通过凝固剂浸渍和湿法烧结技术提高细菌存活能力的生物涂层

《ACS Applied Materials & Interfaces》：Biocoatings with Enhanced Bacterial Viability via Coagulant Dipping and Wet Sintering by Immersion

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生物涂层通常是胶体聚合物薄膜，用于包裹代谢活跃但不会生长的细菌。根据所包裹细菌的种类，生物涂层可以在废水处理、生物燃料生产、碳固定、环境修复、生物传感等领域得到应用。然而，生物涂层的成功使用面临着许多挑战，包括对反应物和代谢产物的渗透性低、涂层干燥过程中对细菌的渗透压应力以及细胞脱水导致的细菌死亡。在这里，我们通过两种相互关联的处理方法来解决这些问题。（1）胶体聚合物分散液的凝固形成具有高渗透性的多孔微结构。（2）通过在液体介质中浸没进行湿烧结可以减少渗透压应力并避免细菌脱水。在一个以丙烯酸共聚物乳胶为基质的 Escherichia coli 模型系统中，这两种方法使细胞存活率比在高温空气中进行干烧结的传统生物涂层方法高出约 500 倍。我们发现，当使用溶原质肉汤作为湿烧结的介质时，细胞存活率显著更高。增加用于凝固的盐浓度会导致涂层更厚（从而每单位面积的细菌数量更多），但细胞存活率也会随之下降，因此需要找到一个平衡点。通过生产乙醇这一生物燃料，证明了湿烧结生物涂层中 Escherichia coli 的代谢活性。这些结果为未来利用广泛耐干燥性的细菌种类开发生物涂层带来了希望。

引言
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天然生物膜是由活细菌组成的群落，它们嵌入自生产的聚合物基质中，并附着在表面或彼此之间。(1,2) 合成生物膜（称为生物涂层）通常是通过将活细菌与水中的稳定胶体聚合物分散液混合(3)，然后干燥制成固体涂层。(4) 细菌细胞被包裹在涂层内，保持存活状态但不再生长。生物涂层中的代谢活跃细菌已在废水处理、(5,6) 碳捕获、(7,8) 室内空气净化、(9) 生物燃料合成、(10,11) 生物催化、(12) 以及环境修复等方面找到应用。(13) 去年，《自然》杂志发表了一篇“行动号召”，呼吁“立即采取切实可行的措施来利用微生物学的力量”。(14) 该论文强调了基于微生物的技术在应对日益严重的气候变化问题上的巨大潜力。生物涂层为包含、保护以及运输细菌提供了极好的手段。

Escherichia coli (E. coli) 的基因组在近三十年前已被完全测序，E. coli 一直是合成生物学研究的常见对象，这使其在抗生素生产、(15) 生物燃料(16?21) 和芳香族化合物(22,23) 及生物传感器(24) 的制备中得到应用。实验室改良的 E. coli 是理想的模式生物，因此被用于这项研究。

传统上，生物涂层的形成是通过将细菌的水悬浮液与水中的聚合物胶体（称为乳胶分散液）混合实现的。在成膜后，水分蒸发会提高胶体的浓度，导致颗粒聚集。颗粒在烧结过程中发生变形以减少界面能，从而消除它们之间的空隙。最终，聚合物分子在颗粒间的相互扩散（凝聚）形成了致密且机械强度高的涂层。尽管生物涂层具有多种功能和用途，但仍有许多挑战阻碍了其更广泛的应用。生物涂层的聚合物粘合剂必须在成膜过程中确保细菌的存活，并在物理上限制细菌的活动，同时允许其与周围环境进行化学交换。目前，生物涂层面临的最紧迫的材料相关问题包括：(1) 低孔隙率和渗透性,(25) (2) 成膜过程中对细菌的高渗透压应力,(26) 以及(3) 细胞脱水导致的存活率降低。(27)

生物涂层必须具有足够的渗透性，以便让营养物质和反应物进入细胞使其发挥作用，并让反应产物和代谢物从涂层中排出。(26) Flickinger 等人发现稳定的膜孔隙率对于优化涂层中细菌的活性是必要的。(26) 一种常见的保持涂层空隙的方法是添加硬质填充剂，如玻璃态聚合物颗粒(28) 或海洛石粘土(4)，以阻止颗粒凝聚并在涂层中引入纳米级间隙。另一种方法是使用不挥发的可溶于水的分子（如甘油、(29) 蔗糖(25) 和碳水化合物(30) 作为孔隙形成剂来填充颗粒间的空隙。这些物质会在成膜后被冲洗掉，留下空气孔隙。例如，向乳胶配方中添加蔗糖可使硝酸盐的扩散速度提高 35 倍。(28) 然而，当涂层储存在聚合物粘合剂的玻璃化转变温度 Tg 以上时，这些空隙并不持久。实验表明，随着时间的推移，颗粒仍会逐渐变形和凝聚，从而使空隙网络（以及渗透性）减小。(25,31)

Flickinger 等人指出，最小化渗透压应力对于保持细菌存活至关重要。(26) 当细菌周围水溶液中的物质浓度与细胞内部浓度差异较大时，就会产生渗透压应力。(32) 当细菌处于高浓度盐溶液中时，水会从细胞中扩散出去，导致细胞脱水；相反，当细胞置于去离子水中时，水分会进入细胞，导致细胞膜破裂。

近年来，已经开发出了一些方法来减少成膜过程中的渗透压应力。例如，Gosse 等人开发了一种方法，将胶体分散液吸收到色谱纸上并保持其水分。(33) 完全避免了干燥步骤，但细胞仍然附着在基底上。Gosse 等人发现，他们的涂层保持了细菌的反应性，这通过氧气释放量的测量得到验证。

当含有细菌细胞的生物涂层暴露在空气中时，细胞中的水分去除会导致结构、生理和生化上的应力。(27) 在干燥的涂层中，剩余的水分往往不足以维持细胞外大分子周围的单层水膜。需要水的代谢酶催化的反应在这种环境下无法进行，因此干燥的细菌细胞无法存活。只有一部分细菌具有耐脱水能力，能够在空气干燥的情况下承受水分的去除。(27) 传统生物涂层的制备过程包含干燥步骤。为了保持这些方法形成的涂层中细菌的存活率，必须具备耐脱水性。需要注意的是，细菌的干燥应力是一个广义术语，既包括渗透压应力也包括细胞脱水，这两种情况都会发生在细菌暴露在空气中且水分被去除时。

