通过高长径比液滴微流控技术高效制备单分散磁性PAM-PEG微球，以实现高效且选择性的His标签蛋白纯化

《Chemical Engineering Journal Advances》：High-throughput fabrication of monodisperse magnetic PAM-PEG microspheres via high-aspect-ratio droplet microfluidics for efficient and selective his-tagged protein purification

　　李文尧|王新玲|徐娜|杨文杰|陈玉实|罗胜楠|马芳|陈慧萍|张子森|张立国
河南医学与制药科学院代谢失调与食管癌防治国家重点实验室，郑州大学，郑州450052，中国

摘要
开发具有均匀粒径、高机械强度和特异性结合能力的色谱介质对于高效蛋白质纯化至关重要。然而，传统方法通常存在颗粒大小多分散和磁含量低的问题，限制了其分离效率和可扩展性。在此，我们报告了一种可扩展的策略，将高长宽比（HAR）多通道微流控技术与稳健的物理化学修饰方法相结合，制备出单分散的聚丙烯酰胺-聚乙二醇（PAM-PEG）磁性微球。优化后的HAR微流控芯片能够实现高通量生产微球，其变异性系数（CV）低至3.98%。随后通过加入PEG修饰的Fe?O?纳米粒子，赋予微球超顺磁性（饱和磁化强度：40.9 emu/g）并提高了机械韧性。通过碱性水解、EDC/NHS活化、硝基三乙酸（NTA）接枝和Ni2?螯合等一系列表面功能化处理，所得PAM-PEG@Fe?O?-PEG@NTA-Ni2?微球具有高达50.17 μmol/mL的镍负载能力。这些微球表现出约44 mg/mL的特异性蛋白质吸附能力，并在从复杂生物基质中捕获His标记蛋白方面表现出优于商业产品的选择性，同时在纯度和非特异性结合减少方面也有优势。本研究为下一代高通量、功能定制的生物分离介质提供了一个有前景的平台。

引言
重组蛋白的大规模生产和高效纯化是现代生物技术和制药工业中的关键过程[1]。在各种纯化技术中，利用组氨酸标签（His-tag）技术的固定化金属亲和色谱（IMAC）[2]因其简单性、选择性和成本效益而成为事实上的标准。尽管应用广泛，但目前基于琼脂糖等软水凝胶的纯化介质的性能时常受到固有局限性的制约，包括颗粒大小分布宽导致背压高、机械强度低限制高流量应用以及磁响应性不足导致分离速度慢等问题。

微流控技术已成为合成具有极佳均匀性（单分散性）微球的强大工具[4]。通过精确操控流体界面，该技术可以生成粒径分布狭窄的模板微滴，克服了传统乳化方法的随机性[5]。然而，将微流控合成技术转化为工业规模生产[6]受到传统单通道微流控芯片（如T型[7]、Y型[8]和流动聚焦设计[9,10]固有低通量的限制。虽然多通道并行化提供了潜在解决方案，但在多个通道中保持微滴均匀性和稳定性仍是一个重大挑战[11]。最近在高长宽比（HAR）通道[12]设计方面的进展显示出提高微滴形成频率的潜力，但将这些设计与用于生物分离应用的功能材料相结合仍需进一步创新。此外，合成聚合物微球（如聚丙烯酰胺）[13]的表面功能化常常面临修饰效率低和配体分布不均的问题，导致结合能力不佳[14]。为了解决这些多方面的挑战，我们提出了一种将高通量HAR微流控技术与混合物理化学修饰方法相结合的新策略[16]。

在本研究中，我们设计了一种定制的28通道HAR微流控芯片，以实现PAM-PEG微球的可扩展和可重复制备。为了增强机械性能并提供锚定点，在聚合物网络中预先交联了PEG。我们进一步通过物理交联固定了PEG包覆的Fe?O?纳米粒子，确保了强大的磁响应性。然后对微球进行了系统的四步化学修饰（水解-活化-接枝-螯合），生成了密集的Ni-NTA配体阵列。我们假设这种综合方法将产生尺寸均匀、机械强度高、磁含量高且蛋白质结合能力出色的微球。这些定制微球在纯化His标记模型蛋白方面的性能经过严格评估，证明了它们作为高效生物分离介质的潜力。

材料与方法
丙烯酰胺（AM）、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）、聚乙二醇（PEG）、过硫酸铵（APS）、N,N,N',N'-四甲基亚乙基二胺（TEMED）、矿物油、正己烷、EM90、PDMS、十八烷基三甲硅基（OTS）、氢氧化钠、硫酸亚铁、氯化铁、氨溶液、柠檬酸（CA）、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、硝酸钠（NTA）和硫酸镍均购自Aladdin Reagent（上海）有限公司。无水乙醇和尿素购自Sinopharm Chemical Reagent有限公司，抗体由沈阳万来生物技术有限公司提供。所有试剂均按原样使用，无需进一步纯化。

