利用集合建模方法评估喜马拉雅沙棘（Hippophae tibetana Schltdl.）的气候驱动分布动态 作者：陶马（Tao Ma）、刘碧玉（Biyu Liu）、徐丹平（Danping Xu）和卓志航（Zhihang Zhuo）

《Diversity》：Assessing Climate-Driven Range Dynamics of Hippophae tibetana Schltdl. Using an Ensemble Modeling Approach Tao Ma, Biyu Liu, Danping Xu and Zhihang Zhuo

　　摘要：本研究首次探究了本地酵母对厄瓜多尔圣埃莱娜地区手工酿造的Spondias purpurea L.果实葡萄酒发酵过程的影响。为了达到这一目标，比较了三种接种策略：一种是含有Saccharomyces cerevisiae和Candida spp.的混合培养物（CLX），一种是商业化的Saccharomyces cerevisiae（CL），另一种是未经添加接种剂的自然发酵（SL）。通过微生物学和生物化学方法，从发酵过程中分离出了五种酵母菌株，其中四种属于Candida spp.，一种属于Kloeckera spp.。CLX处理在PDA培养基上的酵母繁殖数量最多（2.7 × 10^6 CFU/mL），并且产生的高级酒精含量最高；而CL处理产生的乙醇含量（3.72% ABV）和甘油含量（0.46%）也最高。所有处理均不含总大肠菌群和粪大肠菌群，其pH值（2.49–2.56）符合厄瓜多尔现行葡萄酒生产标准NTE INEN 374的要求。使用酶促比色法（GOD-POD）特异性测定了残留葡萄糖含量，证实了这些葡萄酒的干型特性。通过对自然发酵所得样品进行分子分析，通过ITS1和ITS4引物扩增后进行BLAST比对，确认了其中存在Hanseniaspora spp.（Kloeckera spp.）、Diutina rugosa（C. rugosa）、C. zeylanoides和Pichia kudriavzevii。品鉴小组（n = 15）的感官评价显示，CLX处理的葡萄酒在香气和风味方面表现最佳。最终样品的葡萄糖含量仅为0.28 g/L，表明这款葡萄酒极其干燥，几乎不含可发酵糖分。由于关于Spondias purpurea L.果实葡萄酒的相关信息较少，本研究有助于更好地理解该发酵过程中微生物的生物学行为和生物多样性。这些发现将有助于提升该地区葡萄酒的生产水平，并为本地酵母在Spondias purpurea L.葡萄酒生物技术中的应用提供了理论支持。

1. 引言
厄瓜多尔的地区性葡萄酒生产是一个新兴行业，与当地旅游业密切相关，主要生产高品质的手工葡萄酒，这些葡萄酒产自独特且非传统的地点。目前，厄瓜多尔的主要葡萄酒生产商包括位于瓜亚基尔附近的沿海地区的Bodega Dos Hemisferios、La Toscana以及主要分布在安第斯地区的Vinos Don César（如皮钦查、阿苏艾和洛哈）。这些葡萄酒均以葡萄（Vitis vinifera）为原料。然而，在热带地区，本地手工葡萄酒生产有着悠久的文化和经济意义，当地丰富的果蔬资源为葡萄酒提供了多种替代原料，这些原料具有独特的感官潜力。这表明葡萄酒的多样性远不止葡萄一种。在酿酒过程中，酒精发酵主要由Saccharomyces属酵母驱动，因其高产乙醇能力和强健生机而受到重视。越来越多的证据表明，自然存在于果汁中的本地酵母能够显著改变葡萄酒的香气和感官特性，从而提升其品质和地域特色。然而，厄瓜多尔作为葡萄酒生产国的知名度较低，尽管规模较小，但葡萄酒产业仍在持续发展，尤其注重手工制作的高品质地区性葡萄酒。目前用于葡萄酒生产的传统水果包括樱桃、苹果、李子、蓝莓、越橘、桃子和芒果；不过，Spondias purpurea L.（“ciruela”）在此领域的应用尚不广泛。尽管该水果含糖量高、富含生物活性成分且具有良好的感官特性，但尚未得到充分利用。在圣埃莱娜省，这种水果已成为当地负责任和有机农业的一部分，体现了葡萄酒生产与生物多样性之间的和谐共存。然而，由于其冷藏期较短，商业化程度有限，需要探索能够延长其使用寿命并增加经济价值的农业加工方法。尽管S. purpurea L.具有酿酒潜力，但传统的手工葡萄酒生产往往缺乏标准化的微生物控制，这可能影响葡萄酒的质量、安全性和可重复性。因此，了解参与自然发酵的本地微生物群对于筛选有益酵母、提升葡萄酒的物理化学稳定性和促进当地经济效益至关重要。

2. 材料与方法
本研究采用综合方法学方案，在厄瓜多尔圣埃莱娜地区利用本地酵母生产手工李子葡萄酒（Spondias purpurea L.）。整个流程包括三个连续阶段：(1) 分离并鉴定本地酵母种群；(2) 在完全随机因子设计下进行实验性葡萄酒生产，比较本地酵母菌群、商业化Saccharomyces cerevisiae菌株和自然发酵；(3) 对最终产品进行全面的物理化学、微生物学和感官评价，以评估其发酵性能、安全性和消费者接受度。

