玻璃体是眼睛中最大的结构，填充在晶状体和视网膜之间的空间。尽管它大约由99%的水组成，但其粘度是纯水的两到四倍。其凝胶状质地源于其富含有蛋白质（主要是胶原蛋白）和多糖（主要是透明质酸）的成分。玻璃体充当分子在眼睛前部和后部之间自由移动的屏障。由于玻璃体缺乏血管，因此营养物质由视网膜和睫状体的血管提供[1,2]。因此，玻璃体的结构和生化变化可能反映了视网膜中正在进行的病理生理过程[3]。
玻璃体的组成尚未被完全探索。因此，非靶向方法为发现新的成分提供了宝贵的机会。在这方面，非靶向代谢组学能够全面测量小分子，并在眼科研究中得到广泛应用。
虽然已经使用代谢组学方法研究了玻璃体，但相关研究数量有限，且大部分研究集中在死后样本上[4],[5],[6],[7],[8],[9],[10]。与疾病相关的研究主要集中在糖尿病性[11]和缺血性视网膜病变[12],[13],[14],[15],[16],[17]，以及其他退行性[18],[19],[20]、炎症性[21]和玻璃体视网膜界面疾病[3,22]上。在分析上，已应用了多种平台，包括NMR[4],[5],[6],[7],[12,13,18,19]、GC-MS[8,11]和LC-MS[5,[8],[9],[10],[14],[15],[16],[17],[20],[21],[22],[23],[24],[25],[26]，来分析人类[5,6,9,[11],[12],[13],[14],[15],[16],[17],[20],[21],[22],[23],[26]和动物样本[5,8,10,18,19,24,25]的玻璃体代谢组。
由于伦理原因无法从健康个体获取玻璃体样本，因此玻璃体代谢组学研究中的对照样本通常来自死后样本或接受玻璃体膜切除术（ERM）或黄斑孔（MH）手术的患者。这些情况通常被认为对全身或视网膜代谢的影响较小。因此，尽管这两种情况在临床上有差异且发病机制尚未完全明了，但它们仍常被合并为单一对照组[14,15,27,28]。因此，我们评估了在当前分析条件下，是否可以将ERM和MH样本实际合并为LC-MS基玻璃体代谢组学研究中的对照组。MH和特发性ERM是玻璃体视网膜界面的年龄相关疾病。免疫细胞、蛋白质、多种细胞因子、生长因子、转录因子和调节因子在这些疾病的发病机制中起作用[29],[30],[31]。一项针对ERM的全基因组关联研究指出，胶原及其相关机制是相关因素之一[32]。根据对MH和ERM患者玻璃体标本的蛋白质组学研究[33]，与MH和ERM相关的常见生物学过程包括细胞粘附、神经系统发育、细胞外基质组织及炎症。然而，复杂的分子机制仍不甚明了。
为了解决这一问题，进行了蛋白质组学分析，发现特发性ERM和MH患者的玻璃体成分存在显著差异。?hman等人共鉴定出160种在两组间有显著差异的蛋白质[33]。另一方面，转录组分析仅显示了微小差异，没有明显的区分能力[34]。这些发现突显了区分ERM和MH的分子证据的不一致性，也表明缺乏基于代谢组学的比较。这激发了我们进行本研究的灵感。
文献中描述的LC-MS分析用的玻璃体制备方案在复杂性和样品处理方式上存在很大差异。一些方案将样品分为两部分（例如，甲醇提取与氯仿提取），然后分别进行分析；而其他方案则依赖双相系统（如甲醇/氯仿混合物），并在不同平台上分析上层和下层。鉴于临床样本量有限以及需要高通量处理流程，我们旨在建立一种简单的一步制备方案，避免分馏。这种方法允许在同一提取物上同时进行反相（RP）和HILIC色谱分析，以实现广泛的代谢物覆盖。
本研究旨在为非靶向LC-MS代谢组学的玻璃体样品制备提供一种合理和系统的方法。该方法采用基于非靶向代谢组学的整体指纹分析方法，而不是完全经过验证的定量分析方法。因此，该方法并未按照通常应用于定量分析方法的验证要求进行开发和评估。相反，它的目的是为了实现研究组间的稳健比较分析。优化后的方案随后被应用于探讨ERM和MH患者的样本是否可以作为眼科代谢组学研究中的实用对照组。