高长宽比多通道微流控结构的设计
使用CAD软件设计了不同长宽比的微通道，并通过软光刻技术制造成微芯片。为了增强微滴操控性和稳定性，芯片表面进行了OTS硅烷化处理，显著提高了疏水性。通道深度固定为25 μm，宽度分别为5、10、15、20、25和50 μm，以系统研究长宽比对微滴生成性能的影响。

聚丙烯酰胺微球的制备
称量了30% AM的特定体积，并称取适量的引发剂APS、催化剂TEMED和PEG，均匀混合后置于冰浴中作为分散相。准备了含有EM90和正己烷的矿物油混合物作为连续相。将微流控芯片浸入连续相中，芯片的液体入口通过柔性管连接到注射泵，再与分散相储液器相连。逐渐调节压力，施加900 mbar的分散相压力以生成约60 μm大小的微滴。生成预聚物微滴后，通过加热将其固化成微球。收集的微球通过吸滤法与油相分离，随后用石油醚清洗（3-5次），再用20%乙醇（3-5次）和去离子水（3-5次）清洗，最终得到预交联的聚丙烯酰胺微球（PAM-PEG）。

聚丙烯酰胺微球的磁化
通过共沉淀法合成Fe?O?磁性纳米粒子。为了在后续修饰过程中保持磁性能，采用了两种表面修饰策略——柠檬酸（CA）和PEG涂层——分别得到Fe?O?-CA和Fe?O?-PEG纳米粒子。将过量纳米粒子与PAM-PEG微球混合后，在氮气氛围下分散在脱氧水中。悬浮液在室温下以600 rpm的转速机械搅拌4小时，使磁性颗粒有效结合。这一过程得到了两种磁化的微球配方：PAM-PEG@Fe?O?-CA和PAM-PEG@Fe?O?-PEG，可用于进一步功能化。

磁性亲和纯化介质的制备
磁性亲和纯化介质的制备包括多步骤过程：碱性水解、活化、接枝和金属离子螯合。反应过程的视觉监控至关重要，颜色变化是反应完成的关键指标。然而，磁化微球呈深黑色，阻碍了颜色变化的观察；未修饰的PAM-PEG微球保持白色，便于清晰观察化学变化。因此选择PAM-PEG微球作为理想基质。它们在每个反应阶段的可见颜色变化为评估反应效率提供了可靠依据。根据这些可观察指标，系统优化了实验条件以最大化Ni2?负载能力。使用优化参数成功制备了高性能的磁性亲和纯化介质，提高了目标蛋白的捕获和纯化效率。

**碱性水解**[17]：PAM-PEG微球在加热条件下进行碱性水解，将酰胺基团转化为羧酸基团并释放氨。未反应的NaOH和溶解的铵副产物通过真空过滤和彻底清洗去除。为了将羧酸基团质子化，用标准化0.5 mol/L HCl溶液处理，确保完全转化为羧酸并中和残留碱。
**活化**[18]：将水解后的微球分散在100 mL 0.1 mol/L MES缓冲液（pH 6.0）中。随后加入0.8 g EDC和1.4 g NHS以引发碳二亚胺介导的活化反应。反应混合物在冰浴中搅拌以减少副反应，然后在4°C下以130 rpm的转速振荡孵育。完成后，通过过滤收集活化微球并用纯水洗涤三次以去除多余的EDC和NHS。
**接枝**[19]：将活化微球重新悬浮在含有0.2 mol/L NTA的100 mL PBS缓冲液（pH 7.4）中。接枝反应在室温下持续振荡（130 rpm）进行过夜，使NTA共价连接到微球表面的羧基上。未结合的NTA通过三轮真空过滤和超纯水洗涤去除。
**螯合**[19]：通过将2.63 g NiSO?·6H?O溶解在100 mL PBS缓冲液（pH 7.4）中进行镍离子螯合。将NTA接枝的微球引入镍溶液中，在恒温下振荡（130 rpm）以促进NTA与Ni2?的配位。通过三轮超纯水过滤洗涤去除多余的未螯合镍离子，得到最终负载Ni2?的磁性亲和纯化介质。与预期相反，随着n-十六烷含量的增加——由于其粘度低于矿物油——整体连续相的粘度反而降低了（图4c）。实验表明，当连续相的粘度高于含有25% n-十六烷的矿物油时，液滴大小保持一致，但均匀性下降了。因此，选择了含有25% n-十六烷的矿物油作为最佳连续相，因为它既实现了高液滴均匀性，又保证了生成的稳定性。液滴形成过程如图4d所示，在相同条件下，单通道T形芯片的液滴生成速率约为170滴/分钟，而矿物油为60滴/分钟。

