MMDFRNet：动态跨模态解耦与对齐技术，用于实现鲁棒的大米成像 作者：傅廷岩（Tingyan Fu）、葛佳（Jia Ge）和田淑芳（Shufang Tian）

《Remote Sensing》：MMDFRNet: Dynamic Cross-Modal Decoupling and Alignment for Robust Rice Mapping Tingyan Fu, Jia Ge and Shufang Tian

　　摘要 与jacalin相关的凝集素在植物适应非生物和生物胁迫中发挥着关键作用。水稻基因组编码了四个潜在的与jacalin相关的凝集素激酶基因（OsJacLKs），但它们在应对环境胁迫方面的功能仍大部分未被研究。本研究表明，一种潜在的与jacalin相关的凝集素激酶OsJacLK1能够提高植物对稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）的抵抗力，而不是对盐胁迫的抵抗力。OsJacLK1蛋白表现出凝集活性，并对几丁质、真菌细胞壁和甘露糖具有亲和力。OsJacLK1可通过与胁迫相关的植物激素（水杨酸（SA）、甲基茉莉酸（MeJA）、脱落酸（ABA）和吲哚乙酸（IAA）以及盐度、几丁质和稻瘟病菌感染而转录激活，这表明它参与了广泛的胁迫响应信号通路。在水稻中过表达OsJacLK1可以降低对稻瘟病的敏感性，而功能缺失的osjaclk1品系在感染时与野生型植物没有显著表型差异。OsJacLK1过表达品系的增强抗性伴随着活性氧（ROS）的产生和过氧化氢的积累增加，同时相关性防御基因（OsRac1、OsSGT1、OsMAPK6、OsPAL1、OsNAC4、OsPBZ1和OsJAZ8）的表达上调。综上所述，我们的发现证实OsJacLK1作为水稻对稻瘟病菌免疫的正向调节因子，通过调节细胞氧化还原状态发挥作用，显示出其在水稻抗病遗传改良中的潜力。

1. 引言
水稻（Oryza sativa L.）是主要的主食作物，对全球粮食安全至关重要[1,2]。其种植经常受到各种环境胁迫的影响，这些胁迫会显著影响生长、发育、产量和品质[3,4]。在这些胁迫中，盐度是最有害的非生物因素之一，会严重损害水稻和其他作物的生长、发育和生产力[5,6]。同时，由丝状真菌Magnaporthe oryzae引起的水稻瘟病对水稻生产构成重大威胁，可感染叶片、茎秆、穗和根部，导致11%至30%的产量损失[7,8]。因此，了解盐耐受性和抗稻瘟病机制对于培育能够抵御胁迫的强健水稻品种至关重要。

凝集素是一类多样的非酶促性碳水化合物结合蛋白或糖蛋白，在动物、植物和真菌中普遍存在。这些分子具有多种生物功能，包括抗病毒、抗肿瘤、抗菌、抗真菌和杀虫活性，这些活性是通过其特异性识别和结合碳水化合物结构实现的[9,10]。与jacalin相关的凝集素（JRLs）是凝集素超家族中的一个独特亚群，其特征是含有一个或多个jacalin结构域[10,11]。它们被分类为半乳糖结合亚家族和甘露糖结合亚家族，其中原型jacalin血凝素来自Maclura pomifera，能特异性识别Gal-β-(1,3)-GalNAc残基[12]，而向日葵蛋白Helja则结合甘露糖并通过诱导细胞毒性来抑制Sclerotinia sclerotiorum的生长[13,14]。除了在体外具有碳水化合物识别和抗真菌及抗肿瘤活性外，与jacalin相关的凝集素越来越多地被认为在植物生长、发育和胁迫响应中起着关键调节作用[15]。例如，沉默小麦基因TaJRLL1会降低对Fusarium graminearum和锈菌Blumeria graminis的抵抗力，而在拟南芥中的异源表达则增强了对其的抵抗力[16]。类似地，烟草中过表达甘露糖结合凝集素Ta-JA1可以提高对病原细菌、真菌和病毒的抵抗力，并增加大麦对稻瘟病菌（M. oryzae）和Puccinia hordei的抵抗力[17,18]。根部分积的jacalin，如大麦中的HvHorcH[19]和拟南芥中的JAL10[20]，已被证明可以正向调节盐耐受性。此外，在水稻中外源表达甘蔗定向-jacalin基因（ShDJ）可以提高 drought 耐受性和植物生物量积累[21]。

