《Plants》：The Auxin Response Factor TaARF18-A Negatively Regulates Salt Tolerance in Common Wheat (Triticum aestivum L.)
Yuzhe Wen,
Yiying Li,
Shuguang Bao,
Gaoyi Cao,
Ming Li,
Junbin Wang,
Bo Ding,
Xiaodong Xie and
Lina Qiu
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土壤盐渍化是影响农业生产和环境的主要非生物胁迫之一。Auxin响应因子（ARFs）是Auxin信号转导途径的关键组分，而其在小麦盐胁迫响应中的作用尚不清楚。本研究鉴定出TaARF18为小麦耐盐性的负调控因子。TaARF18-A、TaARF18-B和TaARF1
土壤盐渍化是影响农业生产和环境的主要非生物胁迫之一。Auxin响应因子（ARFs）是Auxin信号转导途径的关键组分，而其在小麦盐胁迫响应中的作用尚不清楚。本研究鉴定出TaARF18为小麦耐盐性的负调控因子。TaARF18-A、TaARF18-B和TaARF18-D的编码序列分别为2106、2088和2088 bp。TaARF18是一种亲水性蛋白，具有典型的Auxin-resp和B3 DNA结合域，且在禾本科物种间表现出较高的进化保守性。TaARF18的表达在盐胁迫下上调。TaARF18主要在细胞核中积累。通过BSMV-VIGS（大麦条纹花叶病毒诱导的基因沉默）技术沉默TaARF18增强了小麦幼苗的耐盐性。此外，基于355份小麦种质的重测序数据进行单倍型分析，分别鉴定出TaARF18-A、TaARF18-B和TaARF18-D有25、31和16种单倍型。对携带不同单倍型的14份小麦种质进行盐胁迫评估，发现TaARF18-A的HapIII表现出最高水平的耐盐性，可作为全球小麦育种中的强选择位点。这些发现揭示了ARFs在盐胁迫响应中的功能，并为CRISPR/Cas介导的耐盐小麦育种提供了潜在靶点。
该研究针对土壤盐渍化严重威胁小麦生产，而Auxin响应因子（ARFs）在小麦耐盐性中的具体功能尚不明确这一科学问题展开。研究人员通过基因克隆、表达分析、亚细胞定位、BSMV-VIGS功能验证及群体遗传学等手段，系统揭示了TaARF18负调控小麦耐盐性的分子机制。
关键技术方法包括：利用EnsemblPlants数据库进行同源基因鉴定与序列特征分析；采用qRT-PCR技术分析盐胁迫下的时空表达模式；利用PEG介导的原生质体转化进行亚细胞定位观察；应用BSMV-VIGS系统在小麦中进行基因沉默表型验证；基于355份小麦种质的重测序数据进行单倍型分析与关联评估；并对14份不同单倍型的代表性材料进行了系统的耐盐性评价。
研究结果如下：
- 1.
TaARF18的克隆与特征分析
研究人员克隆了位于染色体7A、7B、7D上的三个TaARF18同源基因。序列分析表明，三者CDS高度保守，编码蛋白均含有典型的Auxin-resp结构域和B3 DNA结合域，且均为亲水性蛋白，无跨膜结构，表明其为转录因子。
- 2.
TaARF18蛋白的二级和三级结构
利用SOPMA和AlphaFold预测显示，TaARF18蛋白主要由无规卷曲构成，其次为α-螺旋和延伸链，其三维结构呈现较为松散的构象，含有多个螺旋区域。
- 3.
TaARF18同源基因启动子顺式作用元件分析
启动子分析发现了多种与非生物胁迫相关的顺式作用元件，如低温响应、干旱诱导及防御和应激响应元件，暗示了该基因可能受多种环境信号调控。
- 4.
TaARF18的系统发育分析
构建的NJ树显示，TaARF18与水稻、短柄草等禾本科植物的ARF18或类似蛋白聚类在一起，表明其在禾本科中进化关系相对保守。
- 5.
TaARF18对盐胁迫的响应
qRT-PCR结果显示，盐胁迫显著诱导了TaARF18在各组织中的表达，尤其在根和叶中响应强烈，表现为早期（3 h）和晚期（48 h）的显著上调，表明其参与组织特异性的盐胁迫响应。
- 6.
TaARF18的亚细胞定位
原生质体瞬时表达实验证实，TaARF18-A-GFP融合蛋白信号与核定位信号（NLS）标记高度重叠，定位于细胞核。
- 7.
沉默TaARF18提高小麦幼苗耐盐性
BSMV-VIGS沉默株系在150 mM NaCl处理后，表现出较轻的叶片卷曲和黄化程度。形态学指标测定显示，沉默株系的地上部鲜重、根系鲜重、总根长、根表面积和根体积均显著增加。生理生化分析进一步表明，沉默株系叶片中H2O2和O2?含量降低，抗氧化酶系统活性维持较好，说明沉默TaARF18能增强生长势并减轻氧化损伤。
- 8.
TaARF18的单倍型分析及单倍型材料的耐盐性评价
基于355份小麦种质的重测序数据，研究人员鉴定了大量单倍型。通过对14份代表性材料的耐盐性综合评价（D值），发现TaARF18-A的HapIII单倍型具有最强的耐盐性。
讨论部分指出，盐胁迫会诱发活性氧（ROS）过量积累导致膜脂过氧化，而TaARF18沉默株系能通过调节生理代谢减轻氧化损伤。虽然Auxin信号通路中的ARFs在其他作物中被报道参与逆境响应，但在小麦盐胁迫中的功能研究较少。本研究利用VIGS技术克服了小麦遗传转化困难的问题，明确了TaARF18是小麦耐盐性的负调控因子。鉴于中国已批准用于生物安全的基因组编辑技术，TaARF18可作为潜在的基因编辑靶点用于耐盐小麦育种。
结论部分总结：研究人员克隆了Auxin响应因子TaARF18，并研究了其对盐胁迫的响应。TaARF18编码亲水性核定位蛋白，具有典型的保守结构域。盐胁迫下TaARF18表达上调。沉默TaARF18可显著增强小麦幼苗的耐盐性。单倍型分析结合表型评价确定TaARF18-A的HapIII为优势耐盐单倍型。该研究为小麦耐盐性遗传改良提供了潜在靶点。