以往关于增强细菌耐脱水性的研究探讨了耐脱水细菌利用的机制。例如，Billi 等人使用蔗糖-6-磷酸合成酶来提高 E. coli 在空气干燥、干燥和冷冻干燥条件下的存活率。(34) 蔗糖和海藻糖是非还原性二糖，能够在干燥过程中保护细菌的膜和蛋白质。通过在整个干燥过程中持续提供海藻糖或蔗糖，细菌的存活率更高。(35) 为了维持这种供应，可以在细胞外添加海藻糖或蔗糖(35,36)，或者内部合成它们。(34) 然而，Chen 等人发现，向生物涂层中添加海藻糖或其他碳水化合物并未显著提高被包裹的 E. coli 的存活率。(4) Swope 和 Flickinger 发现细胞干燥程度与存活率下降有关。(29) 干燥 1 小时的生物涂层中仍有 70–80% 的细胞存活，而经过重新水合步骤后存活率可达到 95%。他们认为，固定化细胞的细胞膜在干燥过程中会变弱。

在同一年进行的另一项研究中，Swope 和 Flickinger 调查了生物涂层中 E. coli 细胞在饥饿状态后的再生情况，发现固定化细胞在初次诱导后最多 17 天内仍可恢复活性，存活率仍大于 90%。(37) 他们证明了定期诱导是一种延长生物涂层寿命的有效方法。

最近，Chen 等人(6) 报告了一种成膜工艺，在该工艺中通过在胶体颗粒沉积成层后抑制蒸发来保持细胞的水分。Chen 等人(6)通过将分散液涂在涂有盐的基底上来促进带电稳定的胶体凝聚，这一方法受到了乳胶手套制作工艺的启发。(38) 胶体颗粒在未量化数量的水溶液存在下发生凝聚。我们将这种机制称为“湿烧结”，以表明该过程中同时存在液态水和空气。(39) 他们研究的湿烧结生物涂层中硝化细菌的活性更高，产生的亚硝酸盐和硝酸盐含量是传统干燥生物涂层的五倍。

Gosse 等人(33) 和 Chen 等人(6) 都发现，在高相对湿度条件下成膜有利于封装细菌的存活率。这种“湿烧结”技术是一种有效的避免脱水从而提高存活率的方法。

为了解决生物涂层面临的问题，我们借鉴了胶体科学的两个关键概念：凝固和湿烧结。凝固技术常用于乳胶手套和气球的制造。先将适当的模具（如 Ca(NO3)2）涂覆在模具上，然后将其浸入带电稳定的乳胶分散液中。在靠近模具界面的地方，当局部离子浓度超过临界凝固浓度 (C*) 时，会形成凝胶。Groves 和 Routh 提出一个模型来描述凝胶层的生长过程，该模型考虑了盐的扩散距离，以确定浸入乳胶时超过 C* 的距离范围。(38) Williams 等人(40) 对该扩散模型提供了解析解，并推导出凝胶涂层厚度的方程式，该方程式考虑了基底上的盐含量、盐在水中的扩散系数以及盐的临界凝固浓度 (C*)。他们的模型预测，在较长的浸渍时间内，凝胶涂层的厚度与基底上的盐含量成正比。实验数据验证了这一模型。(40)

在湿烧结过程中，密集排列的胶体会发生变形以填充空隙，从而减少与水的界面面积，从而降低自由能。这一机制最初由 Vanderhoff 提出。(41) Sheetz 在透析袋中浓缩聚合物胶体，使其在水中形成聚集体。(42) 在基底上沉积膜后，通过抑制颗粒间的水分蒸发可以实现湿烧结。此时，颗粒在水中变形的时间短于 Routh 和 Russell 的变形模型所要求的水分流失时间。(43) Dobler 等人(44) 的实验发现，颗粒在水中的凝聚速率与水分含量呈一级动力学关系，且在较高水温下聚合物粘度较低时凝聚速率更快。

通过水分蒸发、透析或凝聚作用可以局部浓缩胶体颗粒，从而实现物理接触点，使湿烧结成为可能。在这项研究中，我们通过将细菌悬浮液浸入乳胶中，利用凝聚剂凝胶化过程制备了生物涂层。然后，这些凝胶涂层通过浸入液体介质中进行湿法烧结。我们提出的主要工艺步骤如图1所示。我们的技术基于乳胶手套制造行业中使用的凝聚剂浸渍工艺，但关键区别在于我们在浸渍温度下使用的是处于玻璃态的胶体，而不是用于弹性产品的橡胶颗粒。图S1（支持信息）展示了实验装置的照片。

图1. 凝聚剂凝胶化和湿法烧结的步骤。(a) 涂有凝聚盐的基底与初始乳胶分散液接触。(b) 盐分扩散到水相中，乳胶在浓度超过C*的地方发生凝胶化。(c) 随着时间的推移，凝胶层的厚度增加。(d) 将凝胶涂层浸入高于聚合物玻璃化转变温度（Tg）的水中。(e) 颗粒通过湿法烧结形成机械强度高的结构。

我们工艺的创新之处在于，在凝胶化后通过浸入温水进行湿法烧结。当凝聚剂涂层的基底浸入乳胶分散液并取出后，立即将其浸入高于聚合物Tg的液体中，进行一定时间的烧结。薄膜形成完成后，涂层可以储存在低于聚合物Tg的介质中，从而保持机械稳定性。

这种加工策略有许多优点。首先，它允许使用Tg较高的乳胶（高于室温），同时完全避免了干燥步骤。因此，当涂层在烤箱中干燥时出现的毛细应力和开裂问题得以解决。更重要的是，由于完全避免了干燥过程，渗透应力和脱水应力的负面影响也被最小化了，并且可以选择适合细菌的烧结液体。因此，这种方法有望提高细菌的存活率和寿命。

