纳米花状钴金属-有机框架作为类似氧化酶的纳米酶，1,2-二氨基苯作为催化底物，用于创新的前列腺特异性抗原适配体传感“开-关”信号传导机制

《RSC Advances》：Nanoflower-shaped cobalt-metal–organic framework as an oxidase-like nanozyme and 1,2-diaminobenzene as a catalytic substrate for the innovative signal “off-on” aptamer sensing of prostate-specific antigen

　　陈 况| 张 瑜| 王 星天| 谢 平英| 吴 少婷| 郑 延芳| 黄 明清
福建中医药大学附属医院泌尿科，福州 350004，中国

开发简单、灵敏且可靠的前列腺特异性抗原（PSA）检测方法对于前列腺癌的早期筛查和诊断具有重要意义。在这项研究中，首次构建了一种新型的“开-关”电化学适配体（Apt）传感平台来检测PSA，该平台利用合成的纳米花状三维钴金属-有机框架（Co-MOF）作为模拟氧化酶的纳米酶，并使用1,2-二氨基苯作为催化底物。在这种设计中，Co-MOF纳米酶可以直接催化1,2-二氨基苯的氧化生成二氨基苯嗪（DAP），这种物质具有电活性，且不需要H2O2。然而，当制备的Co-MOF纳米酶与PSA特异性适配体结合时，其酶样活性会因适配体堵塞活性位点而受到抑制，导致DAP电流消失，进而对应于“关”状态信号。值得注意的是，在PSA存在下，由于适配体与PSA的特异性结合使适配体从Co-MOF表面脱离，Co-MOF的催化活性得以恢复，DAP电流重新出现，信号切换到“开”状态。在优化关键实验参数后，所提出的基于“开-关”纳米酶的电化学适配体传感器表现出优异的PSA检测性能。此外，通过简单地更换相应的适配体，该平台可能为检测多种生物标志物提供一种新的、简单且可靠的策略。

**1. 引言**
前列腺特异性抗原（PSA）是前列腺癌早期诊断和后续管理的关键生物标志物。其灵敏且高效的测定对于早期临床筛查、疾病预防以及疾病进展监测至关重要。通常，健康人的PSA浓度低于4 ng/mL。因此，已经开发出了多种具有高选择性和灵敏度的分析技术，包括荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定、表面等离子体共振分析、荧光免疫测定和表面增强拉曼散射。然而，这些方法通常需要专业操作人员和高昂的仪器，并且复杂且耗时较长。因此，以其简单性、快速性和成本效益著称的电化学和比色方法越来越受到关注。事实上，最近已经设计了几种创新的电化学传感平台用于PSA检测，但这些方法涉及复杂的信号标记和抗体、DNA及适配体等识别元素的固定过程。近年来，纳米酶的出现为电化学传感领域开辟了新的研究方向。与天然酶不同，人工纳米酶具有易于获取、稳定性强和成本低等优点，从而使得基于纳米酶的电化学传感器在食品安全、环境监测和疾病诊断等方面具有广阔的应用前景。最近，采用模拟过氧化物酶（POD）的纳米酶的适配体调控“开-关”传感策略引起了极大兴趣，因为它们消除了复杂的标记和受体固定步骤的需求。然而，这类POD样纳米酶系统在催化过程中仍然依赖于过氧化氢（H2O2）的存在，这带来了安全隐患并限制了其实际应用。相比之下，模拟氧化酶（OXD）的纳米酶能够利用环境中的氧而非H2O2来催化底物氧化，为生物传感、抗炎和抗菌应用提供了更安全、更方便的选择。因此，基于OXD样纳米酶的“开-关”传感平台的进步对于设计创新传感器系统具有重要意义。

在本研究中，首次通过简单的热溶剂法合成了纳米花状三维钴金属-有机框架（Co-MOF）。表征结果表明，所得Co-MOF纳米酶表现出显著的氧化酶样催化活性，能够在不需要H2O2的情况下催化1,2-二氨基苯的氧化生成二氨基苯嗪（DAP）。将PSA特异性适配体固定到Co-MOF表面后，由于活性位点被堵塞，OXD样活性被有效抑制，导致DAP氧化峰消失，即对应于“关”状态信号。值得注意的是，在PSA存在下，由于适配体与PSA的特异性结合使适配体从Co-MOF表面脱离，催化活性得到恢复，DAP电流重新出现，信号切换到“开”状态。基于这一机制，开发了一种新型的“开-关”电化学适配体传感器，用于简单而灵敏地检测PSA（图1）。该平台不仅避免了传统的适配体固定需求，还为前列腺癌的早期诊断以及检测PSA以外的多种生物标志物提供了巨大潜力。