2.1. 实验设计
本研究采用完全随机因子设计，评估不同接种处理对Spondias purpurea L.葡萄酒发酵的影响。设置了三种微生物处理方式：Saccharomyces cerevisiae和Candida spp.的混合菌群（CLX）、商业化Saccharomyces cerevisiae（CL）以及未经添加接种剂的自然发酵（SL）。每种处理方式重复三次，共进行九次发酵（n = 9），以确保结果的统计可靠性和实验有效性。所用果实来自厄瓜多尔圣埃莱娜省的果园，仅选取表皮呈红色、果肉呈亮黄色且具有典型香气的成熟果实。自变量包括接种剂类型（CL、CLX、SL）和发酵时间（0、5、10、15天）。因变量包括最终葡萄酒的物理化学成分、微生物数量和感官特性。本研究采用的方法学流程包括酵母分离、实验发酵和数据分析，详见图1。

2.2. 葡萄酒生产
收获成熟果实后，先进行清洗以去除杂质，然后用消毒刀具无菌提取果肉（图2A、B）。随后将果肉在70°C下热烫处理，以保持其感官特性并减少初始微生物负荷。将提取的果肉与20%（w/v）糖水混合，再加入2%（v/v）浓度的酵母接种剂（CL和CLX处理），自然发酵（SL）则不添加接种剂。将450 mL果肉液转移至500 mL透明玻璃瓶中并密封，以创建厌氧环境。发酵在22°C下进行15天，直至气体产生停止。发酵完成后，将葡萄酒无菌过滤并装瓶，瓶子需在121°C下高压灭菌15分钟。瓶装样品在控制条件下储存，直至进行物理化学、微生物学和感官分析。

2.3. 微生物分离与鉴定
发酵结束后，在第20天和第30天取样，分离出本地酵母，并将其分别接种于选择性培养基Potato Dextrose Agar（PDA，用于酵母和丝状真菌）和Nutrient Agar（NA，用于细菌分离）中。系列稀释至10,000倍（10^4）。初步通过宏观观察（菌落形态、颜色和质地）和微观观察（细胞形态及革兰氏反应）对微生物进行鉴定。选定符合酵母特征的菌株后，将其冻存于含有35%甘油的PDA培养基中。最终通过API 20C AUX试剂盒（bioMérieux, Marcy-l’étoile, France）进行生化鉴定。

2.4. 物理化学、微生物学和感官分析
评估的物理化学参数包括酒精含量、甲醇浓度、高级酒精、干提取物、总酸度、甘油含量、可溶性固体（°Brix）和pH值。所有测定均按照厄瓜多尔技术标准NTE INEN 374:2016进行。微生物分析用于确保产品安全性和数据可靠性。通过涂布平板法对活菌进行计数。总好氧菌数量在Nutrient Agar（NA）上测定。酵母和丝状真菌在Potato Dextrose Agar（PDA）上培养，培养条件为25°C，持续5天。总大肠菌群和粪大肠菌群在MacConkey Lactose Agar上测定，培养条件为37°C，持续24小时。残留葡萄糖的测定采用特异性酶促比色法（GOD-POD，Glucose liquicolor，Human Diagnostics, Wiesbaden, Germany），基于Trinder反应。该方法对D-葡萄糖具有高特异性。使用葡萄糖标准溶液（100 mg/dL）制备校准曲线。

2.5. 酵母菌株的分子表征
采用Quick-DNA? Fungal/Bacterial Kit（Zymo Research, Irvine, CA）提取酵母基因组DNA，并根据 Manufacturer’s instructions进行后续分子分析。为了鉴定Candida属物种，使用了针对保守的18S–ITS1–5.8S–ITS2–28S rDNA区域的特异寡核苷酸：正向引物5′-AGCTTGCGTTGATTACGTCCCTGCCC-3′和反向引物5′-TTCACTCGCCGCTACTAAGGCAATCCC-3′，这些引物是根据GenBank数据库中存储的Candida物种序列设计的[18]。对于Kloeckera属物种（无性型Hanseniaspora）的鉴定，使用了通用真菌引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），它们针对5.8S rDNA内部转录间隔区[19]。直接PCR扩增使用的是Thermo Fisher Scientific公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）生产的Phire? Plant Direct PCR Master Mix（F-160S）试剂盒。将从琼脂板上过夜培养的酵母菌落用无菌移液器吸取，然后重新悬浮在50 μL的1× Phire Plant Direct PCR Master Mix中再进行扩增。PCR反应在Thermo Scientific? Arktik? Thermal Cycler中按照以下条件进行：初始变性98°C 5分钟，随后是40个循环，每个循环中98°C变性1分钟、55°C退火2分钟、72°C延伸3分钟。引物的合成以及扩增产物的测序由Macrogen公司（韩国首尔）完成。序列比对和身份确认使用的是Clustal Omega 1.2.4多序列比对工具[20]。代表性序列与Candida magnoliae（GenBank登录编号CBS 2800）高度相似，该菌种的基因组区域包括ITS1、5.8S rRNA基因和28S rRNA基因。