我们使用了一种电荷稳定的丙烯酸共聚物乳胶（Tg为28°C），并添加了低浓度的表面活性剂以降低对细菌的毒性。该乳胶具有负Zeta电位和大约0.07 M的临界凝聚浓度，非常适合用于凝聚剂浸渍。选择硝酸钙四水合物作为凝聚盐，因为它有时存在于生长介质中，并且细菌能够很好地耐受。这种凝聚剂以0.055 mol/m2的面积密度沉积在纸上。当含盐基底浸入固体含量较低（14 wt%）的乳胶中时，会形成厚度超过200 μm的凝胶涂层。随着基底上盐浓度的增加，凝胶层的厚度也随之增大（见图2a）。这种相关性与之前关于凝聚剂浸渍的模型一致。

图2. (a) 凝胶涂层厚度与用于凝聚剂浸渍的基底上(Ca(NO3)2的面积密度之间的关系。误差条表示测量的不确定性。(b) 在35°C的高温下，通过（左侧）对流烤箱干法烧结和（右侧）在水中湿法烧结两种方法比较凝胶涂层的结果。上面一行的图像是涂层的照片；下面一行是通过光学显微镜获得的图像。在这两张图像中，涂层覆盖了基底的下半部分；上半部分是裸露的纸张。

我们发现，凝聚步骤对于通过浸入水中进行湿法烧结以获得足够厚的涂层是必要的。如果基底上没有凝聚盐，则无法形成致密的涂层。当干燥的非凝胶化胶体层浸入水中时，胶体颗粒会迅速重新分散。非常少的胶体颗粒附着在纸基底上（见支持信息中的SEM图像S2）。

当胶体在无凝聚剂的情况下干燥时，虽然有吸引性的范德华力作用，但负电荷之间的斥力仍然存在。然而，当胶体发生凝聚时，二价Ca2+离子可以桥接紧密接触的负电荷胶体，从而在凝胶结构中建立内聚力。

图2b展示了一个通过凝聚剂浸渍后接着在水中湿法烧结形成的涂层示例。作为对比，还展示了一个在暖烤箱（35°C）中通过“干法烧结”形成的凝胶层。这一对比突显了在薄膜形成过程中避免干燥步骤的好处。干法烧结的涂层出现了严重的裂纹，这归因于胶体颗粒处于密集堆积状态时的毛细应力效应。由于烤箱中的热传递效率较低，颗粒在水分蒸发初期可能仍处于玻璃态。相比之下，湿法烧结的涂层是连续且无瑕疵的。直到颗粒在温水中聚合并且聚合物之间的相互扩散增强了胶体网络后，水分才被去除。因此，湿法烧结对薄膜质量有明显的好处。

成功形成薄膜后，涂层在室温下呈坚硬的玻璃态，这一点通过摆锤硬度测试得到了证实（见支持信息中的表S1）。

此外，我们发现湿法烧结过程需要在温度高于丙烯酸共聚物Tg（28°C）的液体中进行。当凝聚剂凝胶化的涂层在23°C的水中浸渍时，形成的涂层变脆且出现严重裂纹（见图S3）。这一结果表明，只有当温度高于聚合物的Tg时，颗粒才能在薄膜形成过程中流动，从而实现团聚。

扫描电子显微镜观察结果显示，涂层具有由松散排列的胶体颗粒构成的多孔结构，这些颗粒在接触点处融合（见图3a）。当涂层储存在低于聚合物Tg的温度下一周后，这种微观结构仍然稳定（见图3b）。较软涂层常存在的问题是缺乏微观结构稳定性，但我们的方法克服了这一问题。图3c和d显示了厚度为30 μm的涂层横截面中的多孔微观结构。当涂层从纸基底上剥离时，观察到它与粗糙的纤维表面紧密贴合（见图S4）。剥离过程中，一些纤维被涂层带走，表明了其强附着力，这对于生物涂层的应用是必需的。此外，我们发现改变基底类型对最终的微观结构没有明显影响（见支持信息中的图S5）。

图3. SEM图像显示了涂层的微观结构。(a) 在35°C温度下水中湿法烧结3小时后形成的涂层顶表面。(b) 该涂层在相对湿度约为40%和21°C的温度下储存7天后的样子。(c) 在34°C水中湿法烧结30分钟后形成的涂层横截面。底部是纸基底，薄膜表面位于图像的顶部。(d) (c) 的更高放大倍数图像，显示涂层内部有孔隙（表现为黑色斑点）。

多孔微观结构使得涂层具有较高的水渗透性。我们通过重量法研究了微观结构对水渗透性的影响（见图S6）。在32°C的水中湿法烧结30分钟后的凝聚剂涂层的水渗透率为7.2 ± 2.3 μmol/m/s，而干法烧结的丙烯酸涂层的渗透率低一个数量级，仅为0.55 ± 0.09 μmol/m/s。这种较高的渗透性与电子显微镜观察到的多孔结构相吻合。

我们探讨了可以调整湿法烧结涂层微观结构的参数，以使其适用于生物涂层应用。首先，我们介绍了浸渍用水的温度对涂层的影响。图4展示了在不同水温下获得的电子显微镜图像。这些图像是在30分钟的浸渍时间内拍摄的。在最低水温（29°C）下，可以观察到单独的胶体颗粒及其接触点处的细颈结构。在35°C的湿法烧结温度下，颗粒发生变形，不再可区分，形成链状结构。在49°C和59°C的较高温度下，微观结构发生了明显变化。在最高温度下，颗粒簇之间出现了较大的孔隙（大约2 μm）。随着烧结温度的升高，胶体凝胶的结构更加疏松（见图4c和d）。然而，两种最高温度下烧结的涂层厚度相同，这表明孔隙是通过较小孔隙的融合而增长的，而不是整体结构同时塌陷。

接下来，我们研究了胶体涂层微观结构随时间的变化情况。通常，颗粒在密集堆积层中的烧结会导致孔隙尺寸逐渐减小和密度增加。然而，在我们的胶体凝胶结构中，由于颗粒最初并未紧密堆积，反而观察到了孔隙的粗化。图6中的SEM图像显示，浸入去离子水中的时间对涂层的微观结构有显著影响。在最短的2分钟浸渍时间内，球形颗粒与其最近邻颗粒形成颈区域，形成短链。随着浸渍时间的延长，颈区域进一步扩大，颗粒失去原有形态。在最长的浸渍时间内，颗粒簇之间的孔隙减少，而是在烧结颗粒网络中形成了新的孔隙（见图6）。