在水稻中，预测并鉴定了30个与jacalin相关的凝集素基因，将其分为单jacalin结构域类型（merojacalins，占16/30）、多jacalin结构域类型（holojacalins，占1/30）以及其他与功能性结构域融合的嵌合类型（chimeric jacalins，占13/30）[22]。尽管这些基因数量众多，但只有少数在功能上得到了研究，尤其是在与胁迫响应相关方面。值得注意的是，含有jacalin和定向结构域的嵌合型凝集素OsJAC1能够增强对多种病原体（包括M. oryzae、Rhizoctonia solani和Xanthomonas oryzae）的抵抗力[23,24,25]。在拟南芥中过表达OsJAC1可增强对电离辐射的抵抗力[26]。另一个研究较多的jacalin基因OsMBL1（也称为SalT或Orysata, JRL）是一种多功能merojacalin，它通过竞争与M. oryzae几丁质酶MoChi1的结合来增强抗稻瘟病能力，并通过抑制水稻中的几个负调控因子来调节防御信号[28,29,30]。过表达OsMBL1的水稻品系表现出对盐胁迫的增强耐受性[31]，但对寒冷的耐受性降低[32]。此外，其他JRLs如JRL40和JRL45也在盐耐受性中起积极作用，这突显了这一家族在胁迫适应中的多样性和关键作用[30,31,32,33,34,35]。水稻基因组编码了四个潜在的与jacalin相关的凝集素激酶（JacLK）基因，这些基因包含一个Pkinase结构域和至少一个jacalin结构域。大多数JacLK基因存在于禾本科植物中[22,36]，表明这些基因可能在禾本科植物的特定免疫或环境适应机制中起作用。然而，它们的生物功能，尤其是在耐受性方面的功能仍不清楚。通过RNA-seq分析，发现水稻中的OsJacLK1（LOC_Os11g39530）在M. oryzae感染早期阶段就被转录激活[22]，这表明它可能参与水稻的免疫反应。因此，我们研究了其对外源性刺激（包括植物激素、盐胁迫和M. oryzae感染）的响应。为此，我们生成了过表达品系和基因敲除品系，并评估了它们对盐胁迫耐受性和抗稻瘟病能力的贡献。我们发现，在测试条件下，OsJacLK1突变体与野生型ZH11在盐胁迫下没有差异；然而，OsJacLK1的过表达增强了抗稻瘟病的抵抗力。我们进一步阐明了其背后的分子机制，包括活性氧（ROS）动态和防御基因的激活。我们的工作证实OsJacLK1作为水稻对M. oryzae免疫的正向调节因子，强调了其在抗病遗传改良中的潜力。

2. 结果
2.1. OsJacLK1的生物信息学特征
OsJacLK1编码一种潜在的jacalin凝集素丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，含有一个N端Pkinase结构域和两个jacalin结构域（图1a）。OsJacLK1的C端区域包含一个糖胺聚糖结合基序GXXXD（例如GGSGD）、N-糖基化位点（411NGS、551NRT）和O-糖基化位点（如251TPS、270SPS等），表明OsJacLK1是一种碳水化合物结合蛋白。此外，该蛋白序列还含有多个磷酸化位点，如138S、145T、146T、152T、196S、270S、433S、461S等。为了研究OsJacLK1的系统发育关系，我们使用OsJacLK1及其植物同源物的氨基酸序列构建了一个系统发育树。JacLKs在植物界中的分布相对狭窄，主要存在于谷物作物（水稻、玉米、小麦、大麦和高粱）以及少数非谷物物种中，如落基山翠雀（Aquilegia coerulea）和地苔（Physcomitrium patens）（图S1a）。OsJacLK1及其水稻同源物与玉米和小麦中的同源物位于同一分支上。这个特有于禾本科植物的亚群明显与翠雀和地苔的JacLK序列分开。
图1. OsJacLK1蛋白的生物信息学特征。(a) OsJacLK1蛋白结构域的示意图；(b) 与不活化受体样激酶（AtBIR1、AtZED1、AtCORYNE、AtBIR2）和活化受体样激酶（AtBR1、AtFLS2、AtCRK41、AtCRPK1、OsCERK1）的多序列对比；(c) OsJacLK1的三维视图（SWISS-MODEL）。左图为OsJacLK1的二级结构；中间为Pkinase结构域中的ATP结合位点和催化位点；右图为jacalin结构域中的碳水化合物结合基序。
为了评估JacLK蛋白的催化潜力，我们对植物中的JacLK同源物（图S1b）以及典型的不活化/活化受体样激酶（图1b）进行了多序列比对。OsJacLKs及其同源物都同时具有N端激酶结构域和C端jacalin结构域。与不活化/活化受体样激酶相比，OsJacLK1保留了多个参与ATP结合和磷酸稳定的基序：磷酸锚定基序GxGxxG（甘氨酸环）、ATP锚定基序IAVK（β3-赖氨酸）、α-C螺旋谷氨酸基序、DFG基序和PPE基序（图1b,c），这些基序也在JacLK同源物中观察到。核心催化基序HXD（通常为HRD）在OsJacLK1中缺失或被替代，而在其同源物中存在。这表明OsJacLK1可能能够结合ATP，但可能缺乏自我磷酸化活性，无法催化磷酸转移到底物蛋白上。