**2. 实验部分**
2.1 **试剂和设备**
PSA购自Sigma-Aldrich（中国）；牛血清白蛋白（BSA）、溶菌酶（Lys）、谷胱甘肽（GSH）和凝血酶（TB）来自Sangon Biotech Inc。Co(NO3)2·6H2O、2-甲基咪唑（2-MI）和OPD购自Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd；甲醇（MeOH）由上海Macklin Biochemical Technology Co., Ltd提供。PSA特异性适配体购自Sangon Biotech Inc（上海，中国）。所有试剂均为分析级，按收到时的状态使用。电化学测量在CHI600F电化学工作站（中国）上进行。
2.2 **Co-MOF的合成**
Co-MOF的合成按照先前的报道方法进行。简要来说，将1.5 mM Co(NO3)2·6H2O溶解在30 mL MeOH中并磁力搅拌5分钟，然后逐滴加入含有3 mM 2-MI的MeOH溶液，继续磁力搅拌5分钟。将得到的混合物转移到75 mL四氟乙烯衬里的高压釜中，在120°C下加热12小时，随后自然冷却至室温。最后，所得Co-MOF依次用乙醇和去离子水洗涤，并在60°C下干燥过夜。
2.3 **适配体传感器的制备和PSA检测**
首先用10 μL Co-MOF纳米酶悬浮液（0.5 mg/mL）修饰抛光玻璃碳电极（GCE）。将得到的Co-MOF/GCE浸泡在适配体溶液中，使适配体吸附在表面形成Apt/Co-MOF/GCE。随后，将Apt/Co-MOF/GCE与不同浓度的PSA溶液（50 μL）共同孵育，并在含有OPD的氧气饱和醋酸缓冲液（0.1 M）中使用差分脉冲伏安法（DPV）进行测试。

**3. 结果与讨论**
3.1 **Co-MOF的表征**
Co-MOF纳米杂化材料是通过含有2-MI和Co(NO3)2·6H2O的混合物的水热处理合成的，其形态和结构通过SEM和TEM进行了表征（图1）。SEM图像清楚地显示，合成的Co-MOF具有由二维纳米片组装而成的三维纳米花状结构，平均直径约为3 μm，这与TEM观察结果一致。能谱X射线光谱（EDS）元素映射进一步证实了Co、N、O和C在整个材料中的均匀分布。粉末X射线衍射（PXRD）显示了Co-MOF的晶体相特征峰位于约10.42°（图S2），这与该材料的典型衍射图案相对应。傅里叶变换红外光谱（FTIR）用于研究分子结构和化学组成。如图S3所示，2823和2926 cm?1处的峰对应于C–H伸缩振动，而3465 cm?1处的峰与表面羟基（–OH）相关。此外，1350和1632 cm?1处的峰归因于Co–O键。这些发现与先前的报道数据一致，证实了Co-MOF的成功合成。此外，制备的Co-MOF/GCE通过电子显微镜进行表征，图S4显示大量Co-MOF纳米杂化物分散在GCE表面，证实了纳米酶在GCE表面的成功固定。

3.2 **检测原理和可行性**
检测原理可总结如下：
(a) Co-MOF纳米酶表现出显著的OXD型催化活性，能够催化OPD生成DAP，产生可检测的电流信号。
(b) 通过简单的吸附和静电相互作用将PSA相关适配体固定在Co-MOF表面后，纳米酶活性被抑制，导致DAP峰消失（“关”状态信号）。
(c) 在加入PSA后，Apt/Co-MOF的催化活性恢复，DAP电流相应增加（“开”状态信号）。图2显示了含有饱和氧的缓冲液中不同电极的DPV响应。裸露的GCE在扫描电位范围内未观察到DAP氧化峰，表明GCE本身不能催化OPD氧化生成DAP。相比之下，合成的Co-MOF在约?0.41 V处表现出明显的还原峰，表明Co-MOF纳米酶具有显著的OXD样活性，并且可以在没有H2O2的情况下催化OPD氧化。当适配体吸附在Co-MOF表面形成Apt/Co-MOF/GCE时，催化活性被抑制，DAP电流消失（“关”状态信号）。加入PSA后，这种活性恢复，还原峰重新出现。这种恢复归因于适配体与PSA的特异性结合，导致适配体从纳米酶表面脱离。传感原理通过电化学阻抗谱进行了表征。如图S5所示，电荷转移电阻（Rct）由Nyquist图中的半圆直径表示。将EIS数据拟合到等效电路后发现，Co-MOF/GCE的Rct值相对较小，而Apt/Co-MOF/GCE的Rct值显著增加。这种电阻升高可以归因于适配体通常较低的导电性。在PSA存在下，Rct值减小，从而证实了Apt/Co-MOF传感器的成功构建。基于这种行为，使用Co-MOF作为模拟OXD的纳米酶和OPD作为催化底物，开发了一种用于PSA的“开-关”电化学适配体传感器。