2.6. 颜色分析
葡萄酒的色泽特性按照OIV方法（OIV-MA-AS2-11）进行评估。样品先 undergo 离心处理（10,000× g，10分钟），然后通过0.45 μm膜过滤。用蒸馏水以1:200的比例稀释样品，以使吸光度值处于可测量范围内。使用UV–Vis分光光度计（Genesys 10S/108，Thermo Scientific，美国）在280 nm（总多酚指数）、420 nm（黄色成分）、520 nm（红色成分）和620 nm（蓝色成分）处测量吸光度。颜色强度计算为420 nm、520 nm和620 nm处吸光度的总和。色调用A420/A520的比值表示。所有测量均重复三次进行。

2.7. 感官评价
感官评价考虑了五个属性：颜色、气味、味道、透明度和整体接受度。采用五点喜好量表进行评分，范围从1（“非常不喜欢”到5（“非常喜欢”）。评价由未经培训的品尝小组（n = 15）在受控的温度和光照条件下完成。样品按照良好的感官评估规范装入编码杯子中。根据最终产品的感知感官质量，确定了消费者接受度最高的处理方案。

2.8. 统计分析
进行统计分析以评估接种物类型和发酵时间对理化、微生物学和感官变量的影响。定量数据使用双向方差分析（ANOVA）来评估因素之间的主效应和相互作用。当检测到统计显著差异（p < 0.05）时，使用Tukey的事后检验比较平均值[21]。使用五点喜好量表获得的感官数据被视为有序变量，因此应用了非参数统计检验，包括用于整体比较的Kruskal–Wallis检验和适当的成对比较的Dunn检验。所有参与感官评估的人都是自愿参与的，并在评估前提供了知情同意。所有统计分析均使用IBM SPSS Statistics软件（版本26）完成[5]。

3. 结果与讨论
3.1. Spondias purpurea L. Must的理化特性
用于手工酿造葡萄酒的果实表现出与成熟度相关的感官和视觉特征，包括深红色的果皮颜色、明亮的黄色果肉以及特有的成熟香气。这些属性与之前报道的Spondias purpurea L. 的成熟标准一致，其中成熟与糖分的增加和酸度的降低密切相关，这两者都是酒精发酵的关键因素[2,3]。果汁提取率约为77%，与Rodríguez等人报告的相似成熟阶段的果实79%的提取率相当[21]。这一结果证实了S. purpurea L. 作为发酵饮料原料的适宜性。理化分析显示，可溶性固形物含量根据果实成熟度的不同介于13到15°Brix之间，pH值介于2.9到3.1之间。这些参数表明可发酵糖分和酸度之间达到了良好的平衡，为酵母生长创造了有利环境，并有助于发酵过程中的微生物稳定性。其他热带水果葡萄酒也报告了类似的pH值和°Brix值，其中酸性条件有利于酵母的生长并减少了细菌污染[1,22]。总体而言，S. purpurea L. 的理化特性表明其适合作为酒精发酵的基质，并具有生产具有平衡感官特性的葡萄酒的潜力。

3.2. 从自然发酵中分离酵母
从六个独立的Spondias purpurea L. 果实自然发酵过程中成功分离出酵母（F1–F6），证实了各批次中存在活跃的发酵微生物群。使用非选择性培养基共分离出24个酵母菌株，每个发酵批次的菌株数量从3到5个不等（图3）。F2批次的酵母菌株数量最多（5个），而F3批次的数量最少（3个）。其余的F1、F4、F5和F6批次各产生了4个菌株，表明独立自然发酵之间存在中等程度的变异。从所有发酵批次中分离出的酵母菌株为后续的表征提供了具有代表性的微生物群体。不同发酵批次中酵母菌株的分布反映了自然发酵系统的固有异质性，支持选择代表性的菌株进行后续的形态学和生化分析[23]。

3.3. 酵母菌株的宏观和微观特征
在MRS、PDA和NA培养基上分离出的菌落的宏观观察显示了菌落大小、色素沉着、表面质地和边缘清晰度的差异（图4）。大多数菌株表现为圆形菌落，边缘光滑，凸起，颜色从白色到奶油色不等。这些特征与用于初步区分酵母和丝状真菌的经典描述一致[24,25]。

3.4. 酵母的生化鉴定（API 20C AUX）
从不同培养基中分离出的24个酵母菌落中，选择了5个代表菌株进行API 20C AUX系统的生化鉴定（表1）。这种标准化方法广泛应用于酵母的分类鉴定，因为它可以根据碳水化合物同化谱进行区分，在食品和发酵微生物学研究中经常被引用[29]。API 20C AUX谱分析表明，4个菌株被归类为Candida属，1个菌株属于Kloeckera属。这种分布反映了非Saccharomyces酵母在自然发酵过程中的生态行为，这些属的酵母由于生长迅速、耐酸性和利用多种碳源的代谢灵活性，在发酵早期阶段通常占主导地位[29,30]。本研究中观察到的Candida属的优势与之前关于热带和非葡萄果实自然发酵的报告一致，这些属与活跃的发酵阶段和挥发性化合物产量的调节有关，从而增加了葡萄酒的香气复杂性[31]。同样，在基于水果的葡萄酒的自然和混合发酵中也观察到了非Saccharomyces酵母的类似优势模式，这突显了酵母生物多样性在发酵动态和产品差异化中的作用[18,32]。Kloeckera属的检测也很值得注意，因为该属的成员通常与自然发酵的初始阶段相关，并且已知会影响酯类的形成和早期发酵阶段的微生物相互作用[33,34]。通过API 20C AUX系统获得的生化鉴定结果与之前的宏观观察结果（图3和图4）一致，支持了从Spondias purpurea L. 发酵中分离出的菌株的分类鉴定。基于在这些菌株中的较高出现频率及其在不同培养基上的生长能力，确定Candida属为Spondias purpurea L. 自然发酵中的主要本土酵母。这种代谢多样性表明它们在果实发酵的理化条件下具有适应优势，并支持其在手工葡萄酒发酵系统中的进一步研究。

