能化纳米粒子的平均簇大小之间存在明显的线性关系。这表明，如果算法调整得当，基于图像的方法可以处理复杂的样本（如全血），而无需样本预处理。

图2：全血中的基于图像的CRP测定。

基于功能化AuNPs的生物分子测定在诊断中得到广泛应用，包括侧向流动测定（LFAs）和批量溶液比色测定。在这些格式中，与AuNP结合的捕获剂（例如抗体、适配体、纳米体等）与目标分析物结合。两种捕获剂结合目标上的不同表位会导致粒子的交联或定位（例如夹心免疫测定）。或者，多价目标可以通过单个捕获剂使粒子交联。在LFAs中，信号通过将纳米粒子集中在指定的测试条位置来产生增强的光学密度；而在基于溶液的测定中，信号通过纳米粒子寡聚化引起的颜色或光散射变化来检测。LFAs和基于溶液的测定通常通过批量光学读数进行分析，其中无法分辨单个粒子——只读取所有粒子的平均光学响应。然而，可以使用简单的技术（如暗场显微镜）直接成像单个纳米粒子。基于图像的测定利用显微镜直接解析整个纳米粒子分散，从而可以单独评估每个纳米粒子或簇。然后使用图像分析步骤来解释图像中的纳米粒子特征（例如平均纳米粒子簇大小、颜色或亮度），这些特征可以与分析物浓度相关联。基于图像的测定读数的一个重要优势是可以根据可定义的图像特征过滤掉各种形式的误差（例如灰尘、气泡、预聚集的粒子等），从而得到最终的分析物浓度。为了评估基于图像的读数的性能优势，我们首先研究了一种经典的两种抗体夹心AuNP免疫测定方法，用于CRP的检测。直径为80 nm的AuNPs与两种CRP特异性抗体结合（图1b）。CRP分析物导致的抗CRP粒子聚集会产生一个红移的吸收-散射峰，这可以通过肉眼观察到，并通过紫外-可见光谱定量读取。通过将抗CRP粒子与不同浓度的CRP在血浆或全血中孵育来进行测定。随着CRP浓度的增加，吸收-散射光谱中的555 nm峰值减小（图1c）。555 nm吸收峰值的定量提供了可靠的测定结果，但由于较大聚集物的析出以及随着聚集物大小增加光谱变化变得不那么明显，其动态范围有限（图1d）。当直接成像同一样本溶液中的AuNPs时（图1e），可以看到许多聚集物，并且可以通过简单的图像处理技术进行量化。平均簇大小对CRP浓度提供了稳健的线性响应，其范围超过了比色测定的饱和极限30多倍（图1f）。成像读数轻松覆盖了CRP诊断的临床浓度范围（<1 mg/L至200 mg/L），而批量光谱读数无法覆盖这一范围。此外，我们展示了通过直接成像纳米粒子-样本混合物来进行分析物推断的方法——无需洗涤或分离步骤（图2）。商业人血样本中添加了外源性C-反应蛋白，孵育30分钟后进行成像。得到的图像中由于血红蛋白的存在而出现了明显的红色晕圈效应（图2b, c）。尽管如此，通过调整图像处理参数（阈值、高斯模糊半径等），可以轻松分离出纳米粒子。观察到CRP添加量与功能化纳米粒子的平均簇大小之间存在明显的线性关系。这表明，如果算法调整得当，基于图像的方法可以处理复杂的样本（如全血），而无需样本预处理。

