I-TEP：一种简单且经济的方法，用于测量重建组织中的渗透性，并结合DAMO–TSC法进行尿素检测 Yuda? Sahuc、 Elissa Elia、 Christophe Caneparo、 Nathan Félix、 Marilou Hardy、 Stéphane Chabaud 和 Stéphane Bolduc

《Methods and Protocols》：I-TEP: A Simple and Affordable Method to Measure Permeability in Reconstructed Tissues Combined with DAMO–TSC-Based Urea Assay Yuda? Sahuc, Elissa Elia, Christophe Caneparo, Nathan Félix, Marilou Hardy, Stéphane Chabaud and Stéphane Bolduc

　　

跨上皮渗透性是重建组织（尤其是在泌尿生殖组织工程中，必须避免尿液渗漏）的一项关键功能参数。尽管 Franz 扩散池被认为是渗透性测量的金标准，但其成本和有限的可及性限制了其广泛使用。同时，由于蛋白质干扰和检测成本，培养基中尿素的可靠定量仍然具有挑战性。 Inexpensive Trans-Epithelial Permeability (I-TEP) 测试是一种简单、低成本的类 Franz 渗透性系统，可与优化的二乙酰一肟-氨基硫脲 (DAMO–TSC) 比色法尿素检测相结合。I-TEP 系统利用易于获取的实验室组件创建物理分离的供体室和受体室，组织作为唯一的扩散界面。通过对去蛋白化、孵育时间、储存条件和血清干扰的系统评估，优化了 DAMO–TSC 检测。在测试相似组织样本时，I-TEP 测试与传统 Franz 扩散池显示出很强的相关性。去蛋白化被确定为在含血清培养基中准确定量尿素的必要步骤。该组合方法已成功应用于工程化泌尿生殖组织，证明了对组织成熟度和细胞组成的敏感性。本方案为常规渗透性评估提供了一种经济、稳健且自主的方法的概念验证，弥合了昂贵的商业系统与高通量实验需求之间的差距。

本研究旨在解决在组织工程（特别是泌尿生殖组织工程）领域中，对重建组织的跨上皮渗透性进行功能评估时所面临的高成本和技术门槛问题。目前，评估组织渗透性的金标准方法是 Franz 扩散池，但其昂贵的设备费用限制了其在研究中的普及，尤其是对于使用频率不高的实验室。同时，在含蛋白质的培养基中进行尿素定量也存在挑战。因此，研究人员开发了一种低成本、易于操作的替代方案——I-TEP (Inexpensive Trans-Epithelial Permeability) 测试系统，并结合了一种优化的 DAMO–TSC (diacetyl monoxime–thiosemicarbazide) 比色法用于尿素检测，以提供一种可负担且可靠的评估方法。

为开展本研究，研究人员主要应用了三种关键技术方法：

1. 1.
   三维组织构建：采用自组装技术和胶原凝胶技术制备用于测试的泌尿系统三维组织模型。样本细胞来源于人类捐赠者，包括尿道尿路上皮细胞 (UUCs)、膀胱尿路上皮细胞 (BUCs) 以及从尿道、膀胱和皮肤活检中分离的成纤维细胞 (UFs, BFs, DFs)。
2. 2.
   I-TEP 渗透性测试：设计了一套利用标准实验室耗材（如带滤膜的插入式培养皿、克隆环、O型圈等）组装的自制渗透性测试装置。该装置模拟 Franz 扩散池原理，将组织样本置于供体室和受体室之间，通过测量尿素等分子从供体室穿过组织进入受体室的通量来评估组织渗透性。
3. 3.
   DAMO–TSC 尿素定量分析：优化并应用了一种基于二乙酰一肟 (DAMO) 和氨基硫脲 (TSC) 的比色法，用于定量分析受体室培养基中的尿素浓度。该方法涉及在强酸条件下尿素与 DAMO 反应生成有色复合物，并通过测量其在 520 nm 处的吸光度来确定浓度。研究特别针对含血清样本，优化并强调了去蛋白化步骤的必要性。

研究结果

5.1. I-TEP 测试结果与 Franz 扩散池测试结果具有可比性

为验证 I-TEP 系统的有效性，研究人员使用相同的自组装法重建的膀胱组织样本，分别用 Franz 扩散池和 I-TEP 系统进行测试，并采用医院生化实验室的检测方法（或 DAMO–TSC 法）对尿素进行定量。结果显示，两种技术测得的尿素渗透量具有强相关性，且各时间点数据无显著差异。这表明 I-TEP 测试可以作为一种可靠的替代方法。