3.5. 发酵过程中的微生物计数
在所有处理组（CL、CLX和SL）中，整个发酵过程中都在MRS、PDA和NA培养基上持续检测到酵母生长，而在MacConkey琼脂上任何采样时间均未观察到微生物生长（表2）。这种选择性培养基上完全没有菌落的形成，证实了所生产的手工葡萄酒的微生物质量完全符合厄瓜多尔技术标准NTE INEN 2337:2010（非碳酸饮料）[37]和NTE INEN 374:2016（ fruit wines）[14]的要求，这些标准规定发酵饮料中不得含有大肠菌群。此外，这些结果符合国际葡萄与葡萄酒组织（OIV）制定的葡萄酒安全微生物标准[38]，即优质葡萄酒必须不含病原微生物和肠道细菌。表2显示了发酵15天后不同培养基中的微生物计数（CFU/mL）。在发酵第15天，不同处理组之间的酵母数量存在明显差异：在自然发酵（SL）中，酵母数量达到2.4 × 10^6 CFU/mL；在商业Saccharomyces cerevisiae处理组（CL）中为9.0 × 10^4 CFU/mL；在混合 Consortium处理组（CLX）中为2.9 × 10^6 CFU/mL。PDA培养基上也观察到类似的趋势，SL组的酵母数量为2.6 × 10^6 CFU/mL，CL组为7.5 × 10^4 CFU/mL，CLX组为2.7 × 10^6 CFU/mL。在北美培养基中，SL的菌落数量最多（3.0 × 10^6 CFU/mL），其次是CLX（2.5 × 10^6 CFU/mL），而CL的数值则始终较低（1.0 × 10^5 CFU/mL）。如表2所示，不同处理方法和培养基下的酵母种群有显著差异。在所有处理方法和取样时间中，MacConkey琼脂上均未观察到细菌生长，这表明即使在自发发酵条件下，发酵环境也能有效抑制肠道细菌。这种微生物稳定性可以归因于低pH值、乙醇积累、营养竞争以及酵母产生的抑制性代谢物质的综合效应，这些机制在Saccharomyces和非Saccharomyces物种中均有报道[9,23]。统计分析显示MRS和PDA培养基中的酵母数量存在显著差异（p < 0.05），证实了接种剂类型对微生物动态的显著影响。Tukey事后检验表明，商业酵母处理（CL）与联合 fermentation（CLX）和自发发酵（SL）有显著差异，后者在整个发酵过程中保持了更高的酵母种群数量和更稳定的状态。值得注意的是，由本地酵母群落驱动的自发发酵（SL）和混合发酵（CLX）显示出的微生物负荷与使用商业发酵剂的情况相当或更高，同时仍符合国家和国际安全标准。这一发现为厄瓜多尔手工制作Spondias purpurea L.葡萄酒时使用本地酵母的安全性提供了首个微生物学证据，突显了它们在开发具有地域特色和符合监管要求的果酒方面的潜力。