2.2. OsJacLK1的特性
在血凝试验中，使用Concanavalin A（ConA）作为阳性对照，表现出强烈的血凝活性，而单独的GST标签蛋白和缓冲液对照对兔红细胞没有检测到血凝活性。重组OsJacLK1蛋白在最低浓度125 μg/mL时表现出血凝活性（图2a）。
图2. 凝集素活性检测和OsJacLK1的表达模式。(a) 重组GST-OsJacLK1的凝集活性检测。GST、PBS蛋白缓冲液和牛血清白蛋白（BSA，1 mg/mL）作为阴性对照；(b) 重组GST-OsJacLK1的碳水化合物结合检测。上图表示与不溶性多糖几丁质磁珠、蟹壳几丁质、M. oryzae的真菌细胞壁、M. oryzae的几丁质和甘露糖共同沉淀的GST-OsMBL1；下图表示上清液部分。对于P和S，模拟GST蛋白仅停留在上清液中。我们使用抗GST抗体通过免疫印迹法检测到了GST标签蛋白。我们还评估了OsJacLK1重组蛋白的碳水化合物结合特性（图2b），发现它对甘露糖和多种形式的几丁质具有亲和力，包括商业几丁质珠、蟹壳几丁质颗粒、去乙酰化几丁质衍生物（壳聚糖）、M. oryzae细胞壁和M. oryzae几丁质（图1b，上层）。这些结果表明OsJacLK1是一种凝集素，能够结合几丁质和甘露糖。

2.3. OsJacLK1被胁迫相关植物激素激活
为了探索OsJacLK1在激素介导的防御反应中的潜在作用，我们在野生型水稻中监测了其转录水平，处理了水杨酸（SA，1 mM）、甲基茉莉酸（MeJA，100 μmol/L）、脱落酸（ABA，10 μM）和吲哚乙酸（IAA，20 μM），以水处理植物作为对照。在SA处理下（图3a），OsJacLK1的表达显著增加，在3小时时增加了约15倍，在6小时时达到峰值20倍，而水对照组的表达始终较低。虽然6小时后表达下降，但在36小时内仍显著高于对照组（7-8倍）。到48小时时，SA处理的表达急剧下降至0.17，低于对照组（0.24），表明OsJacLK1作为对SA的早期响应被激活。
图3. OsJacLK1对植物激素的转录响应。(a) 水杨酸（SA）；(b) 甲基茉莉酸（Me-JA）；(c) 脱落酸（ABA）；(d) 吲哚-3-乙酸（IAA）。数据以平均±标准差表示；*表示p < 0.05的显著差异（单因素方差分析）。
在Me-JA处理下（图3b），OsJacLK1的转录水平显示出强烈但波动的诱导模式。6小时时表达上升5倍，在12小时达到峰值55倍，然后在24小时突然降至对照水平（1.92 vs. 2.44）。36小时时出现第二个峰值（58.10 vs. 4.17），之后在48小时再次下降（2.65 vs. 3.28），表明OsJacLK1在JA介导的防御响应的早期信号通路中可能起作用。
在ABA处理下（图3c），OsJacLK1的表达迅速增加，在6小时达到峰值4.0（对照为1.28）。12小时和24小时时表达仍高于对照组，36小时时回升（3.0 vs. 1.5），然后在48小时降至接近对照组水平（0.97 vs. 1.22），表明ABA上调了OsJacLK1的表达，尤其是在早期阶段。
在IAA处理下（图3d），OsJacLK1的表达迅速增加，在6小时达到峰值4.0（对照为1.28）。12小时和24小时时表达保持较高水平，36小时时反弹（3.0 vs. 1.5），然后在48小时下降（2.65 vs. 3.28），表明ABA上调了OsJacLK1的表达。

2.4.OsJacLK1 对盐胁迫具有响应性
我们检测了水稻品种 Zhonghua 11 (ZH11)、Nipponbare (NPB) 和 CO39 的不同组织（根、茎和叶）中 OsJacLK1 的转录表达。在根中检测到 OsJacLK1 的高表达，而在茎和叶中的表达水平较低（图 S2）。随后，我们监测了盐胁迫下 OsJacLK1 在根和叶中的响应模式。在根中，盐处理（NaCl）在 12 小时显著诱导了 OsJacLK1 的表达。然而，在 24 小时后，其表达基本没有变化，只是在 72 小时时较对照组略有增加（约 1.5 倍）（图 4a）。在叶中，OsJacLK1 的表达逐渐增加，到 72-96 小时达到峰值（约 2.3 倍）（图 4b），表明 OsJacLK1 对盐胁迫表现出适度的转录响应。
图 4. 盐胁迫下根和叶中 OsJacLK1 的表达水平。(a) 根；(b) 叶。数据以平均值 ± 标准差表示；* 表示 p < 0.05 的显著差异（单因素方差分析）。