通过对大量实验的SEM图像进行分析，发现典型的孔隙尺寸随着湿法烧结时间的延长而增大。图像分析是在图4和图6中的显微照片上进行的（还包括这里未显示的13个其他样本），以提取涂层表面可见的孔隙的平均直径（有关图像分析的详细信息，请参见支持信息中的图S7）。烧结的驱动力是通过减少颗粒与周围介质（空气或液体）之间的界面面积来降低表面自由能。自由能由面积与界面能γ的乘积得出。对于粘性颗粒，减少面积的流动受到粘度η的阻碍。在烧结模型（43,53）中考虑这些参数，对于半径为a的颗粒，无量纲烧结时间τ表示为γt/ηa。对于聚合物，粘度取决于温度Tg以上的情况。我们使用著名的WLF方程（54）来估计每个烧结温度下的聚合物粘度。然后，我们利用该粘度来计算无量纲烧结时间，以研究温度对孔隙生长的影响。图7展示了在改变湿烧结时间或烧结温度的实验中，孔隙半径与τ之间的关系。无量纲平均孔隙半径r*是通过将孔隙半径r除以平均颗粒半径a得到的。在计算τ时忽略了γ的温度依赖性，并始终使用10 mJ m–2的恒定值。数据展示在图7中。

图7. 乳胶凝胶涂层微观结构中无量纲孔隙半径r*与无量纲时间τ的依赖关系。数据点显示了每个样本中四个最大孔隙的平均半径，使用了两张图像。

我们提出孔隙是通过单个颗粒之间较小孔隙的融合随时间增长的。较大的孔隙具有较大的表面积，但由于大量较小的孔隙在融合成一个较大孔隙时消失，因此微观结构的整体表面积会减小。我们将其类比为粘性流体的spinodal相分离过程中的粗化现象。（55?57）在图7中，改变浸渍时间或温度均显示出与孔隙大小相似的正相关关系。这些数据显示孔隙半径大约按τ0.3的比例变化。（最佳拟合线的斜率为0.33 ± 0.16，而在改变温度时为0.27 ± 0.09。）我们得出结论，通过湿烧结过程中的浸渍条件可以精确地调整涂层的微观结构。

Nawaz和Rharbi（48）使用小角中子散射（SANS）研究了乳胶薄膜的烧结情况，并同样发现了粗化的证据。对于直径小于60纳米的颗粒，由于没有密排结构，他们观察到了孔隙的增长。他们在SANS中测得的峰值波矢提供了孔隙尺寸的估计值。提取Nawaz和Rharbi提供的不同薄膜形成时间范围内的数值后，我们研究了粗化的时间依赖性。具体来说，从他们的数据分析中，我们发现30纳米颗粒的孔隙大小随时间增长约t0.4，而42纳米颗粒的孔隙大小随时间增长约t0.2。我们的τ0.3比例处于这两种关系之间。考虑到实验的不确定性，这里可能起作用的是相同的机制。

我们提出，在凝胶涂层中观察到的孔隙增长是由于颗粒通过凝胶作用最初形成了一种松散、随机的排列，而不是六角形密排结构。实际上，Nawaz和Rharbi指出，表现出粗化的颗粒由于尺寸分散而呈随机排列。

为了进一步了解凝胶浸泡涂层的薄膜形成过程，我们估算了它们的相对密度随时间的变化。涂层的密度是根据测量得到的涂层质量、面积以及从横截面照片中获得的厚度来估计的。相对密度定义为估计的涂层密度除以共聚物的密度（假设为1130 kg/m3）（有关方法的描述，请参见支持信息中的文本和图S8和S9）。

当凝胶浸泡涂层置于室温下的水中时，凝胶结构不会塌陷。相反，初始的相对密度0.1保持相对恒定，如图8中的蓝线所示。这个结果表明，无法进行湿烧结的硬颗粒不会通过破坏凝胶结构来置换周围的水，而是保持了低密度的颗粒堆积。当水的温度升高到32°C（高于聚合物的Tg）时，观察到更多的致密化现象。首先是快速的致密化，随后致密化速率趋于平稳。

使用扫描电子显微镜（SEM）观察到的微观结构提供了对致密化数据解释的洞察。在短时间内（最多15分钟），观察到了颗粒变形和颈部生长。根据已建立的烧结模型（43,51,53），这种烧结作用减少了涂层的厚度，从而增加了密度。在此期间，相对密度从大约0.12增加到0.18。超过15分钟的浸渍后，密度仅逐渐增加（45分钟内增加了约0.02），SEM分析显示了孔隙的生长。如果小孔隙在堆积的颗粒之间或颗粒串之间发生融合，结构的密度预计不会变化。观察到的缓慢致密化速率可以用单个孔隙体积的增加以及由于融合导致孔隙数量减少来解释。（相比之下，我们发现如果凝胶涂层在室温下的空气中储存，硬颗粒在干燥过程中会逐渐塌陷成密集的堆积。见图S10。）

我们得出结论，在水中的薄膜形成早期阶段主要由相邻颗粒的湿烧结主导。后期阶段主要由孔隙的粗化主导。图7主要展示了这一过程的粗化区域。

通过凝胶凝胶化和需氧条件下的成膜作用，成功地将非致病性的实验室灭活的大肠杆菌细胞限制在生物涂层内。图9显示了乳胶涂层中细菌细胞的SEM图像。这里比较了两种烧结方法：干烧结和湿浸法烧结。为了实现干烧结，将凝胶浸泡的凝胶涂层置于35°C的对流烤箱中。当水分蒸发时，聚合物/空气界面的界面能成为烧结的驱动力。在干烧结的生物涂层中，乳胶颗粒以紧密堆积的方式包围着细菌细胞（图9a）。最大的开放空间来自材料的微裂纹。裂缝可以作为从图像顶部到底部的断裂线观察到的。在没有裂缝的区域，平均孔隙大小约为乳胶颗粒投影面积的三分之一。小孔隙网络提供了一定的孔隙率。图9b提供了一个干烧结涂层中单个细菌的高倍率显微照片。乳胶颗粒沿着细胞周边紧密排列，周围有一些有序排列的颗粒区域。