基于像素分割的ML辅助分析：虽然基于预定义标准的传统图像分析可以用来粗略分离图像伪影和功能纳米粒子，但这些方法仍然浪费了大量关于样本的信息。在这里，我们研究了一种基于像素级分割的ML辅助图像分析策略，以计算上分离真实信号和伪影。各种ML算法可以学习进行像素级分割，存在开源软件包可以方便地进行训练。在这种混合格式中，首先使用ML分离图像中的误差源，然后对ML过滤后的图像进行传统读数（例如平均簇大小），以推断分析物浓度。我们在患者样本中的抗SARS-CoV-2 IgG AuNP测定上进行了这种ML辅助分析。AuNPs与单一捕获蛋白SARS-CoV-2 RBD进行了功能化处理，这里称为RBD功能化粒子（图3a）。这些RBD功能化粒子在存在SARS-CoV-2 RBD特异性免疫球蛋白（G型和E型）的情况下表现出稳健的聚集（补充图1a, b）。使用ilastik中的像素分类工作流程生成训练图像，并用于训练随机森林（RF）ML算法（见方法部分）。尽管通过少量数据可以快速训练出RF模型，但这些模型缺乏鲁棒性，无法泛化到8-10张图像之外的情况。为了解决这一限制，我们构建了一个由七个RF模型组成的集成系统，每个模型都基于5-6张带有注释的图像（每张图像约50,000个粒子）进行训练，这些图像代表了不同的样本类型（血清、血液和PBS）以及不同程度的失焦情况。这种集成方法有助于保持模型的连贯性，并捕捉到更大的变异性。组合后的输出——45张完全像素标记的高分辨率（4K）图像——被用作U-net40的训练数据集。我们应用了PyTorch库中的标准数据增强技术来提高分割性能（详见方法部分）。结果，U-net在泛化能力上显著优于直接生成的RF模型，并能够快速将图像分割成相关的类别，如背景、纳米颗粒、灰尘和碎片。在对血液样本进行像素级分类并移除错误对象后（见图3b），可以量化纳米颗粒的平均簇大小，并将其映射到分析物浓度上（见图3c）。

图3：一种用于血清学检测的混合分割-计数方法。

这种图像的替代文本可能是使用AI生成的。

全尺寸图像：
a 金纳米颗粒检测的设计；抗SARS-CoV-2 RBD的抗体诱导了颗粒的聚集。
b 使用20倍暗场显微镜拍摄的全血样本中纳米颗粒聚集的示例图像。底部显示了分割模型产生的不同类别（金纳米颗粒、细胞、背景）的概率图，而原始图像位于上方。宽场图像的刻度尺为20微米，插图的刻度尺为2.5微米。
c 集簇大小的后期处理显示出一个近似幂律分布。
d 对来自两个患者组的生物库样本的簇大小进行量化：一组是COVID-19康复3周后的样本（阳性），另一组是2019年之前的样本（阴性）。
e 图d中分类检测的ROC曲线图。
f 当将平均纳米颗粒聚集面积≥9微米2分类为阳性时的分类检测指标。
g 分类检测的混淆矩阵。
h 混合方法（分割+传统方法）中可能存在的有损分析步骤示意图。

我们使用这种训练有素的像素分割算法来量化患者样本中的抗SARS-CoV-2 IgG。共测试了56个样本，包括26个真阴性（2019年之前的样本）和30个真阳性（PCR阳性，康复3周后的样本）。患者样本是在开放式微孔格式下成像的，这引入了高水平的传统误差，包括气泡、灰尘以及由于微孔液面造成的光学畸变（见补充图1c）。尽管存在这些挑战，数字分子检测仍能稳健地分类出COVID-19阳性样本（见图3d）。分割检测提供了稳健的分类统计结果（见图3e-g），包括96%的特异性和90%的敏感性——这与通常发现的COVID-19阳性患者约88%的血清转化率相匹配。这种使用像素分割进行错误过滤后进行传统分析的方法仍然依赖于最终图像分析步骤中预定义的颗粒特征（例如簇大小、颜色、亮度等）来推断分析物浓度。这种方法仍然未能充分利用图像中包含的大量分析物依赖信息（见图3h）。我们假设一种端到端的图像回归方法，可以将整个样本图像映射到分析物浓度上，有可能学习到哪些纳米颗粒特征最为重要，同时学会忽略光学畸变和其他伪影。

我们开发了一种端到端的图像回归方法来进行检测解释，通过在10,000张仅标记有分析物浓度的图像上训练一个修改过的ResNet-18模型（见图4a）来实现。大约每182个样本中有55张不重叠的图像，这些样本包含了不同浓度的抗SARS-CoV-2 IgG。标签对应于一个有7个浓度（0、16、64、256、1024、4096和16384 ng/μL抗SARS-CoV-2 IgG）的滴定数据集。数据集被分为测试组和训练组（164个训练样本，18个测试样本）。按样本而不是仅按图像进行分离对于确保模型泛化来自纳米颗粒属性而非样本特定伪影非常重要；因为几种类型的样本错误会跨越多张图像（例如纳米颗粒的附着模式或基底上的扩展划痕）。