在定制的微流控芯片中，系统地研究了关键参数（包括单体浓度、引发剂、交联剂、催化剂、乳化剂、固化时间和温度）对微球形成的影响。优化的分散相组成如下：30%丙烯酰胺单体（单体：交联剂=29:1），1%过硫酸铵（APS）作为引发剂，0.005% TEMED作为催化剂，以及5%聚乙二醇（PEG）。连续相由添加了25% n-十六烷的矿物油和3% EM90乳化剂组成。固化过程在90°C下进行4小时。将含有PAM微球的20 μL溶液滴在玻璃片上。使用光学显微镜观察微球的形态，并测量了200个微球的直径。计算平均粒径后，使用公式1确定变异系数（CV）：
(1) CV = {∑i=1n(di?d)2/n}1/? / d
d：计数的微球平均直径，单位为μm；di：单个微球的直径，单位为μm；n：计数的微球数量。
在这些最佳条件下，得到的PAM-PEG微球在光学显微镜下显示出均匀、定义明确的球形形态和粗糙的表面纹理。平均粒径约为60 μm，变异系数（CV）为3.98%，表明尺寸分布狭窄且均匀。将其浸入各种化学试剂（包括30%异丙醇、1% SDS、8 M尿素和2 M NaOH）24小时后，微球仍保持其完整的球形结构，显示出出色的化学稳定性。值得注意的是，PEG的预交联显著增强了微球的机械强度。详细的实验数据见补充材料。

通过共沉淀合成的Fe?O?纳米颗粒[21]分别用柠檬酸（CA）[22]和聚乙二醇（PEG）[23]进行独立的功能化处理。傅里叶变换红外光谱（FTIR）（图5a）显示在562 cm?1处有明显的Fe–O伸缩振动峰[24]，这是Fe?O?的特征标志，证实了合成成功。如图5b所示，经过CA修饰后，Fe–O峰移至580 cm?1，表明CA的羧基与表面铁离子发生了化学配位。在1632 cm?1和1409 cm?1处出现的不对称和对称的羧酸基伸缩振动进一步证实了CA的结合。1120、1038和963 cm?1处的额外峰归属于柠檬酸中的C–O伸缩或C–O–H弯曲模式，而3415 cm?1处的宽峰对应于O–H伸缩，但其位置和形状受到与羧基氢键的影响。在图5c中，经过PEG修饰后，Fe–O峰进一步移至592 cm?1，表明PEG通过末端羟基发生了共价连接。1117 cm?1处的强吸收归属于C–O–C伸缩，这是PEG链的特征。1259 cm?1（C–O/C–C振动）、1377 cm?1（CH?弯曲）、3432 cm?1（O–H伸缩）和1634 cm?1（H–O–H弯曲）的峰进一步证实了PEG的接枝，并表明修饰后的颗粒仍具有显著的亲水性。

XRD图谱（图5d）在2θ = 18.1°、30.1°、35.5°、43.0°、53.8°、57.3°和62.8°处显示出清晰的衍射峰，这些峰对应于反尖晶石Fe?O?的（111）、（220）、（311）、（400）、（422）、（511）和（440）晶面[25]，证实了高结晶度。振动样品磁强（VSM）测量（图5e）显示，未经修饰的Fe?O?的饱和磁化为71.9 emu/g，与块状磁铁矿一致，表明具有强的磁响应。经过表面修饰后，Fe?O?-CA的饱和磁化强度略微降低至70.7 emu/g，Fe?O?-PEG的饱和磁化强度进一步降低至64.6 emu/g，表明非磁性的PEG层减弱了整体的磁性。虽然纯Fe?O?具有最高的磁强度，但其疏水性表面促进了聚集。相比之下，CA和PEG的修饰引入了亲水性功能，增强了胶体稳定性和生物相容性[26,27]。值得注意的是，Fe?O?-CA保持了接近块状材料的磁性质，而Fe?O?-PEG在保持某些磁性能的同时改善了分散性。动态光散射（DLS）分析（图5f）显示，未经修饰的Fe?O?颗粒表现出宽的流体动力学尺寸分布（400–1400 nm），峰值在955.4 nm，体积分布强度为20.9%。经过CA修饰后，分布显著缩小至200–800 nm，峰值为396 nm（强度为20.2%）。Fe?O?-PEG的分布略宽，范围为300–800 nm，峰值为531.1 nm，但体积强度显著增加到27.0%。修饰后峰值的减小表明表面配体减小了有效流体动力学直径，可能是由于脱聚作用[28,29]。尺寸分布的显著缩小和体积峰强的增加证实了表面功能化有效抑制了颗粒聚集。特别是PEG化显著提高了单一分散性和胶体稳定性，表明表面工程显著改善了Fe?O?纳米颗粒的均匀性和分散性[30]。