2.5. OsJacLK1 可被几丁质寡糖和稻瘟菌激活
在几丁质寡糖处理下（图 5a），OsJacLK1 基因的表达迅速被诱导，在 1 小时时升高到 2.45 倍，并在 1.5 小时时达到峰值（3.08 倍），而对照组水平为 0.84-1.03 倍。表达逐渐下降，在 3 小时时降至 2.15 倍，并在 6 小时时接近对照组水平（1.21 对 1.03）。这些结果表明，OsJacLK1 在信号感知的早期阶段对几丁质寡糖有快速但短暂的上调反应。
图 5. OsJacLK1 对几丁质和 M. oryzae 的动态变化。(a) 几丁质寡糖 (500 μg/mL) 对 OsJacLK1 的转录诱导。(b) 用 M. oryzae 菌株 Guy11 接种后 Zh11 中 OsJacLK1 的转录谱。数据以平均值 ± 标准差表示。星号表示同一时间点处理组与水对照组之间的统计显著性（p < 0.05，单因素方差分析）。在感染 M. oryzae 之后（图 5b），OsJacLK1 的表达显示出延迟但明显的诱导。OsJacLK1 的转录本在 24 小时时升高到 5.44 倍，并在 48 小时时达到峰值（对照值为 1.48），然后在 36 小时和 48 小时时下降但仍高于对照组水平（2.37 对 1.12 和 2.21 对 0.88）。到 72 小时和 96 小时时，表达水平降至接近或低于对照组。总的来说，这些观察结果表明，OsJacLK1 在感染早期被 M. oryzae 激活。

2.6. OsJacLK1 可能不是水稻耐盐性的必要因素
为了研究其在胁迫耐受性中的作用，我们生成了过表达 OsJacLK1 的转基因系（OE-2、OE-11）和基因敲除系（osjaclk1-14 和 osjaclk1-34），所有这些都在 Zh11 水稻背景下。过表达系（OE-2 和 OE-11）的 OsJacLK1 表达水平显著高于野生型水稻（>40 倍，图 6a）。通过测序验证了纯合 CRISPR/Cas9 编辑水稻植株（osjaclk1-14 和 osjaclk1-34）。在 osjaclk1-14 系中，发现了两个缺失：276 至 283 bp 处的 ACAAGAC 和 514 至 520 bp 处的 TGTTCA，导致在第 139 个氨基酸处出现提前终止密码子。在 osjaclk1-34 系中，277 至 283 bp 处发生 CAAGAC 缺失，并且在 515 bp 处有一个胞嘧啶 (C) 的插入，导致在第 199 个氨基酸处提前终止（图 6b）。
图 6. 盐胁迫下 OsJacLK1 突变体的敏感性测定。(a) OsJacLK1 过表达水稻突变体中的转录本。(b) 通过 Sanger 测序确定的 CRISPR-Cas9 干扰的基因编辑系 osjaclk1-14 和 osjaclk1-34 的基因型。色谱图中，绿色代表 A（腺嘌呤），红色代表 T（胸腺嘧啶），蓝色代表 C（胞嘧啶），黑色（或深蓝色）代表 G（鸟嘌呤)。(c) OsJacLK1 突变体在 NaCl (150 mM) 下处理 7 天。(d) 盐胁迫下 OsJacLK1 过表达突变体的存活率。(e) 盐胁迫下 OsJacLK1 基因缺失突变体的存活率。数据以平均值 ± 标准差表示。列上不同的字母表示组间具有显著差异（p < 0.05，单因素方差分析后进行 Tukey 的事后检验），而具有相同字母的组之间没有显著差异。为了评估其对耐盐性的贡献，所有 OsJacLK1 突变体都接受了 NaCl (150 mM) 的胁迫。尽管 OsJacLK1 在盐胁迫下被转录诱导，但在测试条件下，过表达系、基因缺失功能系和野生型 Zh11 之间没有观察到明显的统计学差异（图 6c–e），表明 OsJacLK1 可能在耐盐性中不起主要作用。

2.7. OsJacLK1 的过表达增强了水稻对 M. oryzae 的抗性
为了评估其对稻瘟病的抗性，我们将芽孢液喷洒和穿刺接种方法应用于 OsJacLK1 突变体（OE 和基因缺失功能）的叶片上。在喷洒接种试验中，OsJacLK1 过表达突变体 OE-2 和 OE-11 的幼苗表现出较小的病斑大小（图 7a,b）和较低的真菌生物量积累（图 7c），与野生型 Zh11 相比。
图 7. OsJacLK1 的过表达赋予了水稻对 M. oryzae 的抗性。(a) 在施用稻瘟菌 Guy11 后，过表达和基因缺失的 OsJacLK1 水稻植株在 7 天后的状态；(b) 接种 Guy11 后感染叶片中的真菌生物量。(c) 根据国际水稻研究所 [36] 的稻瘟病抗性综合指数，感染 OsJacLK1 突变体上的病斑程度。级别 1：小棕色斑点 (<0.5 mm)；级别 2：小纺锤形病斑 (1–2 mm)；级别 3：典型纺锤形病斑 (2–3 mm)；级别 4：较大病斑 (3–5 mm)；级别 5：连片病斑 (>5 mm)。(d) 对 OsJacLK1 突变体叶片进行穿刺接种；(e) 刺孔接种后感染叶片上的病斑大小；(f) 刺孔接种后感染叶片中的真菌生物量。数据以平均值 ± 标准差表示。列上不同的字母表示组间具有显著差异（p < 0.05，单因素方差分析后进行 Tukey 的事后检验）。为了评估 OsJacLK1 对稻瘟病的抗性，我们使用芽孢液喷洒和穿刺接种方法对 OsJacLK1 转基因系（过表达、功能缺失突变体）进行了挑战。在芽孢液喷洒试验中，过表达突变体 OE-2 和 OE-11 表现出较小的病斑大小（图 7a,b）和较低的真菌生物量积累（图 7c），与野生型 Zh11 水稻相比。相比之下，基因缺失突变体（osjaclk1-14 和 osjaclk1-34）表现出与野生型 Zh11 水稻相似的易感性。穿刺接种试验也得到了相同的结果，其中过表达系表现出增强的抗性，而功能缺失突变体表现出与野生型相似的易感性（图 7d–f），进一步支持了 OsJacLK1 的过表达能增强水稻对稻瘟病的抗性。