图4：端到端回归模型与ELISA相当，但只有一个孵育步骤。

这种图像的替代文本可能是使用AI生成的。

全尺寸图像：
a 端到端机器学习模型工作原理的示意图。图像通过多个卷积层进行处理。更深层次的层可以捕捉颗粒的更抽象属性，并允许周围环境影响结果。
b 使用端到端ML模型的输出与混合分割+后期处理模型的输出进行抗SARS-CoV-2 IgG的滴定比较。
c 使用商业ELISA试剂盒进行抗SARS-CoV-2 IgG的滴定。
d 使用与成像检测中使用的相同颗粒的通用侧向流动试剂盒（LFA）进行抗SARS-CoV-2 IgG的滴定。
e 比较（b）中的单颗粒分析（SPA）方法、（c）中的ELISA方法和（d）中的LFA方法。

在我们的初步尝试中，ResNet模型的最后一层由一组神经元组成，这些神经元对应于模型旨在预测的类别数量（例如7个训练浓度）。使用这种分类方法，我们训练模型来预测未知样本图像属于哪个标记浓度。虽然有效，但这需要额外的插值方法来推断分类之间的样本浓度。接下来，我们测试了一个直接的回归架构，其中ResNet-18的最后一层只有一个输出神经元，仅用于预测分析物浓度的对数。这种单神经元输出策略，使用L1回归损失对对数浓度进行计算，表现显著更好。浓度估计是基于样本中20张图像的平均预测得出的。

将回归模型应用于已知抗SARS-CoV-2 IgG浓度的测试样本的结果显示在图4b中（红色轨迹）。混合ML方法（像素分割后进行传统特征处理）的结果也绘制在图4b中（绿色轨迹）以供比较。虽然混合ML-传统方法确实去除了误差源，但它显然受到仅分析纳米颗粒少数属性（如亮度和大小）的限制。虽然人类解释和机器解释之间没有直接的映射，但我们推测完整的回归模型依赖于随分析物浓度变化的图像属性谱。例如，在较低的分析物浓度下，颗粒密度和颜色比率等属性可能更为重要，而在较高浓度下，聚集大小和空隙面积等属性的权重更大。该模型不限于在整个检测范围内跟踪一个参数。我们使用拟合的Hill函数结合空白点和最低测量浓度周围的测量误差来量化检测限。回归模型在首次尝试中就达到了接近ELISA的能力，灵敏度为34.7 pM（5.2 ng/mL），动态范围为3.5个数量级——在这两个特性上都超过了混合ML-传统模型一个数量级以上。

为了进行基准比较，从传统的ELISA（代表临床实验室标准）和LFA（代表POC标准）检测中获得了类似的抗SARS-CoV-2 IgG滴定结果。ELISA使用商业测试试剂盒（Thermofisher）进行，灵敏度为2 pM（0.3 ng/mL），动态范围为3.9个数量级（见图4c）。为了与LFA进行直接比较，我们使用与基于图像的实验中相同的RBD功能化颗粒，使用通用LFA试剂盒（Abcam）创建了一个内部LFA。LFA试纸条被成像，并使用实验室扫描仪评估了测试条和对照条的相对强度（见材料和方法部分）。虽然LFA达到了0.32 nM（48 ng/mL）的相当灵敏度，但其动态范围很差，仅有一个数量级（见图4d），限制了其作为定量检测的用途。此外，我们使用实验室扫描仪量化LFA结果可能提高了其性能，超出了典型的POC应用。

除了核心检测指标（如灵敏度和动态范围）之外，这些检测的整体格式之间还有其他重要区别。对于基于血液的检测，ELISA和LFA通常需要血浆/血清分离步骤以避免来自全血的信号降解。相比之下，基于图像的ML方法可以直接用于全血，从而减少了所需的硬件复杂性。LFA以其快速周转时间而著称，基于图像的数字检测工作流程也显示了类似的周转时间。LFA和基于图像的数字检测都受到捕获和目标蛋白质之间主要孵育时间的限制，这取决于试剂与目标的结合和脱离速率。ELISA的工作流程通常要复杂得多，耗时3-5倍。这些比较在图4e中进行了总结。

基于图像的纳米颗粒检测的灵敏度本质上是单分子级别的，因此具有远远超过批量检测灵敏度的潜力。实际上，基于图像的检测的总体灵敏度限制由确定的分析物分子检测事件的数量以及区分这些事件与非特异性信号的能力决定。分析更多颗粒实际上增加了试验次数，从而通过计数统计减少了噪声。相比之下，对于ELISA等批量测量方法，增加样本体积并不会本质上提高灵敏度。事实上，它可能会稀释分析物浓度或引入额外的背景噪声，从而降低信噪比，使得检测低丰度目标变得更加困难。在下文中，我们提供了将纳米颗粒传感器的可测量物理属性与广泛数字检测实施条件下的相应检测灵敏度相关联的一般分析。下面的结果详细说明了如何通过调整检测中使用的颗粒数量来几乎无限制地调整检测灵敏度。这些分析通常适用于数字分子检测。ML错误过滤策略增加了可用颗粒的数量以及信号区分的准确性。

