整合减法蛋白质组学和基于反向疫苗学的免疫信息学技术，以开发针对Waddlia chondrophila的多表位疫苗

《Scientific African》：Integrating subtractive proteomics, and reverse vaccinology-based immunoinformatics techniques to build a multi-epitope vaccine for Waddlia chondrophila

　　哈马德·阿卢菲市|哈桑·纳赛尔·B·阿尔穆汉纳|里亚德·巴德拉维|阿卜杜勒·莫尼姆·埃尔哈迪·苏莱曼
沙特阿拉伯海尔大学理学院生物系，海尔2440

摘要
Waddlia chondrophila属于衣原体目细菌。W. chondrophila是最常见的肺炎致病菌。此外，该细菌感染还可能导致女性多次流产。由于目前尚无获准使用的疫苗来对抗这种细菌感染，因此亟需解决由此引发的问题。本研究从W. chondrophila菌株中提取了整个蛋白质组，共鉴定出1919种蛋白质。通过减法蛋白质组学分析，从这1919种蛋白质中筛选出4种目标蛋白。进一步分析了这4种目标蛋白的毒性、抗原性和致敏性，并利用反向疫苗学免疫信息学技术制备了多表位疫苗（MEV）。为了更深入地了解疫苗的结合能、结合亲和力及相互作用机制，研究人员进行了分子对接分析。结果显示，MEV能与TLR4、TLR2、MHCI和MHCII发生结合反应，且这些候选疫苗与MEV相关的蛋白质具有很好的匹配度。针对TLR4、TLR2、MHCII和MHCI的结合能分别为-51.5 ± 10.3、-60.5 ± 9.2、-70.4 ± 23.7和-79.7 ± 10.2 kcal/mol。模拟实验进一步证实了这些结果。为了优化疫苗蛋白的表达效率，研究人员对相关密码子进行了优化，并将其克隆到大肠杆菌表达系统中进行体外表达。尽管这项研究的计算机模拟结果具有可靠性，但仍需进一步研究以验证所设计疫苗的有效性和性能。

引言
Waddlia chondrophila属于衣原体目，是一种专性细胞内寄生菌[1]。Waddliaceae科是构成衣原体目的六个科之一[2]。该菌首次在美国发现的病例是一名死胎的胎儿体内[3]，12年后在另一头牛中发现了该菌。2005年，在马来西亚的一只果蝠体内发现了与该菌91%基因相似的W. malaysiensis[4]。W. chondrophila是一种会导致反刍动物流产的病原菌，会造成严重的经济损失[5]。多项证据表明其血清阳性率与人类流产之间存在关联，提示该菌可能对人类妊娠有害[5]。此外，在患有细支气管炎和肺炎患者的呼吸道样本中也检测到了该菌[6]。尽管该病原体在临床和兽医领域具有重要意义，但其生物学特性和人畜共通性仍不完全清楚。因此，要全面了解其致病机制，需深入研究其细胞生物学、基因组结构、代谢途径及膜相关蛋白[6]。Baud及其同事认为，W. chondrophila在牛体内的致流产作用可能与其在人类流产中的致病性相关[6]。在一项针对438名女性的前瞻性研究中，69人出现过偶然性流产，200人反复流产，169人的妊娠结局不明确[7]。免疫荧光检测显示100名女性携带Waddlia病毒，其中抗Waddlia IgG阳性率为64%[8]。与对照组女性相比，伴有偶发性流产（31.9%）和反复流产（33%）的女性血清阳性率显著更高（p < 0.05）[9]。Western blot检测显示97名女性体内存在抗Waddlia IgG[10]。吸附实验进一步证实了抗体的特异性[11]。Waddlia的传播途径尚不明确[11]，尽管沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）是一种可导致流产的性传播病原体，但Waddlia的传播方式可能与沙眼衣原体不同[12]。C. elegans对Waddlia的血清阳性可能是由于抗体存在[13]。比较两项研究中的样本，未发现两者之间存在显著的交叉反应或传播机制[14]。这表明W. chondrophila并非通过性传播。分析显示，Waddlia的血清阳性与动物接触有关，提示其具有潜在的人畜共通风险[15]。该菌的宿主范围包括牛[16]，可能存在其他传播途径，因为水中的自由生活变形虫也可能被感染[16]。最近的研究在40份饮用水和井水中发现了W. chondrophila[17]，该菌也可能通过食用受污染的肉类或牛奶传播[18]。S. negevensis和P. acanthamoebae与呼吸系统疾病有关[19]。研究人员还检测了W. chondrophila是否存在于呼吸道样本中，在389名社区获得性肺炎患者中，1例PCR检测呈阳性，其16S rRNA基因序列与W. chondrophila菌株WSU 86-1044和2032-99的相似度分别为98%和99.7%[20]。开发了一种针对W. chondrophila的实时PCR检测方法，并应用于32名由非呼吸道合胞病毒（RSV）引起的细支气管炎患儿的鼻咽样本，结果在3个样本中检出该菌，其中1名患者同时感染了其他微生物[21, 22, 23]。