在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中进行湿浸法烧结的生物涂层（图9c）表面观察到的孔隙率比干烧结的情况更高。孔隙大小不一——大于乳胶颗粒的大小，也小于细菌细胞的大小。使用图7中的关系式并参考30分钟的烧结时间，预测平均孔隙大小约为乳胶颗粒半径的4倍。图像分析显示平均孔隙大小为颗粒半径的4.8 ± 0.7倍。图9d展示了一个在湿烧结涂层中的单个细菌的例子。细菌被四周的随机堆积的乳胶颗粒所包围。与干烧结的微观结构相比，这里的秩序性较低。

在确定通过湿浸法烧结形成的生物涂层具有高孔隙率之后，接下来我们研究了这些方法和微观结构如何影响细菌的存活率。具体来说，我们考虑了烧结类型、湿烧结时所选液体的类型以及凝胶盐的浓度的影响。我们认为，由于涂层渗透性的差异以及施加在细菌上的渗透压和脱水应力，成膜方法会对细菌的存活率产生明显影响。假设干烧结方法通过去除涂层中的水分引入的脱水应力会降低细菌细胞的存活率，而湿浸法烧结则在整个成膜过程中使细胞保持在液体中。此外，为了进行比较，我们还引入了“湿法烧结”方法，即在高湿度下，胶体颗粒在凝结水产生的毛细压作用下发生变形。

在严格的湿法烧结研究中，Lin和Meier（39）使用Kelvin–Laplace方程将水的相对湿度与颗粒间水弯月的半径联系起来。他们发现，在水饱和气氛中，一层堆积的胶体颗粒中的平衡凝结水含量为5体积%。实验表明，这种凝结水产生的毛细压力足以使乳胶颗粒变形。在我们的实验中，凝胶浸泡后，涂层在85%的高相对湿度（RH）下在密封容器中放置2小时，容器置于34°C的烤箱中。然后在室温（21°C）和40% RH的湿度箱中储存涂层，之后进行分析。我们的动态蒸汽吸附重量分析发现，在85% RH下，胶体层含有超过1 wt%的平衡水分（见支持信息中的图S11和表S2）。

所有三种成膜方法（干烧结、湿法和湿浸法烧结）都从相同的实验步骤开始。每种方法都使用了涂有Ca(NO3)2·4(H2O)的纸基底，其面积密度为0.011 mol/m2。因此，每个样品最初包含的细菌细胞数量大致相同。薄膜形成方法的不同在于凝胶涂层阶段之后。我们假设，减少渗透压和干燥应力以及提高湿烧结的渗透性将导致被限制在涂层内的细胞的存活率更高。 adenosine triphosphate (ATP) 测定法被用作一种快速且敏感的技术，用于确定生物涂层内细菌细胞的存活率。(8) ATP 是一种有机核苷三磷酸，存在于植物和动物体内的活细胞中。(58) 当细胞受损或死亡时，ATP 浓度会迅速下降，因此 ATP 浓度可以很好地反映活细胞的数量。ATP 浓度与活细胞数量呈正相关（参见支持信息中的悬浮液数据）。由于生物涂层中的孔径与光的波长相当（甚至更大），材料会产生显著的光散射。因此，使用细胞染色检测或荧光蛋白表达来定量评估存活率的光学显微镜技术无法可靠应用。

图 10 比较了使用三种不同方法形成的涂层膜中细菌细胞的存活率（以 ATP 浓度表示）。在这个实验中，使用 PBS 溶液作为湿烧结的液体。正如假设的那样，湿烧结后的 ATP 浓度比其他方法高出了两倍以上。三种方法之间的总体 p 值为 0.037，证实了涂层形成方式对细胞存活率的统计显著性。

图 10. 涂层膜形成方法（湿润烧结、干燥烧结或湿烧结）对生物涂层中大肠杆菌细胞存活率的影响。湿烧结使用了 PBS；之后没有对生物涂层进行干燥处理。每个条形代表至少三次生物重复实验的平均值，每次实验包含三个技术重复。误差条来源于生物重复实验平均值的标准误差。这三种方法均包括了高于聚合物玻璃化转变温度 (Tg) 的 30°C 的烧结过程。湿烧结后细菌的存活率显著高于湿润烧结 (p = 0.0005) 和干燥烧结 (p = 0.0008)。（N = 3；* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001；**** p < 0.0001）。使用了 Kruskal Wallis 检验和 Dunn 的多重比较方法。

在干燥烧结过程中，细菌细胞暴露在无残留水分的空气中，导致脱水并伴随存活率下降。与浸泡在 PBS 中相比，干燥烧结的存活率更低 (p = 0.0008)。我们得出结论，高离子浓度环境（如湿润烧结过程中）对细胞存活率的破坏性更大，因为这使得凝固盐在干燥过程中有机会在涂层中干燥。

无论是湿润烧结还是干燥烧结，都导致细胞存活率显著降低。水分蒸发会增加生物涂层中残留凝固盐的浓度。根据 Routh 分析模型中的典型实验参数(47)，当胶体颗粒的体积分数达到 0.6（随机堆积）时，离子浓度预计会增加一个数量级。Ca(NO3)2 溶液中的浓度会继续增加，直到其饱和点 5.5 M(40)。高浓度的盐溶液可能对细菌细胞有毒(59)。在涂层形成过程中盐浓度的增加可能导致细胞膜、蛋白质和 DNA 的致命损伤(60)。根据我们的重量分析，在 85% 相对湿度下的湿润烧结过程中，胶体膜中大约保留了 1 wt% 的平衡冷凝水。高离子浓度的水环境会在湿润烧结过程中产生渗透压应力，这解释了存活率的降低。在干燥烧结过程中，细菌细胞暴露在无残留水分的空气中，导致脱水，从而与 PBS 中的湿润烧结相比存活率下降 (p = 0.0008)。