为了评估数字检测的灵敏度缩放规律，我们考虑了两个关键的检测特征：颗粒多分散性和内在光学对比度。虽然这项分析专注于颗粒聚集检测，但它通常适用于任何液滴或珠子数字检测格式。我们假设起始分布（见图5a）由具有高斯强度分布的单体组成，而现有的聚集体（二聚体、三聚体等）通过将此分布与其自身卷积来建模。因此，起始颗粒分散的质量由单体-二聚体对比度（由σ控制）和现有聚集体的比例（λ）决定，见图5b、c。那么，确定分析物检测限的关键问题就变成了：当分析物使颗粒从某个基线分布交联时，需要采样多少颗粒才能可靠地检测到差异？我们使用蒙特卡洛方法结合似然比测试来确定这种检测限如何依赖于σ和λ。这是通过从理论上的基线颗粒强度分布和交联颗粒强度分布中采样，然后计算似然比来完成的。对于本研究中描述的实验检测，5 μL血清样本与20 μL颗粒溶液混合，最终得到25 μL的测试混合物，其中含有约3亿个AuNps，因此在我们的模拟中从这些分布中采样的颗粒上限被四舍五入为1亿个。本研究中使用的功能化AuNps的基线颗粒强度分布为σ/μ=0.38和λ=0.14（见图5a）。使用这些颗粒，完整的ML检测通过采样约100万个颗粒实现了34.7 pM的灵敏度。这种实现的灵敏度与仅从基线颗粒强度分布预测的灵敏度相当。更高精度的纳米颗粒制造和纯化过程可以生产出多分散性更低的颗粒，从而显著提高检测灵敏度。然而，通过减少样本孵育中的颗粒数量（增加捕获分析物的颗粒比例），可以实现更大的灵敏度提升。减少粒子数量会以延长孵育时间和可能需要重新浓缩方法为代价。图5：基于粒子的检测方法具有可调节的灵敏度，这取决于粒子的数量。该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像显示了没有分析物的金纳米粒子（即基线）的示例。刻度尺为1.3微米。下面显示了粒子强度的直方图以及模型拟合结果。直方图中使用的模型由以下公式描述：(b) 一系列卷积正态分布的泊松加权混合模型用于近似初始粒子分布。顶部显示了模拟图像，展示了单体和二聚体的强度。c 图表展示了混合模型的不同参数如何影响聚集体的总粒子强度分布。d 通过蒙特卡洛方法确定的缩放定律（达到给定检测限所需的样本量）的线图。我们计算了缩放曲线，这些曲线显示了为了达到所需的分析检测限（σ, λ）需要采样的粒子数量（图5d）。本研究中使用的检测粒子位于浅绿色线的右侧。通过使用更高精度的制造和纯化工艺可以提高检测灵敏度，从而将多分散性降低到λ=1×10^-4，尽管成本会更高。最左边的黑线代表具有完美粒子和区分分布（σ=0, λ=0）的基本性能极限——这对应于任何检测方法都无法超越的随机感应极限。单体和二聚体强度值之间的重叠（σ）不如初始粒子分布的单分散性（低λ）那么重要。例如，即使单体和二聚体的强度分布有25%的重叠，也可以用100张图像的粒子可靠地检测到亚飞摩尔浓度。我们注意到，通过减少粒子总数可以达到阿托摩尔或仄摩尔级别的检测限（图5d）。这增加了捕获分析物的粒子比例，但代价是孵育时间变长。