2.8. OsJacLK1 触发了水稻的防御反应
为了阐明 OsJacLK1 在介导对 M. oryzae 免疫中的分子基础，我们检测了 OsJacLK1 突变体水稻中防御相关基因的表达。在模式触发免疫 (PTI) 通路 [37,38,39,40,41,42,43,44,45] 中，防御标记基因 OsRac1（2.0-2.5 倍）、OsSGT1（1.3-1.6 倍）、OsMAPK6（8-27 倍）、OsPAL1（10-80 倍）、OsNAC4（4-6 倍）、OsPBZ1（6-48 倍）、OsAOS2（4-32 倍）和 OsJAZ8（1.5-1.8 倍）在 OsJacLK1 过表达系中的表达显著增强，而在基因敲除突变体（osjaclk1-14, osjaclk1-34）中的表达显著减弱，与野生型 Zh11 水稻没有显著差异（图 8a–h）。
图 8. OsJacLK1 的过表达触发水稻的防御反应。(a–h) 在 Zh11、OsJacLK1 过表达水稻 (OE-2, OE-11) 和基因缺失功能系 (osjaclk1-14, osjaclk1-34) 中的防御响应基因 OsRac1、OsSGT1、OsMAPK6、OsPAL1、OsNAC4、OsPBZ1、OsAOS2 和 OsJAZ8。误差条表示标准差 (n = 3)。列上的字母表示显著性。(i) 在 Zh11 和水稻突变体中监测的几丁质触发的 ROS 爆发，误差条表示标准误差 (n = 3)；(j) 在 M. oryzae 喷洒接种前后上述水稻系中过氧化氢的 DAB 染色。接下来，我们监测了几丁质诱导下的 ROS 产生。与 Zh11 相比，OsJacLK1 过表达系（OE-2 和 OE-11）中的几丁质触发 ROS 爆发显著增强（图 8i）。相反，osjaclk1-14 和 osjaclk1-34 突变体中的 ROS 积累减弱，低于几丁质处理的 Zh11 植物。此外，3,3′-二氨基联苯胺 (DAB) 染色显示，在接种 M. oryzae 之前，OE-2 和 OE-1 的叶片中过氧化氢的积累增加。在接种后 48 小时 (hpi)，过表达突变体中的过氧化氢积累明显增强，而在基因敲除突变体中几乎不存在（图 8j）。总体而言，这些结果表明，OsJacLK1 的过表达触发了防御相关基因的激活和 ROS 的积累，从而增强了对 M. oryzae 的抗性。