光学显微镜（OM）图像（图6a1和b1）显示，通过PAM-PEG与Fe?O?-CA和Fe?O?-PEG磁性纳米颗粒的物理交联制备的磁性复合微球表现出优异的球形度和淡黄色外观。值得注意的是，PAM-PEG@Fe?O?-PEG微球的颜色比PAM-PEG@Fe?O?-CA微球更深，表明颗粒分散或相互作用存在差异。扫描电子显微镜（SEM）观察（图6a2和b2）进一步证实了形成定义明确、表面粗糙的球形微球。能量分散X射线光谱（EDS）映射（图6a3和b3）清晰地显示了铁（Fe）元素的均匀分布，证实了磁性纳米颗粒在复合微球基质中的均匀结合和空间分布。

FTIR光谱（图7a–c）显示PAM-PEG@Fe?O?-CA的Fe–O伸缩振动峰在597 cm?1，PAM-PEG@Fe?O?-PEG的Fe–O伸缩振动峰在575 cm?1，两者均显示出增强的强度和清晰度。这些特征吸收证实了Fe?O?纳米颗粒成功结合到微球中，表明有效的磁化。XRD图谱（图7d）在2θ = 30.2°、35.7°、43.1°、53.7°、57.4°和63.0°处显示出清晰的衍射峰，对应于立方尖晶石Fe?O?的（220）、（311）、（400）、（422）、（511）和（440）晶面。清晰的峰和最小的背景噪声表明高结晶度以及Fe?O?核心在PAM-PEG基质内的成功封装。VSM分析（图7e）显示，原始Fe?O?的饱和磁化为71.9 emu/g，与块状磁铁矿一致，表明具有强的磁响应。表面修饰后，Fe?O?-CA的饱和磁化强度略微降低至70.7 emu/g，Fe?O?-PEG的饱和磁化强度进一步降低至64.6 emu/g，表明非磁性的PEG层减弱了整体磁性。尽管纯Fe?O?具有最高的磁强度，但其疏水性表面促进了聚集。相比之下，CA和PEG的修饰引入了亲水性功能，增强了胶体稳定性和生物相容性[26,27]。值得注意的是，Fe?O?-CA保持了接近块状材料的磁性能，而Fe?O?-PEG在分散性上有所牺牲。DLS分析（图5f）显示，未经修饰的Fe?O?颗粒表现出宽的流体动力学尺寸分布（400–1400 nm），峰值为955.4 nm，体积分布强度为20.9%。经过CA修饰后，分布显著缩小至200–800 nm，峰值为396 nm（强度为20.2%）。Fe?O?-PEG的分布稍宽，范围为300–800 nm，峰值为531.1 nm，但体积强度显著增加至27.0%。修饰后峰值的减小表明表面配体减小了有效流体动力学直径，可能是由于脱聚作用[28,29]。尺寸分布的显著缩小和体积峰强的增加证实了表面功能化有效抑制了颗粒聚集。特别是PEG化显著提高了单一分散性和胶体稳定性，表明表面工程显著改善了Fe?O?纳米颗粒的均匀性和分散性。

PAM-PEG微球被用作功能基质，在碱性条件下其表面酰胺基团被水解生成羧基[17]。随后使用EDC/NHS化学方法[18]激活这些羧基，以便与硝基三乙酸（NTA）共价偶联，然后螯合镍离子[19]，最终得到亲和纯化介质。通过酸碱滴定[31]量化羧基含量，并通过EDTA滴定[32]确定镍离子的负载能力。一系列系统优化实验确定了最佳参数：碱性水解（0.6 mol/L NaOH，5 h，40°C）、激活（40 mM EDC，pH 6，10 min）和螯合（7 h，40°C）。微球的体积密度确定为0.0455 g/mL[33]。这些优化研究的详细结果见补充材料。