讨论
在这里，我们研究了两种不同的机器学习（ML）策略来提高基于图像的检测性能：一种是结合像素分割和传统图像处理的混合方法，另一种是直接将图像映射到分析物浓度的端到端深度学习模型。虽然这两种方法都优于传统的检测方法，但后者在灵敏度和鲁棒性方面显著优于前者。混合方法有效地去除了背景噪声并提取了有用的纳米粒子属性，但它本质上受到预定义特征选择的限制。相比之下，端到端分类方法利用了所有可用的图像特征，并动态学习了哪些属性最能指示分析物浓度。这种自我纠正和从多种噪声源中学习的能力显著提高了动态范围、灵敏度、重复性和对错误及非熟练操作的总体容忍度。ML训练使用的是中等大小的数据集，这些数据集可以使用简单的实验室设备和单个GPU在几小时内轻松收集。对于特定的ML算法来说，在各种成像平台上为每个粒子批次进行训练是完全可行的。
本研究介绍了一种由ML驱动的数字分子检测方法，该方法在提高整体性能的同时降低了硬件复杂性。通过利用基于图像的分析和深度学习，我们展示了一个在灵敏度、动态范围和抗误差能力等关键指标上优于ELISA和LFA的系统。这一进展代表了朝着更易获取、更可靠和更可扩展的诊断解决方案迈出的关键一步，特别是对于即时检测（POC）和自我管理测试应用而言。这些进步是通过有限应用现代机器学习工具实现的。我们可以预期，更复杂的方法将带来进一步的进展。随着数字分子诊断领域的不断发展，计算智能与分子检测的结合具有巨大的潜力，可以通过使高质量诊断更加普及来改变医疗保健。

方法
金纳米粒子的结合和表征
所有检测中使用的信号报告剂是标称直径为80纳米的羧基化金纳米粒子（AuNPs）（NanoComposix，SKU: AUXR80-5M；光学密度20，相当于大约1.3×10^11粒子/mL）。纳米粒子通过碳二亚胺介导的酰胺偶联与抗体或重组蛋白结合，然后进行表面钝化处理，以确保在血清和全血中的胶体稳定性。
对于C反应蛋白（CRP）检测，两种单克隆抗CRP抗体（anti-C2，Abcam ab17452；anti-C6，Abcam ab244707）被结合到AuNPs上，生成双捕获夹心格式。对于抗SARS-CoV-2 IgG血清学检测，来自SARS-CoV-2刺突蛋白的重组受体结合域（RBD）蛋白（Abcam AB273065-1003）被结合到AuNPs上，以产生针对抗SARS-CoV-2免疫球蛋白的单捕获粒子。
在结合之前，立即在去离子水中准备了1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)碳二亚胺（EDC）和sulfo-N-hydroxysuccinimide（sulfo-NHS）的新鲜溶液，浓度为10 mg/mL。对于标准的1 mL结合反应，向1 mL悬浮在去离子水中的羧基化AuNPs中加入7 μL EDC溶液，然后加入14 μL sulfo-NHS溶液。混合物轻轻混合并在室温下旋转孵育30分钟，以激活表面羧基。
激活的粒子通过5000 × g离心5分钟收集。上清液小心去除后，将沉淀物重新悬浮在含有5 mM KH2PO4和0.5%（v/v）20 kDa PEG的1 mL反应缓冲液中，pH值为7.4。通过短暂涡旋和温和超声处理（< 30秒）重新悬浮粒子，以破坏松散的聚集体，而不损坏表面化学性质。
蛋白质结合是通过向激活的粒子中添加捕获蛋白来进行的，最终浓度为每mL纳米粒子溶液20 μg（例如，20 μL 1 mg/mL的蛋白储备液）。反应在室温下孵育2小时，以形成共价酰胺键。未反应的NHS酯随后通过加入5 μL饱和甘氨酸溶液（在去离子水中制备）来淬灭，然后再孵育10分钟。
结合和淬灭后，通过离心（5000 × g，5分钟）清洗粒子，并重新悬浮在新鲜的反应缓冲液中。这个清洗步骤重复两次，以去除未结合的蛋白质和反应副产物。最后一次清洗后，将粒子重新悬浮在含有0.5%（v/v）Tween-20的0.1× PBS中。
为了进一步稳定粒子并填充未占据的表面位点，进行了二次PEG化步骤。末端带有羧基的巯基终止PEG（SH-PEG-COOH，MW 6,000）以40 μg/mL的浓度溶解在0.1× PBS中。将等体积的PEG溶液和蛋白质结合的AuNPs混合，并在25°C下轻轻摇晃孵育6小时，或在4°C下过夜孵育。然后通过离心三次并重新悬浮在含有0.5% Tween-20的0.1× PBS中，储存至使用。
通过暗场显微镜观察到的分析物依赖性纳米粒子聚集来确认成功的结合和功能活性。在没有目标分析物的情况下，功能化的粒子在缓冲液和生物基质中保持胶体稳定性，并且只有在特定目标结合时才表现出强烈的聚集。没有进行额外的尺寸排阻色谱或亲和纯化。