3.6. 非Saccharomyces酵母菌株的分子特征
为了确认之前使用API 20C AUX系统获得的生化鉴定结果，采用ITS-PCR方法，利用ITS1和ITS4引物扩增了四个本地非Saccharomyces酵母分离株（三个类似Candida的菌株和一个Kloeckera sp.）的基因组DNA，方法按照第2节所述进行。DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳分离。如图7A所示，所有分离株均产生了单一且定义明确的ITS扩增子，-band强度相似但片段大小不同，表明核糖体ITS区域扩增成功。对应于Kloeckera sp.和Candida rugosa的扩增子片段大小约为360–373 bp，而Candida magnoliae和Candida zeylanoides的扩增子大小分别约为440 bp和567–590 bp。扩增子长度的差异与酵母ITS区域常见的种间多态性一致[18]，支持在分子水平上区分非Saccharomyces物种。图7. 通过ITS-PCR和系统发育分析对本地非Saccharomyces酵母分离株进行分子特征鉴定。(A) 使用ITS1和ITS4引物生成的ITS扩增子的琼脂糖凝胶电泳（3% w/v）。泳道M：分子量标记物；泳道1：无基因组DNA的负对照；泳道2：无引物的负对照；泳道3：Candida rugosa (~362 bp)；泳道4：Kloeckera sp. (~373 bp)；泳道5：Candida magnoliae (~440 bp)；泳道6：Candida zeylanoides (~567 bp)。(B) 基于多序列比对构建的系统发育树，显示分析酵母分离株之间的遗传关系。Candida magnoliae和C. zeylanoides聚类紧密，而Kloeckera sp.作为遗传上最不同的分离株。比例尺代表遗传距离。在对ITS扩增子进行测序后，基于多序列比对（MSA）构建了系统发育树以评估分离株之间的遗传关系（图7B）。结果显示Candida magnoliae和Candida zeylanoides聚类紧密，遗传距离最小（0.241），而Kloeckera sp.形成最明显的分支，进化距离最大（0.391）。BLASTn分析使用在线NCBI BLAST +平台（美国马里兰州贝塞斯达的国家生物技术信息中心）进行，数据获取于2025年。分析进一步支持了分子鉴定结果，显示Kloeckera sp. ITS扩增子与Hanseniaspora spp.参考序列之间的序列同源性为99.46%。这一结果在生物学上是合理的，因为Kloeckera和Hanseniaspora分别代表同一组尖锐酵母的無形和有形阶段，这类酵母通常与酒精发酵的早期阶段相关。这些酵母以其对果酒中酯类物质的产生和香气发展的贡献而闻名[38]。此外，最初被鉴定为Candida rugosa的扩增子序列与GenBank中存储的Diutina rugosa序列100%相同（表3）。表3. Kloeckera sp.、C. rugosa、C. magnoliae和C. zeylanoides扩增子的BLAST结果和鉴定百分比。这种分类重新分配与当前的基于分子的分类一致，后者表明C. rugosa不属于严格意义上的Candida分支，因此被重新分类为Diutina rugosa[39]。该物种被认为具有比某些工程化Saccharomyces cerevisiae菌株更强的木糖代谢能力和乙醇生产潜力，凸显了其在发酵过程中的潜在生物技术价值[40]。BLAST分析还显示C. magnoliae扩增子与Pichia kudriavzevii Gen Bank序列的匹配度为99.77%（表3）。Pichia kudriavzevii是一种非Saccharomyces cerevisiae酵母，已知可以增强葡萄酒的香气；然而，其分子和生化机制尚不清楚[41]。鉴于其在Spondias purpurea L.葡萄酒生产中的新颖性，这将是未来研究的重点。

3.7. 葡萄酒的物理化学特性
为了评估接种剂类型（商业Saccharomyces cerevisiae菌株、S. cerevisiae + Candida联合发酵和自发发酵）以及发酵时间对Spondias purpurea L.手工葡萄酒物理化学特性的影响，进行了双向ANOVA分析。主要因素（处理方法和发酵时间）对每个参数的统计显著性总结在表4中，表4为本节的主要统计支持。表4. 使用不同酵母菌株发酵的葡萄酒物理化学参数的双向ANOVA结果总结。分析显示，接种剂类型对大多数物理化学变量（包括甲醇含量、总酸度、蛋白质浓度、甘油和醇类相关参数）有高度显著影响（p < 0.001）。发酵时间显著影响蛋白质含量、水分、甘油和灰分，反映了葡萄酒基质在发酵过程中的动态生化演变。不同处理方法下的酒精含量存在显著差异（p < 0.05）。仅使用商业S. cerevisiae菌株（CL）发酵的葡萄酒达到更高的乙醇水平（3.72 GL），而联合发酵（CLX）和自发发酵（SL）的酒精水平相似（表4）。Tukey事后分析确认CL与CLX和SL有显著差异，表明单一培养发酵在实验条件下促进了更大的酒精降低。尽管CL的酒精含量最高，但先前的研究表明，混合发酵往往由于非Saccharomyces酵母的代谢贡献而导致较低的乙醇水平但香气更复杂[1,42,43]。初始可溶性固形物含量分别为CL 16.75 °Brix、CLX 15.75 °Brix和SL 14.75 °Brix。这些值决定了果汁的酒精潜力。根据经验关系（1 °Brix ≈ 0.55–0.59% v/v乙醇），估计的酒精潜力在8.1%至9.9% v/v之间，与热带果酒的报告一致[44,45]。然而，实验酒精水平低于理论潜力，表明发酵不完全。特定酶分析法显示所有处理方法下的残留葡萄糖浓度较低：CLX为0.282 ± 0.015 g/L，CL为0.305 ± 0.018 g/L，SL为0.298 ± 0.012 g/L（表4）。这些值证实了葡萄酒的干型特性（残留葡萄糖< 4 g/L），并根据酿酒标准将其归类为干型[46,47]。总糖分析也显示发酵时间和接种剂类型有显著影响（p < 0.0001）[48,49]。商业酵母处理（CL）的残留糖分略高，其次是联合发酵（CLX）和自发发酵（SL）。这表明糖的利用效率受微生物动态的影响，而不仅仅是初始糖浓度。在涉及非Saccharomyces酵母的发酵中也观察到了类似的行为[50,51]。甲醇含量在自发发酵中最高（15.03 mg/mL），其次是CLX（14.84 mg/mL）和CL（8.93 mg/mL）（表4）。甲醇的形成与果肉组织中的果胶降解有关，突出了浸渍控制的重要性[52]。所有值均符合厄瓜多尔NTE INEN 374[38]和国际OIV安全限值[38]。CLX（321.21 mg/mL）和SL（316.05 mg/mL）的酒精含量较高，而CL的酒精含量显著较低（145.30 mg/mL）。混合发酵通过互补的代谢途径增强杂醇和酯类的合成[9,48]，从而提高感官复杂性。总酸度在自发发酵中最高（18.04%），其次是CLX（13.71%）和CL（2.62%）。不同处理方法之间存在显著差异（p < 0.05）。CLX的酸度处于果酒的最佳范围（10–14%）[3]，而SL的高酸度可能会降低感官接受度。挥发性酸度在0.15%至0.23%之间，符合NTE INEN 374的允许范围[14]。CL的甘油含量显著高于CLX和SL（0.46% vs 0.11%）。甘油生成与发酵过程中的乙醇合成和氧化还原平衡有关[53,54]。pH值在2.49至2.56之间，无显著差异。尽管低于典型葡萄酒的pH值，但低pH值增强了微生物稳定性并抑制了腐败微生物[55,56]。干提取物含量在CL中最高（367.97 mg），其次是CLX（305.83 mg）和SL（294.40 mg）。干提取物影响葡萄酒的口感[57]，尽管它与感官偏好无直接关联。表5总结了物理化学参数的详细信息。