3. 讨论
Jacalin 相关凝集素已成为植物应激反应中的关键调节因子，其功能范围从体外的直接抗菌活性到调节包括病原体、盐、干旱和温度胁迫在内的防御信号 [15]。在水稻中，大多数 jacalin 相关凝集素（26/30）的遗传功能尚未明确，尤其是 jacalin 类凝集素激酶 (JacLKs)，这些激酶目前仅在禾本科植物中发现 [25,46]，表明它们可能具有环境适应的作用。在这项研究中，我们关注了一种假定的 jacalin 相关凝集素激酶 OsJacLK1，并探讨了其在介导水稻对稻瘟菌抗性中的作用。我们的研究表明，OsJacLK1 作为水稻免疫反应的正向调节因子，可能成为提高水稻育种抗性的候选基因。OsJacLK1 的结构组织为其潜在作用机制提供了重要见解。除了磷酸锚定基序外，OsJacLK1 的激酶结构域包含 HKN 和 PPE 基序，而不是典型的 HRD 和 APE 基序（图 1b,c），表明其缺乏通过自我磷酸化传递信号的催化活性，但仍保留了类似激酶的折叠结构 [47]。这一观察强烈表明，OsJacLK1 可能作为一种“伪激酶”或“类激酶”蛋白发挥作用。伪激酶介导的信号传导在动物和植物系统中已成为重要的调节机制，其中支架蛋白协调信号复合物的组装而不参与催化活性 [48,49,50,51,52]。这种结构特征将 OsJacLK1 与典型的 RLKs 区分开来，使其有可能作为信号枢纽，而不是酶，能够作为招募和促进其他活性激酶介导的磷酸化事件的支架，这需要通过激酶测定或蛋白质相互作用研究进一步验证。我们还证明了重组 OsJacLK1 蛋白具有血凝活性和碳水化合物结合能力，特别是能与甘露糖、几丁质和 M. oryzae 细胞壁成分相互作用（图 2a,b）。这些特性与典型的 JRL，OsMBL1 [27,31] 的特性一致，表明 OsJacLK1 可能作为模式识别受体 (PRR) 或共受体，能够直接感知病原体相关的分子模式（如几丁质）。OsJacLK1 的表达模式支持其作为应激信号整合节点的角色，以及其他 jacalin 凝集素（如 OsMBL1 和 OsJAC1 [27,31,32,33,34,35]）。OsJacLK1 对不同植物激素的差异表达模式揭示了其在整合不同应激信号通路中的潜在作用。OsJacLK1 对 SA（20 倍在 6 小时）和 Me-JA（55-58 倍）的快速强烈诱导尤为引人注目，因为这两种激素通常分别介导对抗生物亲和性和非生物亲和性的防御通路 [53,54,55,56]。尽管 SA 和 JA 信号通常是拮抗的，但 OsJacLK1 被这两种激素强烈上调表明它可能受到这两种防御激素途径的共同调节，这一点通过 OsJacLK1 过表达水稻中 SA 通路标记基因（包括 OsPAL1、OsPBZ1 和 OsSGT1 等）和 JA 通路标记基因（OsAOS2 和 OsJAZ8）的转录激活得到了验证（图 8）。ABA 的适度但持续上调与其在非生物胁迫反应中的作用一致 [57]，并与 OsJacLK1 在盐胁迫下的适度表达（图 4）相符。此外，新兴证据表明生长素和防御通路之间存在相互作用，其中生长素信号可以根据病原体影响敏感性或抗性 [58,59]。OsJacLK1 对 IAA 的显著响应提示它也可能参与生长-防御平衡，可能将生长信号与应激准备状态联系起来。然而，这一假设需要进一步验证，特别是在 OsJacLK1 突变体的农艺性状和生理特性方面。值得注意的是，OsJacLK1在早期免疫反应中对稻瘟菌（M. oryzae）的参与得到了进一步的支持，因为在几丁质寡糖处理后其活性显著增强（1.5小时内增加了3.08倍；图5a），几丁质寡糖是一种已知的植物识别物质（PAMP），能够触发防御反应，从而导致下游免疫反应的激活，包括防御相关基因的表达增加和活性氧（ROS）的爆发[60,61]。在水稻中过表达OsJacLK1可以增强对稻瘟菌的抵抗力（图7），这与之前关于jacalin相关凝集素OsJAC1、OsMBL1的研究结果一致[24,27,31]，这些研究已经证明它们能够积极调节对稻瘟菌的防御反应。在过表达OsJacLK1的水稻植物中观察到的增强抵抗力伴随着多种防御相关基因水平的升高（图8a–h）、更强的ROS爆发和H2O2积累（图8i,j）。

在几丁质引发的初级免疫反应（PTI）中，OsRac1作为受体复合体下游的早期分子开关，OsMAPK6在专门的MAPK级联反应中起作用，驱动植物抗性物质的生物合成，OsSGT1作为PTI激活的可靠转录标记物，而OsNAC4则在该防御途径中作为下游的NAC转录因子[44,62,63]。与野生型相比，这四个基因在过表达OsJacLK1的植物中均显著上调。在OsRac1-OsMAPK6信号级联反应中，转录因子RAI1在下游被激活，并直接调控OsPAL1的表达[64]。与此一致的是，我们的OsJacLK1过表达株系显示OsPAL1的表达上调，表明OsJacLK1激活了这一核心的PTI途径。此外，OsAOS2和OsPBZ1表达的增加可能反映了JA和SA通路分别的下游激活，而OsJAZ8的上调可能代表了JA通路内的反馈调节响应。这一观察表明，OsJacLK1的组成性表达预先激活了核心的PTI信号模块OsRac1-OsMAPK6级联反应，从而诱导下游组分如OsSGT1、OsNAC4和SA-/JA合成基因的表达。

OsJacLK1介导的抵抗力的机制基础还涉及ROS动态的调节。ROS的产生是对病原体攻击的最早反应之一，在限制病原体传播方面起着关键作用：既作为直接的抗菌剂，也作为激活下游防御反应的第二信使[60,61]。在静息条件下（未进行几丁质处理或病原体接种），OsJacLK1过表达株系的ROS和H2O2水平与野生型植物相当。然而，在几丁质寡糖诱导或稻瘟菌接种后，过表达株系表现出显著增强的ROS爆发和更高的H2O2积累，而敲除株系的ROS反应减弱（图8i,j）。这种模式表明，OsJacLK1是预先激活植物的氧化爆发机制，而不是持续激活它——这是强化PTI状态的标志。OsJacLK1过表达植物中增强的ROS积累，结合防御基因的表达上调，可能通过这两种机制共同促进了观察到的抗性表型。通过预先激活ROS生成系统和防御基因表达，OsJacLK1使植物在病原体侵袭时能够更快、更强烈地作出反应，最终限制了真菌的入侵，并增强了对抗稻瘟菌的抵抗力。据推测，这一功能可能与提出的凝集素样伪激酶假说相符，即OsJacLK1可能作为支架，感知来自稻瘟菌的几丁质，并促进氧化酶复合体或调节ROS生成的MAPK级联反应的组装和激活。表型上未改变的敲除株系中ROS爆发减少，这可能是由于功能冗余所致。