将优化后的方案应用于PAM-PEG@Fe?O?-PEG微球基质，制备了PAM-PEG@Fe?O?-PEG@NTA-Ni2?磁性亲和介质。光学显微镜（OM，图8a）显示均匀的球形微球，呈淡黄色。扫描电子显微镜（SEM，图8b）证实了它们的球形形态，并显示出粗糙的表面纹理。能量分散X射线光谱（EDS）元素映射（图8c和d）清晰地显示了铁（Fe）元素的球形分布，证实了磁性纳米颗粒在复合微球基质中的均匀结合和空间分布。

复合微球的颗粒尺寸分布通过激光粒度分析[34]确定，如图9a所示。微球的平均直径为65.7 μm，多分散指数为0.57，一致性指数为0.177，表明尺寸分布相对狭窄且均匀。比表面积为89.36 m2/kg，表明具有较高的表面积，有利于高效的蛋白质亲和吸附。

热重分析（TGA）结果如图9b所示。在95.29°C时初始重量损失为7.98%，归因于吸附水分的蒸发和PEG侧链的分解。主链降解始于289.07°C，最大降解率发生在310.16°C。在404.90°C和419.62°C处的额外分解峰导致额外的32.23%重量损失，可能是由于PAM骨架的分解和残留PEG成分的氧化。在625.66°C和645.96°C处的进一步质量损失导致额外的18.69%损失，可能是由于有机残留物的碳化和Fe?O?的部分氧化。总体而言，材料在300°C以下损失了大约8%的重量，在300°C至420°C之间发生主要结构分解，在650°C时保留了约32.26%的初始质量，表明具有优异的热稳定性。XRD图谱（图9c）证实了Fe?O?尖晶石结构的完整保存，其中明显的衍射峰表明高结晶度和相纯度。振动样品磁强（VSM）数据（图9d）显示，两种复合材料的饱和磁化强度均为40.9 emu/g，表明超顺磁性或铁磁性质得到了很好的保持。这种显著的差异突出了PEG改性系统在磁性含量和效率上的优越性。表面结合的PEG链与PAM-PEG基质之间的良好兼容性源于强烈的物理缠结和化学相似性。在复合材料形成过程中，亲水、柔性和延展的PEG链促进了深入渗透和与基质的牢固整合，增强了颗粒分散性、界面粘附性和整体负载能力。这种有益的相互作用不仅防止了聚集，还最大化了磁性能，从而提高了净磁矩。

PAM-PEG微球作为功能基质，在碱性条件下其表面酰胺基团被水解生成羧基[17]。随后使用EDC/NHS化学方法[18]激活这些羧基，以便与硝基三乙酸（NTA）共价偶联，然后螯合镍离子[19]，最终得到亲和纯化介质。通过酸碱滴定[31]量化羧基含量，并通过EDTA滴定[32]确定镍离子的负载能力。一系列系统优化实验确定了最佳参数：碱性水解（0.6 mol/L NaOH，5 h，40°C）、激活（40 mM EDC，pH 6，10 min）和螯合（7 h，40°C）。微球的体积密度确定为0.0455 g/mL[33]。这些优化研究的详细结果见补充材料。

将优化后的方案应用于PAM-PEG@Fe?O?-PEG微球基质，制备了PAM-PEG@Fe?O?-PEG@NTA-Ni2?磁性亲和介质。光学显微镜（OM，图8a）显示均匀的球形微球，呈淡黄色。扫描电子显微镜（SEM，图8b）证实了它们的球形形态，并显示出粗糙的表面纹理。能量分散X射线光谱（EDS）元素映射（图8c和d）清晰地显示了铁（Fe）和镍（Ni）元素的共定位和球形分布，证实了磁性氧化铁和镍螯合功能团在微球内的均匀结合和分散。

复合微球的颗粒尺寸分布通过激光粒度分析[34]得出，如图9a所示。微球的平均直径为65.7 μm，多分散指数为0.57，一致性指数为0.177，表明尺寸分布相对狭窄且均匀。比表面积为89.36 m2/kg，表明具有较高的表面积，有利于高效的蛋白质亲和吸附。

热重分析（TGA）结果如图9b所示。在95.29°C时初始重量损失为7.98%，归因于吸附水分的蒸发和PEG侧链的分解。主链降解开始于289.07°C，最大降解率出现在310.16°C。在404.90°C和419.62°C处的额外分解峰导致额外的32.23%重量损失，可能是由于PAM骨架的分解和残留PEG成分的氧化。在625.66°C和645.96°C处的进一步质量损失导致额外的18.69%损失，可能是由于有机残留物的碳化和Fe?O?的部分氧化。总体而言，材料在300°C以下损失了大约8%的重量，在300°C至420°C之间发生主要结构分解，在650°C时保留了大约32.26%的初始质量，表明具有优异的热稳定性。XRD图谱（图9c）证实了Fe?O?尖晶石结构的保存，其中明显的衍射峰表明高结晶度和相纯度。尽管经历了广泛的表面修饰和功能化过程（包括碱性水解、EDC/NHS激活和Ni2?螯合），磁性核心的晶体结构仍然完整，强调了Fe?O?纳米颗粒的稳健性。

