《Plants》：Rate-Dependent Effects of Black Soldier Fly Frass on Germination, Shoot Growth, and Nodulation of Forage Legumes
Simon Hodge,
Larisa-Georgiana Ciobanu and
Brian Gormley
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Jacalin相关凝集素（JRLs）在植物适应非生物和生物胁迫中发挥关键作用。水稻基因组编码四个推定的jacalin相关凝集素激酶基因（OsJacLKs），但其对环境胁迫的功能仍大多未表征。本研究证明，推定的jacalin相关凝集素激酶OsJacLK1赋予了对
Jacalin相关凝集素（JRLs）在植物适应非生物和生物胁迫中发挥关键作用。水稻基因组编码四个推定的jacalin相关凝集素激酶基因（OsJacLKs），但其对环境胁迫的功能仍大多未表征。本研究证明，推定的jacalin相关凝集素激酶OsJacLK1赋予了对稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）的抗性，而非耐盐性。OsJacLK1蛋白表现出凝集活性以及对几丁质、真菌细胞壁和甘露糖的亲和力。OsJacLK1受胁迫相关植物激素水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA）和吲哚乙酸（IAA），以及盐度、几丁质和M. oryzae接种的转录激活，表明其参与广泛的胁迫响应信号通路。在水稻中过表达OsJacLK1导致对稻瘟病易感性降低，而功能缺失型osjaclk1株系在感染后与野生型植株相比未显示出显著表型差异。OsJacLK1过表达株系中增强的抗性与更强的活性氧（ROS）爆发和升高的过氧化氢积累有关，并伴有防御相关基因（OsRac1, OsSGT1, OsMAPK6, OsPAL1, OsNAC4, OsPBZ1, OsAOS2, 和OsJAZ8）的上调。总之，研究结果确定OsJacLK1是水稻抗M. oryzae免疫的正调控因子，调节细胞氧化还原状态，突显了其作为水稻抗病遗传改良候选基因的潜力。
研究背景与意义
水稻（Oryza sativa L.）作为全球粮食安全的关键作物，常受到盐度和稻瘟病（由Magnaporthe oryzae引起）的严重威胁。Jacalin相关凝集素（JRLs）是一类重要的植物应激调节因子，但水稻中30个JRL基因的大多数功能仍未阐明，特别是含有蛋白激酶结构域的Jacalin相关凝集素激酶（JacLKs）。尽管已知某些JRLs参与盐胁迫耐受，但OsJacLK1作为一种推定的JacLK，其在水稻免疫及非生物胁迫中的具体机制尚不明确。本研究旨在解析OsJacLK1在水稻应对盐胁迫及稻瘟病菌侵染中的生物学功能及其分子机制，相关成果发表在《Plants》期刊。
关键技术方法
研究人员主要通过生物信息学分析预测OsJacLK1的结构特征；利用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除株系（osjaclk1-14, osjaclk1-34），并利用玉米泛素启动子构建过表达株系（OE-2, OE-11）；通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析基因转录水平；采用Western blot检测蛋白与几丁质的结合能力；利用化学发光法监测几丁质寡聚糖触发的活性氧（ROS）爆发，并通过DAB染色观察过氧化氢积累；最后通过稻瘟病菌（Guy11菌株）的喷雾接种和打孔接种评估水稻抗病表型。
研究结果
1. OsJacLK1的生物信息学表征
研究人员通过序列比对发现，OsJacLK1包含一个N端Pkinase结构域和两个C端jacalin结构域。系统发育分析显示，OsJacLK1及其同源物主要分布在禾本科植物中。虽然其保留了ATP结合的保守基序（如GxGxxG），但催化核心基序HXD被HKN取代，暗示其可能缺乏自磷酸化活性，属于假激酶或激酶样蛋白。
2. OsJacLK1的凝集素活性表征
重组OsJacLK1蛋白表现出凝集素活性，其最低致敏浓度为125 μg/mL。碳水化合物结合实验证实，OsJacLK1能够特异性地结合甘露糖以及多种形式的几丁质，包括商业几丁质磁珠、蟹壳几丁质、壳聚糖以及M. oryzae的真菌细胞壁和几丁质，表明其具备作为模式识别受体（PRR）感知病原体相关分子模式（PAMP）的潜力。
3. OsJacLK1受胁迫相关植物激素激活
转录分析显示，OsJacLK1受多种激素强烈诱导。水杨酸（SA）处理6小时使其表达量升高约20倍；茉莉酸甲酯（MeJA）处理12小时和36小时分别出现两个峰值（约55倍和58倍）；脱落酸（ABA）和吲哚乙酸（IAA）也分别在早期时间点（6小时）诱导其表达显著上调。这表明OsJacLK1处于多种激素信号通路的交汇点。
4. OsJacLK1对盐胁迫的响应
组织特异性表达分析显示OsJacLK1在根中高表达。盐胁迫处理下，根部基因表达在12小时显著诱导，72小时略有升高；叶片中则随时间推移缓慢上升，72-96小时达到峰值（约2.3倍）。尽管存在转录水平的诱导，但后续表型分析表明其可能不是盐胁迫耐受的主要决定因子。
5. OsJacLK1受几丁质寡糖和稻瘟病菌激活
OsJacLK1对几丁质寡糖的响应迅速且短暂，1.5小时达到峰值（3.08倍）。在M. oryzae接种后，其表达延迟但显著诱导，24小时达到最高（5.44倍），随后逐渐下降，表明其参与了稻瘟病菌侵染早期的免疫反应。
6. OsJacLK1可能对水稻耐盐性并非必需
通过构建过表达和CRISPR/Cas9敲除株系，研究人员发现，尽管OsJacLK1在转录水平上响应盐胁迫，但在150 mM NaCl处理7天后，过表达株系、敲除株系与野生型中花11（ZH11）在存活率和表型上均无统计学显著差异，提示OsJacLK1可能在盐胁迫中功能冗余或非必需。
7. 过表达OsJacLK1增强水稻对M. oryzae的抗性
表型分析显示，在喷雾接种和打孔接种两种实验中，OsJacLK1过表达株系（OE-2, OE-11）均表现出显著更小的病斑面积和更低的真菌生物量积累；而基因敲除株系（osjaclk1-14, osjaclk1-34）的感病性与野生型无显著差异。这证实了OsJacLK1在水稻抗稻瘟病中的正调控作用。
8. OsJacLK1触发水稻防御反应
机制研究表明，在OsJacLK1过表达株系中，多个防御相关标记基因（包括OsRac1, OsSGT1, OsMAPK6, OsPAL1, OsNAC4, OsPBZ1, OsAOS2和OsJAZ8）的表达显著上调。同时，过表达株系在几丁质诱导下表现出更强的ROS爆发，且在接种M. oryzae后48小时，DAB染色显示其叶片中积累了更高水平的过氧化氢，而敲除株系则相反。
结论与讨论
综上所述，研究人员确定OsJacLK1是一个正调控水稻抗M. oryzae免疫的因子。其结构特征暗示其可能作为支架蛋白而非催化酶发挥作用。OsJacLK1能够感知几丁质等PAMP，并通过激活OsRac1-OsMAPK6信号级联和调控SA/JA相关基因，引发强烈的ROS爆发和防御基因表达，从而限制病原菌侵染。尽管其对盐胁迫的转录响应有限且表型不显著，但其在抗病育种中的潜在应用价值值得关注。该研究揭示了OsJacLK1在水稻先天免疫中的关键作用，为作物抗病遗传改良提供了新的靶点。