此外，在稻瘟菌接种后，OsJacLK1敲除株系没有明显的表型变化。这种现象可能是由多种因素引起的。水稻基因组编码了30个具有重叠特异性的JRL基因[22]，而其他植物的JRL基因通常是应激诱导表达的，而不是组成性表达的[22,65,66,67]，这可能解释了在标准生长条件下没有敲除表型的原因。此外，最近的研究表明，某些JRL基因在エルゴリズムストレス下在特定细胞类型中起作用，并可能由其他伴侣蛋白补偿[11,20]。与这些观察结果一致，我们发现某些水稻JRL基因的过表达或删除并未改变对稻瘟菌的抵抗力。这与报道的结果一致，即JRL基因的过表达效应依赖于背景。例如，OsJAC1在一些背景（如ZH10或Dongjing）中增强抵抗力，但在ZH11中则起到负调控作用[23,68]。这些相反的结果表明，给定JRL基因的效果可能取决于具体的基因、遗传背景和使用的病原体株系。因此，我们株系中没有明显的表型变化可能反映了功能冗余、条件依赖性或负调控。

尽管OsJacLK1在盐胁迫下有轻微的诱导，但在盐度挑战下，过表达株系和敲除株系与野生型植物相比没有显示出显著的表型差异，这表明OsJacLK1可能不是盐耐受性的必需基因。然而，鉴于OsJacLK1属于一个大型基因家族，它仍有可能参与一个冗余的调控途径，在其中其功能可能由其他同源基因补偿。需要进一步的详细研究来验证这一可能性。

总之，我们的研究表明OsJacLK1是水稻对稻瘟菌免疫的正面调控因子。在OsJacLK1过表达株系中观察到的增强抵抗力与ROS产生增加和防御相关基因上调有关，为水稻免疫的分子机制提供了宝贵的见解。尽管其在盐耐受性中的作用有限，但OsJacLK1作为提高水稻抗病性的基因改良候选基因具有潜力。

**4. 材料与方法**
**4.1. OsJacLK1的生物信息学分析**
使用NCBI CD Search [69]分析了蛋白质结构域组成。N-糖基化位点用NetNGlyc 1.0 [70]预测，O-糖基化位点用NetOGlyc 4.0 [71]预测。蛋白质磷酸化位点用NetPhos 3.1 [72]预测。蛋白质结构预测使用SWISS-MODEL [73,74]进行。使用PRALINE (https://www.ibi.vu.nl/programs/pralinewww/) 在默认设置下（2026年3月1日访问）对OsJacLK1与其活性和非活性激酶序列进行了多序列比对[75]。使用MEGA12（版本12.0；默认参数）和ClustalW对OsJacLK1及其植物同源物进行了多序列比对[76]。系统发育分析使用MEGA12通过最大似然法构建了树状图（1000次自助复制），并通过Interactive Tree of Life (iTOL) [77]显示。用于系统发育分析的序列来自国家生物技术信息中心数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/，2025年8月30日访问）、水稻基因组注释项目（https://rice.uga.edu/analyses_search_blast.shtml，2025年8月30日访问）和拟南芥信息资源（https://www.arabidopsis.org/，2025年8月30日访问）。

**4.2. 植物生长**
水稻（Oryza sativa）品种在28°C的温度下生长，白天光照16小时，黑夜8小时。使用 japonica Zhonghua11（ZH11）种子进行转化[78]，以生成OsJacLK1基因过表达的水稻突变体和基因缺失功能突变体。

**4.3. 抗体构建和转基因植物验证**
为了生成OsJacLK1过表达的水稻，将OsJacLK1的编码区克隆到植物二元载体pCXUN中，C末端带有增强的GFP标签，并受玉米泛素启动子的控制[79]。
对于基因敲除构建，从OsJacLK1外显子区域选取了两个目标序列5′CTGCTATGACACAAGACGTA3′和5′GAAATTTGACGTGTTC-AGTC3′，分别与U6a-sgRNA盒和U6b-sgRNA盒融合，随后构建到CRISPR/Cas9介导的基因组编辑载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H [80]中。重组质粒载体然后被转移到根瘤杆菌EHA105中。遗传转化由中国武汉的Biorun Co., Ltd.公司完成。