振动样品磁强（VSM）数据（图9d）显示最终磁性复合微球的饱和磁化为40.9 emu/g。这种高的磁响应在多次化学修饰后仍然保持，表明超顺磁性或铁磁性质得到了很好的保持。通过X射线光电子能谱（XPS）研究了PAM-PEG@Fe?O?-PEG@NTA-Ni2?微球的表面元素组成和化学状态，代表性光谱如图10所示。调查光谱（图10a）显示存在C、N、O、Fe和Ni元素，其原子百分比分别为51.07%、10.22%、28.52%、4.13%和6.06%，证实了所有目标元素的成功结合。下载：下载高分辨率图像（418KB）下载：下载全尺寸图像

图10. PAM-PEG@Fe?O?-PEG@NTA-Ni2?微球的XPS光谱：(a) 全部调查光谱；(b) C1s高分辨率光谱；(c) N1s光谱；(d) O1s光谱；(e) Fe 2p光谱；(f) Ni 2p光谱。
高分辨率的C1s光谱（图10b）被分解为三个组分：主要的C-C/C-H峰来自PAM和PEG聚合物框架；C-O峰对应于PEG中的醚键合以及可能的氧化碳物种；而C=O峰归因于PAM中的酰胺羰基和硝基三乙酸（NTA）结构中的羧基。
N1s光谱（图10c）在特征结合能处显示出一个强烈的峰值，直接证明了PAM骨架和NTA配体结构中存在酰胺键。

O1s光谱（图10d）的分解显示出两个贡献：O-lat组分与Fe?O?纳米粒子中的晶格氧相关，而O-sur峰来源于表面羟基、羧酸氧、吸附的水以及在Fe?O?上配位的OH基团。
Fe 2p光谱（图10e）显示了Fe2?和Fe3?的典型双峰，这与磁铁矿（Fe?O?）的特征相符。这证明了PEG功能化的Fe?O?纳米粒子已成功整合到微球基质中，并保持了其晶体磁性核心。
Ni 2p光谱（图10f）显示了清晰的Ni2? 2p?/?和2p?/?双峰，以及更高结合能处的卫星峰。主要峰的位置和卫星特征的存在与八面体配位的Ni2?一致，排除了Ni3?或金属Ni的存在。这明确验证了通过NTA螯合作用将Ni2?离子有效地固定在了微球表面上。

商业微球的XPS光谱如图11所示。C、N、O、Fe和Ni的元素含量分别为59.51%、2.2%、36.66%、0.81%和0.82%。值得注意的是，Fe和Ni的含量显著低于自制微球。

图11. 商业微球的XPS光谱：(a) XPS调查扫描；(b) C1s光谱；(c) N1s光谱；(d) O1s光谱；(e) Fe2p光谱；(f) Ni2p光谱。
通过电感耦合等离子体光发射光谱法（ICP-OES）测定了微球中的总体Fe和Ni元素浓度，并在表1中进行了总结。平均体积Fe含量约为24.53%，而通过XPS测量的表面Fe含量仅为4.13%。这种显著差异表明，磁性Fe?O?成分主要嵌入在复合微球的内部，有助于保持结构完整性，同时最小化了表面暴露。相比之下，平均总Ni含量为6.47%，表面Ni含量为6.06%，表明表面富集程度较高。体积和表面Ni含量之间的紧密对应关系证明了Ni2?离子通过NTA螯合作用有效地固定在微球表面，主要位于NTA功能化的外层——这对于促进后续的生物结合和蛋白质结合过程非常理想。

公式用于计算镍负载量如下：
(4) Ni1 = ρm × Cx / Nni
Ni1: 镍负载量，以μmol/mL表示
Cx: 测量元素的最终浓度，以mg/kg表示
ρm: 微球的密度，以g/mL表示
NNi: 镍的分子量，为58.69 g/mol