比色批量检测
使用批量吸光度进行CRP检测，方法是将抗CRP AuNPs与不同浓度的重组CRP（Abcam AB283925-1003）一起孵育（0.78–166 mg/L）。在室温下孵育1小时后，使用光谱仪收集UV-可见光吸收光谱。量化555 nm处的吸光度，并将其归一化到不含CRP的对照样本。在500–700 nm范围内，光谱中出现了峰位移和聚集特征。

成像和样品制备
成像实验使用配备暗场聚光镜和SC180 CMOS相机的Olympus BX43F立式显微镜进行。使用20倍物镜（制造商指定的数值孔径）在暗场照明下获取图像，这使得可以直接观察到单个金纳米粒子和纳米粒子簇在暗背景下的情况。照明由显微镜的标准透射光源提供（在最大照明强度下），并在整个实验过程中保持不变。每次实验的相机曝光时间、增益和位深度都固定，以确保图像统计的一致性；除非另有说明，否则图像以未归一化的形式记录。
对于成像检测，样品通过将5 μL生物样品（血清、血浆或全血）与2 μL功能化金纳米粒子溶液和18 μL 0.1× PBS混合来制备，最终检测体积为25 μL。样品通过移液轻轻混合，并在室温（22–24°C）下孵育30分钟，不进行搅拌，以允许纳米粒子与分析物结合并达到准平衡。选择这个孵育时间是为了超过所使用的捕获试剂的特征速率，同时仍能与快速的即时检测工作流程兼容。
孵育后，将6 μL检测混合物转移到标准的75 × 25 mm玻璃显微镜载玻片上，并覆盖一个18 mm的方形盖玻片（厚度为1.5）。样品在安装后立即成像，以最小化沉淀和蒸发效应。选择成像视野以避免盖玻片的可见边缘或玻璃基底的明显缺陷。对于每个样品，获取多个不重叠的视野，以捕获纳米粒子和聚集体的代表性分布。
对于涉及全血的实验，使用商业来源的人血（Fisher Sci NC1570874），并按照供应商指定的抗凝剂进行处理。全血样品中加入重组分析物（CRP：Abcam AB283925-1003）或抗体标准品（IgG：Thermofisher MA535939），如相应的检测部分所述，并直接与功能化纳米粒子孵育，不分离血浆或血清。全血成像产生了额外的光学伪影，包括血红蛋白引起的颜色变化、红色晕圈效应和来自血细胞的增加的背景散射。这些效应被有意保留在数据集中，以评估算法在真实、高误差条件下的鲁棒性。全血CRP数据和全血IgG数据在不同的显微镜和不同的成像基底上收集（前者在方形毛细管中，后者在显微镜载玻片上），这就是为什么在IgG实验中红细胞更容易分辨的原因（图2b）。
在某些实验中，样品也在开放式微孔格式中成像，而不是在盖玻片下。这些微孔引入了额外的光学和几何变异性，包括液面引起的畸变、样品厚度的变化、灰尘污染和气泡形成。这些条件是有意设计的，用于测试传统的图像分析流程和基于机器学习的方法，并不代表优化的检测配置。
除非另有说明，否则所有图像分析都是在原始图像上进行的。图中显示的图像仅为了可视化目的进行了对比度增强，并未用于定量分析。每个样品获取的图像数量和视野的分布是为了在统计采样粒子群体和实际成像吞吐量之间取得平衡。

混合像素级分割和传统图像处理
我们使用的像素分割模型是在一组图像上训练的Unet，每张图像都用ilastik创建的7个随机森林分类器（RFC）模型之一进行标记。RFC的训练图像包括纳米粒子簇和背景元素，如血细胞、气泡和其他伪影。ilastik使用的RFC模型在均匀的数据集上表现良好，但在更广泛的图像集合上无法泛化。因此，将5-10张图像分组以保持RFC的性能，并训练了7个不同的RFC模型，以覆盖数据集中的图像多样性。我们注意到，使用多个类别（背景、粒子、血细胞、亮碎片等）训练RFC比简单的背景/前景方法表现更好。在涉及人血的图像中（图3b），将1 μg的重组抗SARS-CoV-2抗体（Thermofisher MA535939）加入到1 mL全血（Fisher Sci NC1570874）中。
随后使用标准的数据增强技术在像素分类图像上训练Unet。Unet训练完成后，根据它们属于粒子类别的概率对图像进行分割。概率图的后期处理包括形态学过滤、尺寸排除、分水岭过滤和基于形状的过滤，以分离不同的对象。使用scikit-image库为Python提取了聚类指标，如平均面积、亮度和形状描述符。