3.3 **PSA检测**
在定量检测PSA之前，优化了几项关键实验条件以提高检测灵敏度，包括Co-MOF的用量、OPD的浓度以及适配体和PSA的孵育时间。PSA添加前后DAP电流的差异（ΔI）被视为分析信号。如图3所示，最佳参数确定为：Co-MOF用量10 μL；OPD浓度1.5 mM；适配体孵育时间16分钟；PSA孵育时间20分钟。随后使用这种由适配体控制的“开-关”传感器检测不同浓度的PSA。如图4a所示，DAP电流随PSA浓度的增加而逐渐增加，表明PSA可以恢复Co-MOF纳米酶的OXD样催化活性。ΔI值与PSA浓度的对数在80至10,000 pg/mL范围内呈线性关系，回归方程为y = ?0.5645 ? 0.0012x（R2 = 0.9963）（图4b），计算得到的检测限（LOD）为20 pg/mL（S/N = 3）。与先前报道的电化学PSA传感器相比，本研究开发的平台提供了可比或更低的LOD以及更宽的线性范围。这种优异的检测性能归因于Co-MOF纳米酶出色的OXD样活性。值得注意的是，“开-关”传感设计消除了复杂的标记和受体固定步骤，从而简化了整体检测流程并提高了操作便捷性。开发的Apt/Co-MOF传感器与之前报道的用于检测PSA的电化学传感器性能比较

| 传感器 | 线性关系 (pg/mL) | 检测限 (pg/mL) | 参考文献 |
|------------------------|------------|--------------|------------|
| Ab/HO-BN/COOH-CDs@AuNPs | DPV | 1–3.5 × 10^4 | 0.136 | 26 |
| Apt/GA/AuNPs/Nafion | DPV | 5–5 × 10^4 | 0.6 | 27 |
| Ab/AuNPs/rGO | Amperometry | 0.1–1 × 10^7 | 30 | 28 |
| Ab/AuNRs/rGOD | DPV | 100–1.5 × 10^4 | 16 | 29 |
| Ab/Cys-AuNP | DPV | 5 × 10^3–2.5 × 10^5 | 47 | 30 |
| Ab/APBA/6-PICA | SWV | 500–1 × 10^5 | 110 | 31 |
| AuNPs on annealed gold island | DPV | 50–3 × 10^4 | 5.7 | 28 |
| Apt/Co-MOF | DPV | 80–10^4 | 20 |

**本工作**
为了评估所开发的“Apt/Co-MOF”传感平台的選擇性和特异性，研究人员对其对PSA以及潜在干扰物质（包括Lys、TB、BSA、GSH和AA）的响应进行了测定（图5a）。结果表明，只有PSA（0.4 ng/mL）能够显著降低电流信号，而其他物质即使在PSA浓度的六倍时，对ΔI的影响也微不足道。此外，还在PSA与这些干扰物质混合的情况下检测了电化学响应，发现DAP信号没有显著变化。这些发现证实了“Apt/Co-MOF”传感器的高选择性和特异性。为了评估重复性，使用九个独立制备的Apt/Co-MOF/GCE传感器测量了与0.4 ng/mL PSA孵育后的DAP电流响应。如图5b所示，ΔI值的相对标准偏差（RSD）仅为4.37%，表明其重复性极佳。此外，还研究了传感器的稳定性。存储35天后，传感器仍保持其初始电流响应的90.2%（图5c），显示出良好的长期稳定性。

**实际应用性验证**
使用南京医科大学第一附属医院提供的人体血清验证了“Apt/Co-MOF”传感器的实际应用性，结果发现无法检测到PSA的初始浓度。因此，引入了标准加入法来确认其实际应用性。具体操作是将不同浓度的PSA加入血清样本中，并记录相应的电化学响应以确定PSA水平。同时，通过将所提出方法的结果与ELISA技术的结果进行比较来验证其准确性。如表S1所示，回收率范围为92.7–96.5%，RSD值在2.64%至3.24%之间，两种方法得到的结果一致。这些发现表明，所开发的“Apt/Co-MOF”传感器适用于检测实际生物样本中的PSA。最后，为了研究该传感平台的普适性，通过更换不同的Apt分子，使用设计的“Apt/Co-MOF”传感器检测了癌胚抗原（CEA）。如图S6所示，使用Apt/Co-MOF/GCE检测到的DAP电流下降幅度小于使用Co-MOF/GCE的情况。加入CEA目标物后，响应增加。这些结果表明，这种传感策略适用于通过使用不同的Apt分子来检测其他生物标志物。

**结论**
本研究开发了一种创新的“Apt/Co-MOF”传感策略，该策略基于Co-MOF纳米杂化体的OXD类似纳米酶活性来检测PSA。制备的Co-MOF纳米酶能够直接催化OPD的氧化生成DAP，从而无需通常在POD类似纳米酶系统中所需的H2O2。当Apt固定在Co-MOF表面形成Apt/Co-MOF传感界面时，OXD类似活性显著减弱，导致DAP峰值电流下降（“关闭”状态）。加入PSA后，催化活性恢复，产生的DAP信号随PSA浓度线性增加，对应于“开启”状态。通过优化关键实验条件，所提出的“Apt/Co-MOF”传感器表现出优异的PSA检测性能，检测限为20 pg/mL，线性范围为80–10000 pg/mL。这种基于OXD类似纳米酶的简单“Apt/Co-MOF”传感平台为电化学检测PSA和其他生物标志物提供了一种有前景的新方法，显示出巨大的实际应用潜力。

**利益冲突**
无需声明利益冲突。

**数据可用性**
数据可应要求提供。
补充信息（SI）可查阅：https://doi.org/10.1039/d6ra01552b