3.8. 色彩特性
通过分光光度法定量评估了Spondias purpurea L.葡萄酒的色彩特性。在1:200稀释后，280 nm处测得的总多酚指数为0.650 ± 0.02 AU，表明其多酚含量适中，与经过有限浸渍处理的果酒一致。对特定颜色成分的分析显示，420 nm处的吸光度值为0.016 ± 0.001 AU（黄色/橙色成分），520 nm处的吸光度值为0.005 ± 0.001 AU（与花青素相关的红色成分），620 nm处的吸光度值为0.002 ± 0.001 AU（蓝色/紫色成分）[49,58]。计算出的颜色强度（A420、A520和A620的总和）为0.023 ± 0.002 AU，反映了年轻果酒典型的轻度至中度颜色密度。色调指数（A420/A520）为3.2 ± 0.3，表明颜色中带有明显的黄色调，这可能表明了初始的氧化过程或S. purpurea L.的天然色素组成。这些比色参数证实了葡萄酒保留了果实的明亮红色，并具有无广泛果皮接触的手工生产所需的浅色强度[59]。

3.9. 感官评价
在发酵结束时（第15天），使用五点序数等级量表（1 = “非常不喜欢”，5 = “非常喜欢”）对15名未经培训的评估员进行了感官评价。由于数据的序数性质，感官结果以中位数表示，并应用了非参数统计分析。图8总结了三种发酵处理的综合感官表现，该图通过雷达图比较了颜色、香气、风味、透明度和整体接受度的中位数得分。这种图形表示方法可以全面展示处理依赖的感官差异，并突出每个属性对葡萄酒整体感知的相对贡献。图8. 使用不同接种策略发酵的Spondias purpurea L.葡萄酒的感官特性比较。如图8所示，使用酵母联合发酵（CLX）生产的葡萄酒显示出最平衡的感官特性，在香气和整体接受度方面获得了最高的中位数得分。相比之下，自发发酵（SL）和商业Saccharomyces cerevisiae接种（CL）生产的葡萄酒表现出更不规则的感觉特性，具体得分取决于评估的属性。如图8所示，香气是区分处理方法的最明显指标，CLX达到了最高的中位数得分，显著超过CL和SL（p < 0.05）。这种增强的香气感知与先前的物理化学结果一致，后者显示CLX处理中的高级醇类浓度较高。类似的研究也表明，混合发酵和香气复杂性增加之间的关系是由于S. cerevisiae和非Saccharomyces酵母之间的酯类形成和代谢相互作用[9,49,58,59]。风味感知也呈现类似模式，CLX和SL的中位数得分相似，高于CL的得分。然而，在这一属性上CLX没有表现出明显的优势，这表明风味感知是由多种具有感官活性的化合物相互作用驱动的——包括残留糖分、酸度、甘油和挥发性代谢物——而不是由单一的物理化学参数决定的[53,60,61]。视觉属性也对处理结果的差异有所贡献。如图8所示，CLX获得了最高的透明度评分，其次是SL，而CL葡萄酒的清澈度感知较低。这些差异表明，在手工酿造条件下，酵母的代谢和发酵策略会影响胶体稳定性和视觉质量，而不仅仅是澄清技术的结果[62,63]。总体接受度综合了所有评估属性的综合效果。如图8清楚地显示，CLX葡萄酒获得了最高的整体接受度评分，这证实了混合发酵策略产生了更加和谐的感官特征。尽管商业酵母发酵（CL）生产的葡萄酒具有可接受的风味质量，但其感官特征不如CLX均衡，这进一步强调了本土非酿酒酵母在感官调节中的附加价值。综上所述，图8中的感官结果表明，包含本土Candida物种和S. cerevisiae的混合发酵显著提升了Spondias purpurea L.葡萄酒的感官平衡和消费者接受度。这一发现为关于热带水果葡萄酒的有限文献做出了新的贡献，并突显了本土酵母联合体的生物技术潜力，作为提高手工葡萄酒产品感官质量、地域特色和产品差异化的一种策略[32,35,64,65,66]。