5.2. 培养基成分等环境变量的影响

研究人员在不同介质（水、无血清 UC 培养基、去蛋白化的含 5% 血清 UC 培养基）中制备尿素标准曲线。结果显示，在无蛋白质的溶液中，标准曲线轮廓相似。然而，在含有少量蛋白质的 KSFM 培养基中，标准曲线的绝对值存在差异，这引发了对含蛋白质样品是否需要去蛋白化的疑问。

5.3. 含蛋白质样品需要进行去蛋白化

通过比较含不同浓度血清的培养基中，未经处理与经去蛋白化处理的样品标准曲线，研究人员发现，未经处理的样品标准曲线线性较差 (R²在 0.693 到 0.9632 之间)，而去蛋白化条件下的标准曲线则显示出稳健的线性关系 (R²在 0.9481 到 0.9997 之间)。此外，未去蛋白化样品的校准曲线斜率随血清浓度增加而显著升高，最高可达去蛋白化条件的两倍。这些结果证实，去蛋白化是确保准确定量的必要步骤。

5.4. 尿素的冷冻保存

比较新鲜制备与在 -80 °C 下保存 4 个月的尿素标准溶液，结果显示二者在大部分浓度下无显著差异，仅在较高浓度时存在微小差别，且曲线斜率略有不同。这表明储存条件影响有限，但为获得最佳精度，建议使用与样品相同溶液新鲜制备的标准曲线。

5.5. 在 95 °C 下孵育 13 或 15 分钟可产生更高信号

对 95 °C 孵育时长的测试表明，信号在孵育 13 分钟时达到平台期。因此，选择 15 分钟作为标准孵育时间，以确保最大准确度并最小化变异。

5.6. 使用生物样本进行验证

将 I-TEP 测试应用于由不同操作者使用不同技术（胶原凝胶和自组装）构建的组织样本。在胶原凝胶组织中，未经去蛋白化处理的样品测量值超出了理论最大浓度（2 g/L），而去蛋白化样品则显示出合理的饱和曲线。去蛋白化后，不同培养条件（FBS-H, PPP, PRP）下的组织渗透性差异得以显现，并与组织学观察到的上皮完整性相关。在自组装组织中也观察到类似结果：完全由尿道细胞构成的构建体渗透性近乎为零，而混合细胞构建体渗透性较高，这与组织学观察到的上皮形态差异一致。

讨论与结论

讨论：本研究的主要目的是验证 I-TEP 系统作为 Franz 扩散池系统的可行替代方案。结果显示两者高度相关。I-TEP 系统存在一些局限性，例如插入物的小体积可能对某些粘性组织的操作造成困难；对于评估某些分子的扩散，受体室的搅拌可能有益，这可通过加入微型磁力搅拌子实现。DAMO–TSC 检测需要增加去蛋白化步骤，这增加了工作流程的复杂性和潜在人为误差，但对于确保含血清样品检测的准确性是必要的。未来开发标准化的去蛋白化试剂盒或自动化离心过滤步骤可改进此流程。需注意 DAMO–TSC 检测对实验条件敏感，不同批次间可能存在异质性，因此最好在同一批次检测内进行比较，或在实验前将培养基更换为无蛋白培养基（因孵育时间短）。本研究使用尿素作为参考分子评估上皮渗透性，未来可结合使用亲水性和亲脂性探针分子（如咖啡因和睾酮）来更全面地表征屏障特性。实验平均使用了 3 个重复，需进一步验证以确认结果。I-TEP 系统最重要的优势在于其低成本特性。成本分析表明，进行超过 500 个样品检测时，I-TEP 系统的总成本仍低于 Franz 扩散池系统。此外，结合 DAMO–TSC 方法，研究团队可实现完全自主，不再依赖外部第三方（如临床生化实验室），并大幅降低检测成本（DAMO–TSC 的成本约为商品化脲酶试剂盒的 1/133）。I-TEP 系统与标准多孔板兼容，无需专业设备即可实现高通量筛选，填补了高端“芯片器官”系统与传统方法之间的空白，为常规 3D 组织屏障功能评估提供了实用方案。

结论：I-TEP 系统为小型研究单元普及渗透性测试提供了可能。因此，该系统与标准多孔板的兼容性使得无需专业设备（仅需标准培养箱和分光光度计）即可对 3D 组织进行高通量筛选。此系统弥合了高科技“器官芯片”系统与传统方法之间的差距，为 3D 组织屏障功能的常规评估提供了一个实用的解决方案。