在TMTPro Zero标记后，利用反相液相色谱-质谱联用技术检测高度亲水的糖肽

《Carbohydrate Polymers》：Detection of highly hydrophilic glycopeptides in reverse-phase liquid chromatography-mass spectrometry after TMTPro Zero labeling

　　

Dario A.T. Cramer | Anabel Torrente-López | Alan B. Moran | Carolien A.M. Koeleman | Ali Al Kaabi | Chakkumkal Anish | Michel Beurret | Manfred Wuhrer

莱顿大学医学中心蛋白质组学与代谢组学中心，Albinusdreef 2, 2333, ZA, 莱顿, 荷兰

摘要

通过液相色谱-质谱（LC-MS）进行自下而上的分析在检测和相对定量每个糖基化位点的所有糖肽形式方面起着关键作用。特别是反相（RP）纳米LC-MS技术由于其灵敏度和可访问性，常用于分析高度糖基化的蛋白质。然而，分析具有大且多样化的糖链的糖肽时存在挑战，例如色谱保留时间不足且变化较大。具体来说，由短亲水性肽段和长亲水性糖链组成的亲水性糖肽无法被有效保留。我们提出了一种RP-nanoLC-MS方法，可以对高度亲水性糖肽进行全面表征。通过将氨基反应性且相对疏水的TMTPro Zero标记物共价连接到所有（糖）肽上，增强了糖肽的保留效果。为了进一步提高保留效果，使用了内切蛋白酶Lys-C进行蛋白水解，生成了带有两个TMTPro Zero标签的糖肽，从而实现了最亲水性糖肽分析物的RP保留。该方法应用于两种大肠杆菌O-抗原生物偶联物，这些生物偶联物含有复杂多样的N-糖肽，其糖链长度从4个单糖到超过70个单糖不等。这种优化方法使得能够对具有高度亲水性大糖链的糖蛋白进行自下而上的分析，支持全面的位点特异性糖基化分析。

假设

利用TMTPro Zero标记和质谱技术可以检测和表征具有不利色谱特性的不同糖肽。

章节摘录

缩写

EPA
铜绿假单胞菌
GlcNAc
N-乙酰葡糖胺
Hex
己糖
HexNAc
N-乙酰己糖胺
Man
甘露糖
ManNAc
N-乙酰甘露糖胺
Rha
鼠李糖
MS
质谱
RP
反相
LC
液相色谱
RU(s)

材料

本研究中使用的所有化学品均至少达到分析级质量。碳酸氢铵、HEPES、DL-二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）和三氟乙酸（TFA）购自Sigma-Aldrich（德国Steinheim）。LC-MS级别的乙腈（ACN）来自Biosolve（荷兰Valkenswaard）。Rapigest SF表面活性剂购自Waters（美国Milford）。羟胺溶液由Cayman Chemical（美国Ann Arbor）提供。

多糖糖肽的分析

我们使用三种不同的样品制备方法（未标记Tryp、标记Tryp和Lys-C标记）分析了不同且高度异质的细菌糖缀合物衍生的糖肽。我们分析了来自两种大肠杆菌O1A1和O8血清型（以下简称O1A1/O8）的O-抗原（糖）生物偶联物，这些生物偶联物的糖链长度和亲水性各不相同。O1A1糖链由三个鼠李糖和两个N-乙酰己糖胺组成。

结论

实验表明，TMTPro Zero标记结合替代消化策略可以检测到含有高度亲水性多糖链的短亲水性肽。尽管这些糖肽具有异质性，但由于不同多糖重复单元（RU）的质量差异，它们可以有效地分离，并且非常适合通过RP-nanoLC-MS进行表征和定量。任何共洗脱的物种都可以通过其独特的质谱差异进行单独分析。

CRediT作者贡献声明

Dario A.T. Cramer：撰写 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、数据可视化、验证、软件使用、方法学设计、实验研究、数据分析、数据整理。Anabel Torrente-López：撰写 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、数据可视化、验证、软件使用、方法学设计、实验研究、数据分析、数据整理。Alan B. Moran：撰写 – 审稿与编辑、资源协调、项目管理、实验研究。Carolien A.M. Koeleman：方法学设计、数据分析。Ali Al

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务关系/个人关系：Alan B. Moran与Janssen Vaccines and Prevention BV有雇佣关系。Ali Al Kaabi与Janssen Vaccines and Prevention AG有雇佣关系。Chakkumkal Anish与Janssen Vaccines and Prevention BV有曾雇佣关系。Michel Beurret与

致谢

本工作得到了强生创新医药（Janssen Vaccines and Prevention B.V.）的支持。