雷达图显示了使用5点愉悦度量表评估的五个感官属性的中位数评分（n = 15位品鉴者）。使用酵母联合体（CLX）发酵的葡萄酒展示了最均衡的感官特征，具有最高的香气和整体接受度评分。商业酿酒酵母发酵（CL）表现出中等的感官表现，而自发发酵（SL）则呈现中等值。CLX葡萄酒观察到的增强香气和整体感官感知与涉及非酿酒酵母的混合发酵中报告的挥发性化合物增加相一致[59]。

3.10. 发酵性能的综合解析
对微生物动态、物理化学演变和感官感知的综合分析清楚地表明，由S. cerevisiae和本土Candida物种组成的混合酵母联合体（CLX）在所评估的处理方法中实现了最均衡和功能最优化的发酵性能。与商业酿酒酵母（CL）的单菌种发酵或未经控制的自发发酵（SL）不同，CLX策略成功地将发酵效率与代谢多样性相结合，从而产生了感官接受度更高且物理化学特征更可控的葡萄酒。从微生物学角度来看，CLX处理在整个发酵过程中维持了稳定的酵母种群，与自发发酵相当，并且显著高于单独使用商业酵母接种的情况[35]。这种行为证实了与非酿酒酵母的协同发酵能够促进微生物稳定性和功能冗余性，降低了发酵过早停止的风险，同时保持了生态韧性，这一点在之前的水果葡萄酒混合发酵研究中也有报道[9,65]。

为了整合接种策略和发酵时间对整个发酵过程的影响，构建了一个比较性的多变量概览（图9），涵盖了主要的微生物、物理化学和感官相关变量（图9）。图9显示了发酵时间和酵母处理对主要测量变量的影响。图表数据对应于4个独立重复实验的平均值±一个标准差（SD）。不同的字母表示处理组之间的显著差异。条形图表示不同接种策略（CL：商业酿酒酵母；CLX：混合联合体；SL：自发发酵）在发酵时间（0、5、10和15天）内的平均值±标准误差。根据Tukey的事后检验（p < 0.05），不同的字母表示统计学上的显著差异。如图9所示，不同处理组的发酵轨迹有明显差异。CLX联合体在整个发酵过程中表现出渐进和稳定的演变，避免了CL（高乙醇和甘油含量，次级代谢物减少）和SL（酸度过高且发酵动力学控制不佳）所观察到的极端代谢结果。这证实了S. cerevisiae和非酿酒酵母之间的协同作用，其中发酵能力和代谢多样性得到了有效整合[9,59,65]。

这些发酵动态对最终葡萄酒质量的影响还通过发酵结束时（第15天）的物理化学参数的比较分析得到了进一步证实（图10）。图10显示了在不同微生物处理下经过15天发酵的手工Spondias purpurea L.葡萄酒的物理化学特征：(A) 乙醇含量（% v/v），(B) 甘油含量（%），(C) 甲醇浓度（mg/L），(D) 高级醇浓度（mg/L）。处理组包括CL（商业酿酒酵母）、CLX（酿酒酵母和本土Candida物种共接种）和SL（自发发酵）。数据代表平均值±SEM（n = 9个生物重复实验）。不同的字母表示每个参数内处理组之间的显著差异（单因素方差分析后进行Tukey的HSD事后检验，p < 0.05）。所有分析均进行了三次重复。物理化学特征显示处理组之间存在明显的代谢权衡。CL处理组生产的葡萄酒乙醇（3.72% v/v）和甘油（0.46%）含量最高，反映出高效的糖转乙醇转化效率，但高级醇（145.3 mg/L）和总酸度（2.62 g/L）的含量最低，因此其香气和酸度特征相对简单。相比之下，SL和CLX发酵生产的葡萄酒高级醇（SL：316.1 mg/L；CLX：321.2 mg/L）和总酸度（SL：18.04 g/L；CLX：13.71 g/L）的含量显著较高——这些化合物与香气复杂性和感官清新度密切相关[9,48,67]。值得注意的是，CLX处理组实现了优化的中等特征，结合了较高的香气潜力与适度的酸度控制。这种平衡的物理化学特征，特别是没有过度酸度的情况下的高级醇含量提高，是本研究的一个关键新发现，并为CLX葡萄酒观察到的提升感官接受度提供了生化基础。

观察到的代谢结果差异与发酵过程中的酵母种群动态密切相关。为了阐明这些效应背后的微生物基础，评估了相对酵母生物多样性的时间演变（图11）。图11显示了在不同发酵时间（0、5、10和15天）下手工Spondias purpurea L.葡萄酒发酵过程中的相对酵母生物多样性。堆叠的条形图表示在PDA培养基上测量的每种处理组（SL、CL和CLX）的可培养酵母的相对丰度（%）。由于所有发酵阶段都没有进行物种水平的量化，酵母生物多样性以相对种群结构表示。如图11所示，酵母生物多样性强烈依赖于发酵时间和接种策略。SL和CLX处理在整个发酵过程中促进了较高的相对酵母丰度，特别是在第10天和第15天，表明了有利于酵母持续活动的生态条件。相比之下，CL处理组的相对酵母贡献持续减少，反映了更为受限的微生物结构。这些结果表明，混合培养发酵在保持过程控制的同时保留了功能多样性，这是相对于单菌种和自发方法的显著优势[48,49,59,62,65]。