表2显示，基于三次平行实验，商业微球中的平均Fe和Ni含量分别为约24.53%和1.47%。铁和镍的总量也低于自制微球。

表2. 商业微球的ICP-OES结果。
测试元素 测试溶液中的元素浓度c0 (mg/L) 稀释因子F 消化溶液中的原始元素浓度c1 (mg/L) 样品中的元素含量cx (mg/kg) 样品中的元素含量W (%)
Fe 46.30 10 46 3.02 24 1.16 0.06 24.12%
Fe 47.47 10 47 4.68 24 7.22 9.63 24.72%
Fe 47.53 10 47 5.25 24 7.39 24.75%
Ni 1.23 10 0 12 3.25 6 4.51 6.42%
Ni 1.26 10 0 12 5.61 6 5.42 3.09
Ni 1.24 10 0 12 3.88 6 4.51 9.28 6.45%

总之，这些结果证明了PAM-PEG@Fe?O?-PEG@NTA-Ni2?复合磁性微球的成功制备，这些微球具有完整的磁性核心和高密度的镍亲和位点。这种高镍负载特性表明，这些微球在生物亲和分离应用中具有很高的吸附能力和效率。根据公式2、3和4计算，镍负载量达到了50.17 μmol/mL，远高于国家标准的≥15 μmol/mL要求。

牛血红蛋白（BHb）表面大约含有24个组氨酸残基[35]，使其成为评估特定吸附的理想模型蛋白。相比之下，牛血清白蛋白（BSA）对制备的分离介质没有显著的特异性结合，因此被用作代表性污染蛋白[36]。
使用BCA试剂盒生成的BHb和BSA的标准校准曲线分别显示在图12a和b中。特定吸附实验的A562吸光度值总结在表3中。代入公式5得出的PAM-PEG@Fe3O4-PEG微球的特定吸附容量为50.6967 mg/mL，而市售磁性微球的特定吸附容量为44.9633 mg/mL。自制磁性微球的特定吸附容量高于市售磁性微球（增加了约13%），表明自制磁性微球在靶向能力上更为优越。

图12. 标准校准曲线：(a) 牛血红蛋白（BHb）；(b) 牛血清白蛋白（BSA）。
表3. 测试样本的特定吸附结果。
测试样本 BHb浓度 (mg/mL) A562吸光度
商业微球 0.65 11 0.3393 ± 0.0060
自制微球 0.47 9 10.27 16 ± 0.0055

表4列出了非特异性吸附测试的A562值。使用公式5计算得出自制微球的非特异性吸附容量为3.4225 mg/mL，明显低于市售产品的23.5200 mg/mL——减少了约86%。这种显著降低的非特异性结合突显了自制微球在复杂基质中的优越选择性。在His标记蛋白纯化过程中，它们有效减少了污染蛋白的共纯化，从而实现了更高纯度的目标蛋白分离，背景干扰减少。

诱导表达携带pET24a(+)-Protein A重组质粒的大肠杆菌菌株——该菌株在实验室中储存于-80°C——产生了分子量约为35 kDa的Protein A [37]。质粒图谱显示在图13a中。

图13. Protein A纯化：(a) pET24a(+)-Protein A重组质粒的限制图；(b1) 使用抗His抗体验证His标签的Western blot分析；(b2) 通过直接IgG结合测定验证Protein A的功能；(c1) 使用自制PAM-PEG@Fe?O?-PEG@NTA-Ni2?磁性微球的SDS-PAGE纯化效率分析；(c2) 在相同条件下的商业磁性珠子的对比纯化性能。
诱导后，细菌细胞经过超声处理和离心分离上清液和沉淀物部分，然后通过Western blot进行分析。如图13b1所示，用抗His一级抗体孵育后，上清液中有明显的条带，而沉淀物中没有。这表明上清液中的His标记目标蛋白完全可被抗His抗体识别。相比之下，沉淀物中没有信号表明His标签可能被埋藏或蛋白质采用了阻碍抗体结合的构象。图13b2中，直接用IgG孵育后，两个部分都出现了可检测的条带，证实重组Protein A具有功能性活性并能结合IgG，从而验证了其正确的折叠和生物活性。

对诱导培养的上清液进行了磁性亲和纯化，所得SDS-PAGE分析结果展示在图13c1和c2中。a面板展示了自制磁性微球的性能：用20 mM咪唑洗涤去除了杂质，且目标蛋白的损失最小；而在200–300 mM咪唑范围内有效洗脱。b面板显示了使用商业磁性珠子的结果。在20 mM咪唑洗涤过程中观察到目标蛋白的显著损失，表明Ni2?配体与His标签之间的相互作用较弱。此外，目标蛋白在较宽的咪唑浓度范围内（100–300 mM）被洗脱出来，并伴有大量污染蛋白的共洗脱。对比分析清楚地表明，自制磁性微球不仅在特定结合能力上与商业产品相当，而且在结合特异性上也超越了它们，使其成为高效和高纯度蛋白质分离的有希望的替代品。