W. chondrophila被认为是导致人类流产的潜在原因之一，也可能引发呼吸道感染，但需要更多研究来明确其流行率、致病性和临床影响。目前尚无获批的针对该菌的疫苗或特定抗菌治疗方法。尽管多种广谱抗生素（包括多西环素）对类似衣原体的微生物有效，但针对W. chondrophila的专用治疗药物仍处于临床前或早期临床试验阶段[24]。疫苗是预防传染病的最有效手段之一。基因组测序、免疫信息学算法和免疫学数据库的进步有助于识别病原体蛋白的免疫原性表位，从而合理设计亚单位疫苗[25]。本研究通过分析W. chondrophila的蛋白质组，鉴定出具有抗原性的蛋白，并利用MHC等位基因预测B细胞和T细胞表位[26]。研究还探讨了表位的抗原性、保守性和全球分布情况，基于最具潜力和相互作用性的表位设计了多表位疫苗（MEV）[27]。由于具有高效性、稳定性和特异性，MEV优于单表位疫苗或传统疫苗，能同时诱导体液和细胞免疫反应[28]。由于含有T细胞和B细胞表位，MEV有望产生更持久的免疫效应[29]。通过多种计算机模拟方法验证了其抗原性、免疫原性和安全性[30]。

方法
蛋白质组提取与分析
从UniProt数据库（UniProt）以FASTA格式获取了Waddlia chondrophila菌株的完整蛋白质组[24]。使用Geptop 2.0服务器（cefg.uestc.cn）识别关键蛋白质，这些蛋白质对细菌生存至关重要，是潜在的疫苗靶点。通过BLASTp分析排除与人蛋白质同源的蛋白质，以降低交叉反应风险[25,26]。利用PSORTb v3.0（PSORTb亚细胞定位预测工具，版本3.0）确定蛋白质的亚细胞定位，因为细胞外和膜相关蛋白更容易被宿主免疫系统识别[27]。使用VaxiJen v2.0服务器（VaxiJen）评估所有候选蛋白的抗原性，阈值设定为0.5[28]。优先考虑具有较高抗原性得分的蛋白质用于肽类疫苗开发。含有多个跨膜螺旋结构的蛋白质因纯化和表达困难被排除[29]。使用TMHMM v2.0服务器（TMHMM 2.0 - DTU Health Tech - 生物信息学服务）预测跨膜结构，确保选定的靶点易于表达和适用于疫苗设计[29]。

表位预测
从UniProt数据库以FASTA格式获取Waddlia chondrophila菌株的完整蛋白质组[24]。使用Geptop 2.0服务器识别关键蛋白质，这些蛋白质对细菌生存至关重要，是疫苗开发的理想靶点。通过BLASTp分析排除与人类蛋白质同源的蛋白质[25,26]。利用PSORTb v3.0预测候选蛋白的亚细胞定位，重点关注细胞外和膜相关蛋白，因为它们更容易被宿主免疫系统识别[27]。使用VaxiJen v2.0服务器评估所有候选蛋白的抗原性，阈值设定为0.5[28]。优先考虑具有较高抗原性得分的蛋白质用于肽类疫苗设计。含有多个跨膜螺旋结构的蛋白质因表达和纯化困难被排除[29]。

CTL表位和HTL表位
细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位通过激活CD8? T细胞发挥关键作用，帮助清除细胞内病原体。本研究使用IEDB MHC I类结合预测工具预测CTL表位，该工具整合了多种算法（包括人工神经网络和稳定矩阵方法）来估计多种HLA I类等位基因的肽结合亲和力[31]。根据抗原性、免疫原性和毒性等指标筛选表位[32]。