**4.4. 稻瘟病接种**
稻瘟菌Guy11菌株在28°C下用淀粉酵母提取物培养基中生长菌丝。通过在米糠培养基（4% [w/v]米糠和1.5% [w/v]琼脂，pH 6）中培养5天并置于黑暗环境中，然后暴露于12小时光照/黑暗循环2天，产生分生孢子[81]。
进行植物接种实验时，从平板培养物中收集分生孢子，以3 × 10^5孢子/mL的浓度悬浮在0.02% (v/v) Tween 20水中。为了动态分析OsJacLK1对稻瘟菌的反应，在四周大的ZH11幼苗上喷洒Guy11孢子悬浮液，并在暗光和高湿度条件下保持18至24小时。用0.02% Tween 20水处理的幼苗作为对照。在不同时间点（0、12、24和72小时）收获叶子并提取RNA，进行逆转录，然后通过qRT-PCR分析OsJacLK1的表达变化。使用水稻OsActin作为内部参考基因。相对表达水平使用2^-ΔΔCt方法计算[82]。为了确定对稻瘟菌的敏感性，将四周大的OsJacLK1过表达突变体（OE-2, OE-11）和基因敲除突变体（osjaclk1-14, osjaclk1-34）的幼苗喷洒Guy11孢子悬浮液。在避光18-24小时后，将植物暴露于光照16小时和黑暗8小时的环境中。接种7天后使用国际水稻研究所（IRRI）的1-5等级评估疾病严重程度[36]。等级1：小棕色斑点（<0.5毫米）；等级2：小梭形病斑（1-2毫米）；等级3：典型梭形病斑（2-3毫米）；等级4：较大病斑（3-5毫米）；等级5：融合病斑（>5毫米），通常伴有黄化和坏死。疾病指数（DI）计算为DI = [Σ (n × s)/(N × 5)] × 100，其中n为得分为s的叶子数量，N为叶子总数。每个处理组包含三个重复盆栽，每个盆栽十株植物，实验独立重复三次。每次重复至少随机收集20片叶子检查病斑发展情况。选择边界清晰且具有典型稻瘟病症状的病斑，避免叶缘和中脉。使用ImageJ2测量每片叶子上的病斑数量。

**4.5. OsJacLK1对外源激素、几丁质、盐和稻瘟菌的响应**
根据参考文献[23,83,84]所述的方法，将十天的ZH11植物分别喷洒100 μM MeJA、1 mM SA、10 μM ABA和20 μM IAA溶液。在不同处理后时间点（0、3、6、12、24、36和48小时）收集水稻叶子。
对于几丁质处理，将五天的Zh11幼苗浸泡在灭菌的500 μg/mL几丁质寡糖溶液中。在浸泡后1、1.5、3和6小时收集整个植物。
对于盐胁迫处理，将NaCl以150 mM的最终浓度应用于两周大的ZH11水稻幼苗。在胁迫后0、12、24、48和96小时收集包含根和叶子的样本。
对于稻瘟菌接种，将四周大的ZH11幼苗喷洒相应的Guy11孢子。在接种后0、12、24、48和96小时收集每株植物的第二条伸出的叶子。
收集每种处理下的水稻样本进行RNA提取和逆转录。使用qRT-PCR（Mastercycler, Eppendorf）监测OsJacLK1基因的转录谱，并以0小时的水处理为对照。使用2^-ΔΔCt方法进行相对量化。

**4.6. 转基因水稻中防御相关基因的表达**
使用qRT-PCR分析野生型ZH11和转基因水稻植物（包括过表达株系OE-2、OE-11以及基因敲除突变体osjaclk14和osjaclk-34）中OsRac1、OsSGT1、OsPBZ1、OsPAL1、OsAOS2、OsMAPK6、OsAOS2和OsJAZ8的表达变化。使用actin基因OsActin作为内部参考。每个防御相关基因的表达均以野生型ZH11为基准进行归一化。

**4.7. ROS爆发测量和DAB染色**
按照[27]的方法对水稻叶片圆盘中的ROS爆发进行测量，并进行了修改。使用小鼠耳状取样器切割四周大水稻幼苗的叶片圆盘，并在无菌蒸馏水中预培养过夜。每个样本放置三个叶片圆盘在一个96孔ELISA板上，其中含有10 mM发光酚、5 mg/mL辣根过氧化物酶和8 nM (GlcNAC)7，或对照组用水。治疗后，立即使用Thermo Scientific Varioskan Flash Microplate Readers（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）通过发光分析法监测水稻组织中的活性氧（ROS）生成情况。每份样本和每种处理方式均重复三次实验，并计算每次处理的标准误差（SE）值。对于DAB染色实验，在感染后48小时采集每品系中受稻瘟菌（M. oryzae）侵染的叶片，将其浸入1 mg/mL的DAB溶液（pH 3.8）中。经过约15分钟的真空渗透处理（压力约为0.05–0.08 MPa）后，将叶片样本置于DAB溶液中继续培养8小时（置于黑暗环境中）。随后将叶片转移到95%的乙醇中，并在90°C的水浴中加热20–30分钟，直到绿色叶绿素被提取出来且背景颜色变浅。

补充材料：以下支持性信息可在此网址下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/plants15091376/s1
图S1：OsJacLK1及植物中同源蛋白的多序列比对；
图S2：水稻幼苗中OsJacLK1的组织特异性表达；
表S1：本研究中使用引物列表。