我们得出结论，通过浸泡在 PBS 中进行湿烧结（涂层从未干燥）是获得生物涂层最高存活率的首选方法。在这种方法中，细菌细胞既不会脱水也不会受到显著的渗透压应力。实验表明，浸泡湿烧结对细菌存活有显著促进作用。在后续实验中，我们比较了四种不同的液体：去离子水、PBS、M9 生长培养基和溶原体肉汤 (LB)。当生物涂层在湿烧结后储存在液体中时，发现浸泡在 LB 中的存活率最高，ATP 浓度大约比浸泡在水中高两个数量级，见图 11 (p = 0.0003)。

图 11. 浸泡液对生物涂层中大肠杆菌细胞存活率的影响。比较了两种不同的湿烧结方法：(a) 湿烧结后将生物涂层储存在液体中；(b) 湿烧结后在空气中干燥生物涂层。每个条形代表至少三次生物重复实验的平均值，每次实验包含三个技术重复。误差条代表三次生物重复实验平均值的标准误差。使用了带有 Welch 校正的 ANOVA 和事后 T 检验（以及用于 (a) 的 Welch 校正和 Mann Whitney 检验）。(N = 3；** p < 0.01；*** p < 0.001；**** p < 0.0001)。

我们推测，在水中进行湿烧结导致细菌存活率最低，因为渗透压会导致细胞破裂。浸泡在 PBS 和 M9 培养基中得到的存活率相似，两者之间没有显著差异。这两种浸泡介质的存活率显著高于水 (PBS: p = 0.0012, M9 培养基: p = 0.0008)，但低于使用 LB 作为烧结介质时的存活率。这是因为 LB 含有酵母提取物，可以促进细菌生长，而 PBS 仅由维持细胞存活但不促进生长的盐组成。M9 培养基不是富集的（与 LB 不同），其结果与 PBS 相似。我们还研究了湿烧结后在空气中干燥样品的影响。总体而言，干燥（随后重新水化进行 ATP 测定）使细菌细胞的存活率降低了不到一个数量级。我们推断干燥对细菌存活率的负面影响是由于渗透压和脱水过程共同作用的结果。PBS 在湿烧结中使用的原始浓度是等渗的。然而，当水分通过蒸发流失时，离子浓度会增加。

当从去离子水中取出的生物涂层从液体中取出时，周围水分的蒸发会对细胞造成额外的压力，导致存活率非常低，表明大多数细菌已经死亡。在这种情况下，细胞更可能因湿烧结过程中的渗透压而脱水。结果显示了渗透压和脱水的严重联合效应。烧结后干燥对存活率的影响不如浸泡液的选择显著。然而，为了实现最佳存活率，应同时考虑这两个参数。当生物涂层在 LB 中湿烧结后继续浸泡在液体中时，其 ATP 浓度大约是干燥并重新水化后的六倍 (p < 0.0001)。我们得出结论，将样品浸泡在富集介质中是更好的技术，因为它消除了干燥应力，并为被限制在涂层内的细菌提供了持续的化学底物供应。

为了将我们的结果放在适当的背景下，将 LB 中湿烧结并保持浸泡状态的涂层的 ATP 测定结果与干燥烧结涂层的 ATP 测定结果进行比较是有用的。假设生物涂层和细胞悬浮液的发光效果相当，可以将 ATP 浓度转换为每毫升可形成菌落的细胞数 (CFU)（见支持信息中的图 S12 和 S13）。这种计算允许比较生物涂层中的活细胞密度。在 LB 中湿烧结形成的涂层膜的 CFU/mL 值大约是干燥烧结形成的涂层的 500 倍。这种存活率的显著提高将推动生物涂层在需要更高产量的应用中的更广泛应用。

为了使生物涂层具有高反应速率，需要高细胞密度（单位面积上的细胞数量）。一个显而易见的方法是制作更厚的涂层。因此，在一些实验中增加了凝固盐的浓度。在所有实验中，将 20 μL 的 Ca(NO3)2·4(H2O) 水溶液沉积在 0.5 cm × 3.5 cm 的纸基底上。比较了两种不同浓度的 Ca(NO3)2·4(H2O) 作为凝固盐：0.2 M（盐的面积密度为 0.011 mol/m2）和 1 M（面积密度为 0.055 mol/m2）。当凝固盐的覆盖率增加时，形成的生物涂层的厚度增加了三倍以上。根据已知的细菌和聚合物胶体悬浮液浓度，并假设两种组分在涂层中的比例保持不变，我们估算了总细胞负载量（包括非活细胞）。见表 1。提高凝固盐浓度使细胞负载量达到 3 ± 1 × 1011 CFU/m2。

表 1. 两种不同 Ca(NO3)2 凝固盐浓度下的涂层厚度和 CFU/面积估计值
| Ca(NO3)2 浓度 (M) | 盐的面积密度 (mol/m2) | 估计的干燥涂层厚度 (μm) | 估计的细胞密度 (1011 CFU/m2) |
|------------|----------------|-----------------|-----------------|
| 0.2 | 0.011 | 30 | ± 100 | ± 0.2 |
| 1 | 0.055 | 100 | ± 103 |

图 12 显示，较低的凝固盐浓度 (0.2 M) 在湿烧结 (p = 0.0002) 和湿润烧结 (p = 0.0486) 方法中都导致了更高的存活率。将凝固盐浓度提高五倍后，ATP 浓度下降了一个数量级。较高的盐浓度导致涂层厚度增加，但活细胞的数量很少。

图 12. 凝固盐浓度对生物涂层中大肠杆菌细胞存活率的影响（通过 ATP 测定确定）。将已知浓度的 20 μL Ca(NO3)2·4(H2O) (0.2 M 和 1 M) 沉积在 0.5 cm × 3.5 cm 的面积上。比较了两种涂层形成方法：(a) 湿烧结；(b) 浸泡在水中的湿烧结。1 M 的凝固盐浓度导致的存活率显著低于 0.2 M 的浓度（无论是通过 ATP 测定还是通过湿润烧结获得）。每个条形代表至少三次生物重复实验的平均值，每次实验包含三个技术重复。误差条代表三次生物重复实验平均值的标准误差。使用了带有 Welch 校正的 T 检验。(N = 3；* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001；**** p < 0.0001)。