总的来说，这项综合评估证实CLX联合体为手工Spondias purpurea L.葡萄酒的生产提供了一种优越的发酵策略。虽然商业酵母单菌种发酵最大化了乙醇和甘油的产量，但这些特性并没有转化为更好的感官表现。相比之下，混合培养方法成功地将酵母代谢调节到了微生物稳定性、物理化学组成和感官质量之间的最佳平衡。这项研究提供了新的实验证据，支持将本土非酿酒酵母联合体作为生物技术工具来提高手工水果葡萄酒的质量、特性和差异化，这与当前可持续和增值发酵过程的趋势一致[4,9,48,63]。

3.11. 酵母群的α多样性分析
为了定量评估接种策略对微生物多样性的影响，在发酵结束时（第15天）计算了每个处理组的α多样性指数。这些指数是根据分子技术识别的酵母物种的相对丰度以及基于PDA和MRS培养基上的平板计数的估计比例得出的（表6）。如表5所示，商业酿酒酵母单菌种发酵（CL）显示出最低的多样性，物种丰富度（S）为1，Shannon（H′ = 0.00）和Simpson（D = 0.00）指数均为零，表明接种菌株完全占主导[66]。相比之下，混合本土联合体（CLX）和自发发酵（SL）支持了更多样化和分布更均匀的酵母群落，每种处理组都包含五个检测到的物种，并且具有更高的Shannon指数（分别为1.35和1.50）。一致地，Simpson指数在CLX（D = 0.66）和SL（D = 0.72）中反映了更大的群落均匀性[66,67]。总体而言，这些发现表明，使用本土酵母联合体接种可以保持与自发发酵相当的微生物多样性水平，而使用商业单菌种接种会导致群落复杂性显著降低。CLX发酵中保持这种微生物多样性可能是其产生的葡萄酒具有增强代谢活性和感官属性的基础[4,68]。

4. 结论
目前越来越关注使用非酿酒酵母进行酒精发酵以增强葡萄酒的复杂性。这一趋势正在改变传统的酿酒实践，这些传统实践历来依赖于酿酒酵母。本研究首次对来自厄瓜多尔Santa Elena的手工Spondias purpurea L.葡萄酒进行了全面的微生物和技术表征，为其生物技术利用奠定了基础。我们对发酵策略的比较分析得出了控制性混合培养优越性的确凿证据。最显著的发现是，由本土Candida物种和S. cerevisiae组成的联合体（CLX）相比商业单菌种培养（CL）或自发发酵（SL），产生了更有利的酿酒结果。虽然商业菌株可预测地最大化了主要代谢物（如乙醇3.72% ABV）和甘油（0.46%），但这种代谢效率并没有转化为感官偏好。相比之下，CLX联合体实现了更好的平衡：它支持了与自发发酵相当的强大微生物种群，同时生产出了高级醇浓度最高的葡萄酒（321.21 mg/L），残余葡萄糖含量低（0.28 g/L），这一点通过特定的酶分析得到了证实，而且酸度水平处于水果葡萄酒的最佳范围内。关键的是，这种优化的化学特征与品鉴者对香气、风味和整体接受度的最高评分直接相关。这表明，对于S. purpurea L.葡萄酒而言，由本土酵母代谢赋予的香气复杂性是决定质量的重要因素，超过了单纯的发酵活力。

本研究的一个新贡献是对驱动这些发酵的具体本土酵母微生物群的分子鉴定。我们超越了表型描述，确认了Hanseniaspora spp.（无形Kloeckera）、Diutina rugosa、Candida zeylanoides和Pichia kudriavzevii在自发过程中的存在。将选定的分离株成功纳入CLX联合体是从生态观察应用到生物技术的关键步骤。此外，所有葡萄酒，包括自发对照组，均符合厄瓜多尔标准NTE INEN 374（2016）和相关的国际安全指南，支持在手工生产中使用本土微生物的卫生可行性。这些结果共同倡导了热带水果葡萄酒酿造方式的范式转变，从不受控制的自发发酵或依赖通用商业酵母转变为设计定制的本土酵母联合体。CLX策略有效地利用了区域微生物多样性，创造了具有独特感官特征的产品，直接满足了人们对表达风土气息的葡萄酒日益增长的需求。尽管这项研究是在实验室规模上进行的，但它为未来的研究指明了清晰的方向。必要的下一步包括扩大生产规模、优化接种方案（例如顺序接种与共接种）以及进行挥发性成分的长期稳定性研究。通过提供这一实证基础，我们的工作旨在为当地生产者提供科学策略，以提高Spondias purpurea L.葡萄酒的质量、一致性和独特性，从而加强这种在厄瓜多尔未被充分利用的热带水果的价值链。