B细胞表位
线性B细胞表位可产生抗原相关免疫球蛋白，对于适应性免疫至关重要。使用基于神经网络的ABCPred服务器（crdd.osdd.net）识别B细胞表位，准确率为75%[33]。利用AllergenFP v1.0、ToxinPred和VaxiJen v2.0服务器评估预测B细胞表样的抗原性和安全性[34]。AllergenFP v1.0采用了一种基于氨基酸属性派生的描述符指纹的无比对方法，并使用Tanimoto系数进行致敏性预测，总准确率约为88%。ToxinPred利用机器学习方法，特别是基于支持向量机（SVM）的模型，结合定量矩阵方法来预测肽的毒性，其准确率根据所使用的数据集和模型的不同而介于约90-95%之间。VaxiJen v2.0是一个与比对无关的预测服务器，它通过自交叉协方差（ACC）将蛋白质序列转换为统一向量，从而实现抗原性预测，其准确率根据特定生物体模型的不同而介于70-89%之间；本研究中使用的抗原分类阈值为0.4。[28,32,34]

在评估致敏性、毒性和免疫伪装方面，使用专门的免疫信息学工具系统地研究了免疫原性、毒性和免疫伪装的可能性，以确保预测表位和多表位疫苗（MEV） construct的安全性和适用性。这些测试没有考虑抗原性预测，因为抗原性是免疫识别的指标，而致敏性和毒性则是安全性的指标。AllerGoogle预测是在AllerTOP v2.0和AllergenFP v1.0服务器上进行的，这些服务器应用基于机器学习和描述符的算法来确定CTL、HTL和B细胞表位是否具有致敏性。ToxinPred服务器则利用定量矩阵和支持向量机（SVM）模型来预测肽的毒性。为了评估免疫伪装以及与宿主蛋白的相似性，通过Blastp分析与人蛋白质组进行比较，以排除与宿主蛋白高度同源的表位，从而降低免疫耐受、自身免疫反应或免疫逃避的风险。此外，还比较了理化性质和表位的保守性，以确保免疫原性广且表位没有免疫伪装。

人类白细胞抗原（HLA）等位基因在不同人群中的频率和表达水平存在差异，这对疫苗的效果有显著影响。因此，在设计多表位疫苗时，了解HLA等位基因的全球分布对于确保广泛的免疫原性覆盖至关重要。人群覆盖分析的主要目的是评估所选表位是否能够在多样化的人群中引发免疫反应。在这项研究中，使用Immune Epitope Database (IEDB)（IEDB.org：免费的表位数据库和预测资源）的人群覆盖工具[40, 41, 42]来评估预测表位的人群覆盖情况及其相应的HLA等位基因关联。这种分析有助于确定可能对疫苗产生反应的全球人口比例，从而指导选择具有最大全球适用性的表位。

为了构建多表位疫苗（MEV），使用AAY、GPGPG和KK肽连接剂分别将预测的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、辅助T淋巴细胞（HTL）和线性B淋巴细胞（LBL）表位战略性地连接起来，形成单一的连续融合肽。这些连接剂具有多重作用：它们保持表位之间的适当空间分离，防止空间阻碍，保持每个表位的独立折叠和结构完整性，并便于抗原呈递细胞（APCs）的有效处理和呈递。正确的表位排列和连接剂选择对于诱发体液和细胞介导的免疫反应的强烈协调激活至关重要。

基于肽的疫苗往往表现出较低的内在免疫原性，这可能限制它们诱导强烈免疫反应的能力。为了克服这一限制，加入了佐剂以增强抗原识别并刺激免疫信号通路。在此疫苗设计中，使用了EAAAK连接剂这种在基于免疫信息学的疫苗构建中广泛使用的刚性且特征明确的连接剂，将TLR-4激动剂佐剂RS-09（序列：APPHALS）共价连接到CTL表位的N端。这种刚性连接剂确保了结构稳定性，防止佐剂与表位之间发生不必要的相互作用，并允许两个成分协同发挥作用。RS-09佐剂的加入具有双重目的：它模拟了Toll样受体4识别的病原体相关分子模式，从而激活先天免疫信号通路，并促进树突细胞的募集和成熟，最终实现更有效的抗原呈递。这种精心选择的连接剂和强效佐剂的组合旨在优化疫苗的免疫原性，促进CTLs、HTLs和B细胞的强烈激活，并产生持久的保护性免疫反应。通过确保适当的表位暴露和免疫刺激，这种设计策略最大化了MEV提供广泛而有效保护的潜力。