在湿润烧结过程中，盐保留在涂层中；而在湿烧结过程中，部分盐可能在浸泡过程中扩散到液体（水中），从而降低了细菌周围的局部盐浓度。然而，在这两种情况下，较高的凝固盐浓度都导致了较低的活细胞数量，尽管涂层厚度更大。当然，基底上的盐对凝固浸渍过程是必需的。因此，需要优化盐的量以达到每单位面积最大的活细胞数量。**生物涂层中细菌的代谢活动与乙醇生产**

人们仍对利用大肠杆菌从非石油碳源生成液态生物燃料感兴趣，并通过基因改造来提高产量。(61) 在后续实验中，通过葡萄糖发酵生产乙醇被用作证明细菌在生物涂层中代谢活动的示例，同时也指出了未来的应用方向。比较了两种生物涂层：一种是通过浸没式共凝和湿烧结方法制成的，另一种则是通过干烧结方法制成。两种生物涂层在含有葡萄糖的培养基中都能产生乙醇（详见支持信息中的方法部分）。结果表明，湿烧结生物涂层的产率似乎高于干烧结生物涂层（见图S14）。

**结论**

我们提出了一种新的生物涂层制备策略，根据ATP检测结果，该策略能够提高细胞活性。共凝凝胶化形成一个由松散堆积的胶体颗粒组成的多孔结构。这些颗粒通过浸入适宜培养基并在高于聚合物玻璃化转变温度（Tg）的条件下进行湿烧结而部分聚合，从而形成既坚硬又透气的涂层。在湿烧结过程中，涂层中的空隙会变粗，这提供了一种简单的方法来调节孔径分布，进而控制涂层的透气性。当使用LB培养基进行湿烧结时，大肠杆菌的存活细胞数量比传统干烧结方法高出了350多倍。为了获得最佳的细菌活性，基材上的凝结盐覆盖率应尽量低以满足所需的厚度。湿烧结生物涂层时应使用LB或类似的培养基（以避免渗透压应力），并且涂层形成后不应进行干燥。

这些创新的薄膜形成方法将促进生物涂层在环境修复、碳捕获、生物燃料生产和生物传感等领域的应用。在这项工作中，展示了通过湿烧结生物涂层进行葡萄糖发酵生产生物乙醇的过程。在未来的研究中，可以运用优化后的生物涂层中的大肠杆菌通过厌氧发酵过程生产氢气。(62,63) 共凝凝胶化和湿烧结的加工方法适用于任何细菌种类，尤其是对于不耐干燥的细菌来说更为有利。在未来的研究中，可以不使用极端微生物来进行碳固定和氧气生产，(8) 而是选择其他常见菌种，即使它们不耐干燥。

**乳胶合成所需的化学品**

从Sigma-Aldrich购买了n-丁基丙烯酸酯（≥99%，含10–60 ppm单甲基醚对苯二酚作为抑制剂）和甲基丙烯酸甲酯（MMA，99%，含≥30 ppm MEHQ作为抑制剂）。在使用前，n-丁基丙烯酸酯和甲基丙烯酸甲酯通过短柱装的碱性活化氧化铝过滤器去除抑制剂。丙烯酸（98%，超高纯度且经过稳定处理）来自Acros Organics，并通过碱性活化氧化铝过滤器进行处理。Dowfax 2A1（活性成分46%）由Dow Chemical公司提供。2,2′-偶氮[2-甲基-N-(2-羟乙基)丙酰胺]（VA-086）由Wako Chemicals GmbH提供，并在使用前从甲醇中重新结晶。

**乳胶合成**

我们开发了一种乳胶配方，旨在使用尽可能少的表面活性剂的同时保持胶体的稳定性。丙烯酸用于赋予电荷稳定性。通过乳液聚合法合成了两批丙烯酸共聚物乳胶：第一批用于浸没式湿烧结研究，第二批专门用于制备生物涂层。第二批的合成是按第一批的3倍规模进行的。Dowfax 2A1表面活性剂（1.24克）与等量的去离子水混合制成溶液；VA-086引发剂（0.67克）溶解在45.44克去离子水中。将MMA（54.50克）、BA（38.53克）和AA（0.97克）混合后加入反应体系。整个表面活性剂溶液和单体混合物（102毫升）加入装有636.45克去离子水的双层玻璃反应器中。反应器配备有外部循环加热浴、距容器底部约2厘米处的Teflon锚式搅拌器、冷凝器以及温度探头。在200转/分钟的速度下搅拌的同时对反应器及其引发剂溶液进行脱气处理60分钟，随后将反应器加热至85°C并加入引发剂溶液（45毫升）以开始聚合反应。整个反应过程持续3小时。期间通过称重法监测转化率，通过动态光散射法测量颗粒大小。反应完成后，乳胶通过200微米滤网过滤收集到无菌容器中（未添加缓冲液），最终pH值为5。

两批乳胶的详细信息见表2。乳胶对于二价阳离子（Mg2+）的临界凝聚浓度C*为0.07 M。乳胶表征方法的详细描述见支持信息。

**共凝剂浸泡用基材**

选择200微米厚、孔径2.5微米的级5滤纸（Whatman）作为基材，因为它具有吸水性和机械耐久性。选择四水合硝酸钙（Ca(NO3)2·4H2O，99%，Sigma-Aldrich）作为共凝剂，因为它具有良好的涂覆性能、吸湿性且不易形成大颗粒。根据Schulze-Hardy规则，由于二价阳离子的凝聚浓度低于单价阳离子，因此更适用。(64) 将0.2 M或1 M浓度的Ca(NO3)2·4(H2O)溶液（取决于实验需求）滴在2.5厘米×3.5厘米的滤纸表面上（加热至80°C）。干燥15分钟后，让基材在室温（21°C）下平衡。

共凝剂的面积密度ρc通过公式计算得出，所需参数包括共凝剂盐浓度c、沉积体积Vc和基材表面积As：ρc = c * Vc / As。实验发现，当共凝剂停留时间为20秒、硝酸钙四水合物的面积密度为0.057摩尔/平方米时，可获得厚度超过200微米的均匀涂层。该面积密度是通过将4.723克硝酸钙四水合物加入20毫升去离子水中得到的。在大多数实验中使用了这一面积密度。