在现有的工业微球制备方法中，膨胀种子聚合和膜乳化是成熟的技术。膨胀种子方法通过控制种子对单体的吸收来实现高度单分散的微球，特别适合制备几十到几百微米范围内的分离介质。然而，该方法程序繁琐，功能化容易影响尺寸均匀性，并且难以有效地原位封装磁性颗粒等组分。相反，膜乳化通过多孔膜挤出生成液滴，其通量远高于传统的微流体芯片，能够满足大规模生产需求。但由于膜本身的孔径分布限制，所得微球的变异系数（CV）通常为10%–15%，无法达到单分散。
为了解决微流体技术中长期存在的低通量和可扩展性挑战，本研究通过工程设计取得了技术突破。通过设计和制造一个28通道高纵横比（HAR）液滴生成芯片，我们通过多通道并行化策略显著提高了液滴生成的通量。同时，利用HAR通道对流体的强限制效应，实现了对液滴尺寸的精确控制（CV低至3.98%）。这些高度均匀的微球不仅保证了批次间的一致性，还有助于在色谱柱中形成均匀的流场，减少了通道效应。此外，聚丙烯酰胺基质使用了廉价且容易获得的原材料。结合微流体技术的低试剂消耗特性，这种介质在保持高性能的同时具有显著的成本优势，为其工业应用奠定了基础。
针对生物制药下游加工中的瓶颈问题——如重组蛋白的纯化效率低、介质的机械强度不足和严重的非特异性吸附——本研究提出了一种基于HAR多通道液滴微流控技术的磁性聚丙烯酰胺（PAM-PEG）微球制备策略。通过系统的材料合成、表面功能化和性能评估，我们成功制备了具有高容量和高选择性的磁性亲和分离介质PAM-PEG@Fe?O?-PEG@NTA-Ni2?。它能够高效捕获来自复杂生物样品的His标记蛋白。

在实际的生物分离应用中，这项研究的核心价值在于提供了一种高效的解决方案，以替代传统的重力或泵驱动的色谱柱。与传统的软凝胶基质（例如琼脂糖）相比，制备的PAM-PEG微球具有更好的机械强度和化学稳定性。
在分离性能方面，本研究通过精细的表面工程策略实现了对表面配体密度的精确控制，在吸附能力和特异性之间取得了优异的平衡。通过优化碱性水解、EDC/NHS激活和NTA接枝过程，自制微球的Ni2?螯合能力达到了50.17 μmol/mL，远高于当前的国家标准（≥15 μmol/mL）。这种高配体密度直接转化为更高的蛋白结合能力，牛血红蛋白的特异性吸附比商业微球提高了约13%。更重要的是，PEG的引入和表面修饰策略显著降低了非特异性吸附，降低了约86%。在实际的原核表达系统中进行蛋白质A纯化实验时，自制备的微球在洗涤阶段表现出极低的残留杂质蛋白水平，其洗脱液的纯度明显优于商业对照品。这种高容量、低背景的特性对于直接从复杂的细胞裂解物中捕获低丰度的目标蛋白具有极大的应用价值，显著简化了纯化工作流程，并减轻了后续精处理步骤的负担。总之，本研究不仅开发了一种高性能的磁性亲和分离介质，还通过微流控技术与材料科学的交叉整合，探索了一条从实验室合成到规模化制备的可行路径。凭借其优异的机械稳定性、极高的蛋白质吸附能力和极低的非特异性吸附效果，该介质在重组蛋白药物、酶制剂和诊断抗体的快速制备与纯化方面展现了广泛的应用前景[[38], [39]]。

**资助来源**
本研究得到了河南省高层次人才国际培养项目、河南省科学技术计划（252102311195）以及河南省医药科学院基础研究基金项目（2025BP0104, 2025BP0104-2）的支持。

**作者贡献声明**
李文尧：撰写-原始草稿、数据可视化、结果验证。
王新玲：撰写-审稿与编辑、实验监督。
徐娜：撰写-审稿与编辑、实验监督。
杨文洁：撰写-审稿与编辑、实验监督。
陈玉实：撰写-审稿与编辑、实验监督。
罗胜楠：撰写-审稿与编辑、实验监督。
马芳：撰写-审稿与编辑、实验监督。
陈惠萍：撰写-审稿与编辑、实验监督。
张子森：资金筹集、数据分析、数据管理、概念设计。
张立国：资金筹集、数据分析、概念设计。