端到端深度学习模型训练
使用PyTorch库中的ResNet-18骨架开发了一个端到端的图像回归模型：visionnaire.models.resnet18。总共使用了182个样本的10,000张暗场图像来训练模型，样本浓度在7个水平（0到16384 ng/μL）之间变化。数据按样本分为训练集（164个样本）和测试集（18个样本），以确保由于重复但非重叠的同一样本成像而不会导致数据泄露。模型在未归一化的图像上训练。最终回归层输出一个标量，对应于浓度的自然对数，零浓度标记为-0.6931，而第二低浓度（16 μg/mL）标记为2.773。模型性能在单独的测试集上进行了验证，该测试集使用了每个样本20张图像的平均预测结果。临床血清样本的获取和伦理及生物样本处理遵循相关规范。人类血清样本（n=56）来自Precision for Medicine（位于马萨诸塞州诺顿市），这些样本是去标识化的生物库样本。该队列包括30份临床COVID-19阳性血清样本和26份COVID-19阴性对照样本。Precision for Medicine确认所有生物样本均来自活体捐赠者，通过静脉采血（通常是从肘静脉）获得，采血过程是在机构审查委员会（IRB）和/或独立伦理委员会（IEC）批准的临床研究下进行的，符合《赫尔辛基宣言》和当地法规（45 CFR 46；21 CFR 56）。该研究的协议名称为P4M060，由Advarra IRB批准。已获得知情同意（21 CFR 50），或者样本符合FDA关于去标识化剩余样本的标准（2006年）。阳性样本采集于2020年10月至2021年2月期间，捐赠者的SARS-CoV-2感染通过PCR检测得到确认（阳性检测时间为7-21天）。对照样本采集于2018年10月至2019年1月期间。血液样本通过离心分离成1毫升的血清等分液，并在运输前长期冷冻保存在≤-20°C的温度下。阳性样本的选择基于PCR诊断结果确认以及至少1毫升的等分液体积要求。作者无法获取可识别的私人信息。

BRISQ一级指南表：
| 项目编号 | 数据元素 | 报告信息/状态 |
|---------|---------|---------|
| I.a. | 生物样本类型 | 人类血清样本（n=56） |
| I.a.1. | 解剖/采集部位 | 静脉采血（通常从肘静脉） |
| I.a.2. | 生物样本疾病状态 | 30份COVID-19阳性样本；26份COVID-19阴性对照样本 |
| I.b. | 临床特征 | 阳性队列：PCR结果确认的捐赠者（主要在检测后7-21天内）。阴性队列：包括II型糖尿病、高血压和哮喘等多种临床状况；包括“从未吸烟”、“曾经吸烟”和“当前吸烟”者 |
| I.b.1. | 生命状态 | 样本来自活体捐赠者 |
| I.b.2.1. | 诊断（临床） | 阳性队列：PCR确认的COVID-19。阴性队列：根据采集日期（2018年10月至2019年1月）推断为阴性，此时SARS-CoV-2尚未广泛传播 |
| I.b.2.2. | 诊断（病理） | 不适用（液体活检/血清研究） |
| II.a. | 采集方式 | 静脉采血 |
| III.a. | 稳定机制 | 离心分离 |
| III.b. | 长期保存 | 冷冻保存 |
| III.b.1. | 防腐剂组成 | 无（1毫升血清等分液） |
| IV.a.1. | 保存温度 | 保持冷冻在≤-20°C |
| IV.a.2. | 保存时间 | 大约1-3年（采集于2018-2021年；分析于2022年） |
| IV.b.1. | 运输温度 | 冷冻状态；2022年2月9日通过FedEx Priority Overnight运输 |
| V.a. | 组成与选择 | 根据PCR结果或采集日期（对照样本为2019年之前）以及1毫升等分液的可用性进行选择 |

对于分类实验（使用分割+传统特征分析），每个样本的两张图像在三个重复孔中进行分析（总共6张图像），并在添加纳米粒子混合物后进行成像，具体步骤如上所述。性能指标（如阳性预测值和假阳性率）是根据模型输出计算得出的。