**细菌培养**

实验中使用的非致病性大肠杆菌BW25113是Keio收集系列的实验室适应型原始菌株。(65) 菌体培养基（LB）按制造商推荐的方法制备：将25克/升的菌粉溶解在去离子水中，调节pH至7.2后，然后在121°C下高压灭菌15分钟以杀菌。LB培养基包含10克/升酪蛋白消化物胨、10克/升氯化钠和5克/升酵母提取物，酵母提取物有助于细胞生长。

磷酸盐缓冲盐水（PBS，Oxoid）溶液也是通过添加一片药片到100毫升去离子水中制备的。PBS溶液的组成包括8克/升氯化钠、0.2克/升氯化钾、1.15克/升磷酸二氢钠和0.2克/升磷酸二氢钾。根据制造商建议，PBS溶液需在115°C下高压灭菌10分钟。

**薄膜形成**

使用电动浸渍装置（TA-XT Plus，Stable Micro Systems，Godalming，英国）控制共凝凝胶化过程。盐涂覆的基材垂直浸入乳胶悬浮液中指定时间（通常为20秒），然后以10毫米/秒的速度垂直抽出。

共凝凝胶化后，通过湿烧结进行薄膜形成。对于湿烧结，将基材固定在烧杯顶部并使用粘合漆固定，随后将其浸入水中（或其他液体中）。样品在设定温度的加热板上保持固定时间。湿烧结实验中使用了不同的水温（23°C、29°C、35°C、38°C、45°C、49°C和59°C）。在其他实验中，温度固定不变，样品在特定湿烧结时间后取出。

湿烧结后，将涂层基材从水中取出并沥干多余水分，然后置于相对湿度85%（使用氯化钾饱和溶液调节）且温度为23°C的湿度箱中以保持水分。使用Vernier卡尺测量基材和干燥涂层的厚度。

**生物涂层的薄膜形成**

通过向10毫升乳胶分散液中加入1.5毫升E. coli BW25113悬浮液制备混合物。涂层通过湿烧结、湿法或干法烧结形成。采用先前的共凝剂浸泡和湿烧结方法。湿烧结在去离子水、PBS或LB培养基中进行，且需在实验室大气条件下进行。有些实验中，湿烧结后的涂层在室温下保存（而非在潮湿环境中）。

对于湿烧结，通过将样品置于装有KCl饱和溶液的密封容器中，保持相对湿度约85%。对于干烧结，将凝胶涂层在温度可控的房间中（30°C、相对湿度40%）保存2小时，随后恢复至大约21°C。

**ATP检测**

ATP在萤光素酶催化剂的作用下会发出光，测量得到的光强度与ATP浓度呈线性关系。(66) 文献中提供了将发光强度与ATP浓度关联的主曲线。(8) 详见支持信息中的图S12。

**实验步骤**

- **乳胶制备**
制备乳胶时使用了最少量的表面活性剂，同时保持胶体稳定性。
- **共凝剂浸泡**
选择200微米厚、孔径2.5微米的Grade 5滤纸作为基材。
使用四水合硝酸钙（Ca(NO3)2·4H2O，99%，Sigma-Aldrich）作为共凝剂，因其具有良好的涂覆性、吸湿性和不易形成大颗粒的特点。根据Schulze-Hardy规则，二价阳离子比单价阳离子具有更低的凝聚浓度。(64)
将0.2 M或1 M浓度的Ca(NO3)2·4(H2O)溶液滴在2.5厘米×3.5厘米的滤纸上，并在80°C下干燥15分钟。
计算共凝剂的面积密度ρc：
ρc = c * Vc / As
当共凝剂停留时间为20秒、硝酸钙四水合物的面积密度为0.057摩尔/平方米时，可获得均匀涂层。
- **细菌培养**
使用实验室适应型的大肠杆菌BW25113作为模型菌株。
LB培养基按制造商推荐方法制备：将25克/升菌粉溶解在去离子水中，调节pH至7.2后高压灭菌15分钟。LB培养基含有10克/升酪蛋白消化物胨、10克/升氯化钠和5克/升酵母提取物。
- **其他耗材**
PBS溶液从药片形式制备：将一片药片加入100毫升去离子水中，包含8克/升氯化钠、0.2克/升氯化钾、1.15克/升磷酸二氢钠和0.2克/升磷酸二氢钾。PBS溶液在115°C下高压灭菌10分钟。
初始OD值为0.05的LB培养基中细菌浓度达到约10^10 CFU/mL（CFU为菌落形成单位）时，离心10分钟（5000g），去除上清液并将菌体重新悬浮在1毫升LB培养基中。
- **湿烧结实验**
M9培养基（Sigma-Aldrich）通过将10.5克粉体溶解在去离子水中、调节pH并高压灭菌15分钟制备。另分别制备1 M硫酸镁（MgSO4）和20%葡萄糖分散液，并通过0.22微米孔径的过滤器灭菌。冷却后，按制造商推荐比例向每升M9培养基中加入2毫升MgSO4和20毫升葡萄糖分散液。最终溶液含有的盐浓度为：6克/升磷酸二氢钠、3克/升磷酸二氢钾、0.5克/升氯化钠和1克/升氯化铵。葡萄糖是细菌的碳源。发光强度是在CLARIOstar Plus设备（BMG LABTECH，英国艾尔斯伯里）上测量的，并通过使用标准曲线将其转换为ATP浓度（见支持信息中的图S12）。从同一浸渍样品的不同区域获得的三个测量值被称为“技术重复实验”，这些数据被平均以得出一个平均数值。对于每种类型的样品，至少进行了三次“生物学重复实验”，通过在不同的日子里使用新的乳胶/细菌混合物来重复实验。从这些生物学重复实验中获得了平均值及其相应的标准偏差（通常N=3）。使用GraphPad Prism软件（版本8.4.3，适用于Windows系统，美国圣地亚哥）计算p值，以提供样品间统计显著性的数值表示。p值越小，表示实验间的统计显著性越高。通常，5%的显著性水平（对应于p值<0.05）被用作显著性的指标。

图表
参考文献
支持信息