ELISA和侧向流动检测：ELISA比较使用了Thermofisher公司的Human SARS-CoV-2 Spike（三聚体）IgG ELISA试剂盒（BMS2325）。检测按照制造商说明进行。吸光度在450纳米处使用微孔板读取器读取。检测限和动态范围是根据标准曲线计算得出的。侧向流动检测是在实验室内部使用Universal LFA试剂盒（Abcam AB270537-1001）和上述RBD功能化的AuNPs作为报告剂组装的。测试条使用实验室扫描仪（Azure Biosystems 600）进行成像，条带强度使用Python进行量化。

蒙特卡洛假设检验：在相机的检测范围内，粒子强度在聚集过程中会趋于混合（二聚体强度是单体分布的自卷积）。基线粒子强度分布包含单体、二聚体、三聚体和其他更高阶物种的混合物。为了简化基线强度分布的建模，我们选择将其近似为正态分布的混合（因为正态分布在卷积下是封闭的）。对于简单的交联过程，一个粒子将根据二项分布参与j次交联事件，由于N很大（>1百万），概率很小（<0.1），因此我们对单体、二聚体等组分分布选择了泊松加权。因此，我们创建了一个基线分布形式为：\(B\left({{\rm{\lambda}}},{\mu},{\sigma}\right)={\sum}_{i=1}^{i=20}{{\rm{Poisson}}}\left(i-1;{\rm{\lambda }}\right){\rm{Normal}}\left(i{\mu},i{\sigma}\right)\)。这里，\({\rm{\lambda }}\)表示基线粒子的多分散性。较低的\({\rm{\lambda }}\)意味着更多的单体。接下来，我们引入了一个交联率\(k\)，范围从0.1到1e-8。为了“交联”基线分布，我们首先将基线分布与其自身卷积4次，然后创建一个新的混合分布\(M\left(k,{\rm{\lambda }},{\mu},{\sigma}\right)={\sum }_{j=1}^{4}{{\rm{Poisson}}}\left(j-1;k\right){B}_{j}\left({{\rm{\lambda }}},{\mu},{\sigma}\right)\)，其中\({{B}_{j}}\left({{\rm{\lambda }},{{\mu }},{{\sigma }}\right)\)是基线与其自身的第j次卷积结果。由于对应于更高阶聚集体的正态组分系数很快降至1e-12以下，因此只考虑了四次自卷积。

为了进行假设检验，从基线\(B\left({\rm{\lambda }},{\rm{\mu }},{\sigma }}\)和交联分布\(M\left(k,{\rm{\lambda }},{\rm{\mu }},{\rm{\sigma }}\)中抽取了300个大小为n的样本（n从1e1到1e8不等）。对B和M样本计算了对数似然比\(\Lambda\)，从而得到零假设和备择假设的对数似然比统计量分布。对于基线B样本，使用了0.05的I型错误（\({\rm{\alpha }}）水平；即选择了一个阈值，使得只有5%的B样本的\(\Lambda\)值大于该阈值。然后计算了II型错误率\({\rm{\beta }}\)，即M样本中产生低于该阈值的\(\Lambda\)值的比例。如果功效\(\left(1-{\rm{\beta }}\)低于0.95，则尝试更大的样本量（n），直到达到足够的功效。

交联率\(k\)大约是更高阶物种的比例。由于我们的实验每个样本使用了大约1亿个粒子，因此通过假设完美交联并将k乘以1亿个交联剂转换为浓度（在25微升中）。对于不完全交联的情况，例如1 pM的结合剂，使用简化的平衡分析，意味着每个交联剂有超过99%的结合概率，从而略微将比例曲线向右移动。

所有数据分析均使用Python（NumPy、SciPy、scikit-image和PyTorch）完成。除非另有说明，数据以平均值±标准误差（SEM）的形式报告。每个报告的浓度代表来自独立生物样本的测量结果，每个样本获取了多个不重叠的图像场。对于基于图像的检测，分析物浓度估计来自聚合图像指标（混合分析）或每个样本多张图像的平均预测（端到端回归）。样本级别的预测是通过平均20张图像的模型输出来计算的，以减少视野变异性。

检测限（LOD）是根据“空白”值加上2σ的测量值使用Hill函数估计的。饱和度限（LOS）是根据“拟合饱和度”值加上2σ的测量值使用Hill函数估计的。动态范围定义为log10(LOS/LOD)。对于临床分类实验，阳性预测值（PPV）和假阳性率是根据标准定义计算的，但没有包括先验的患病率加权。蒙特卡洛假设检验用于估计灵敏度缩放定律，显著性水平α=0.05，统计功效（1 ? β）≥0.95。没有使用统计方法预先确定样本量。除非明确说明，否则没有数据点被排除。