研究人员使用BLASTp检查疫苗结构是否与人蛋白质组相似[43]。然后使用Protparam web服务器（Expasy - ProtParam）[44]评估疫苗构剂的理化性质。ProParam服务用于确定分子量、原子含量、氨基酸序列、消光系数、理论pI和估计半衰期等重要的因素[45]。Vaxijen服务器评估疫苗设计的抗原性，而IEDB Immunogenicity服务器评估免疫原性（抗原或非抗原）[31,33]。另一个重要步骤是使用AllerTOP服务计算疫苗设计的致敏性（致敏原或非致敏原）[46]。

计算工具允许直接从氨基酸序列预测蛋白质的三维（3D）结构，从而提供对其空间构象和功能性质的见解[47]。在这项研究中，使用SCRATCH套件中的3Dpro工具对多表位疫苗（MEV）构进行了三维建模。初步建模后，使用GalaxyRefine服务器[48]对预测结构进行了优化，该服务器优化了侧链构象并提高了整体结构精度。这种细化过程增强了局部几何结构和立体化学，如CASP细化类别中所强调的，从而提高了用于后续分析的三级结构的质量。为了评估细化模型的结构可靠性，使用了多种验证工具。Ramachandran图用于评估氨基酸残基的能量允许和不允许的phi（?）和psi（ψ）二面角，提供了骨干构象合理性的衡量标准[49]。ProSA-web进一步应用于评估预测结构的整体质量，确保与来自X射线晶体学、NMR光谱学和理论建模的实验派生蛋白质结构的兼容性[50]。此外，还使用了ERRAT服务器来评估蛋白质内的非键合原子相互作用，生成了一个反映三级结构准确性和稳定性的质量因子得分[51]。总的来说，这些评估证实了预测的MEV模型展示了适用于后续分子对接、免疫模拟和结构分析的可靠且生物学相关的三维构象。

使用IEDB v2.22 Ellipro工具和ABCPred网站[38,52]预测了MEV的B细胞表位。ABCPred服务器配置了14个字符的MEV氨基酸序列和0.5个字符的阈值。Ellipro应用程序还用于输入MEV 3D结构的默认参数。

多表位疫苗（MEV）要有效激活免疫系统，需要与其关键的免疫细胞受体相互作用，包括Toll样受体（TLRs）和主要组织相容性复合体（MHC）分子。为了评估这些相互作用，使用HADDOCK v2.2服务器进行了蛋白质-蛋白质对接分析，重点关注MHC I类和II类分子以及TLR2和TLR4[58]。HADDOCK是一个广泛使用的对接平台，它整合了分子界面区域的信息来预测相互作用蛋白之间的最佳方向和结合模式。与许多传统的对接工具不同，HADDOCK在复杂形成过程中允许骨架和侧链的构象灵活性，从而更准确地模拟动态的蛋白质-蛋白质相互作用。此外，它还支持多模型NMR结构和其他蛋白质数据银行（PDB）条目的对接[59]。在这项研究中，从PDB数据库中检索了TLR4（PDB ID: 4G8A）、TLR2（PDB ID: 2Z7X）、MHC I类（PDB ID: 1I1Y）和MHC II类（PDB ID: 1KG0）的晶体结构[60, 61, 62, 63]。这些结构在对接模拟中作为受体分子，允许详细评估MEV-受体复合物的结合亲和力、相互作用界面和稳定性[47,64]。通过搜索PDBsum数据库并使用PyMOL[64,65]成像这些复合物，发现了相互作用。PDBsum是一个在线工具，显示了每个PDB结构的重要信息的全面视觉细节。PROMOTIF结构研究包括了所有蛋白质链的二级结构、PROCHECK发现以及蛋白质-DNA和蛋白质-配体相互作用的图形表示。

使用Desmond模块中的分子力学Poisson–Boltzmann表面面积（MM/PBSA）和分子力学广义Born表面面积（MM/GBSA）方法计算了多表位疫苗（MEV）复合物与TLR2、TLR4以及MHC I类和II类分子的结合自由能[67]。Ante-MMPBSA.py脚本和MM/GBSA模块在Desmond中用于生成受体、疫苗和复合物系统所需的输入参数文件。这些计算的主要目的是估计溶剂化（结合）状态和未结合（未解析）状态之间的自由能差异，从而提供关于MEV-受体相互作用稳定性和结合亲和力的定量见解。这种分析有助于识别能量上有利的复合物，从而支持疫苗在诱发强烈免疫反应方面的潜力。

使用C-ImmSim服务器评估了多表位疫苗（MEV）的免疫原性和免疫基因组特性，这是一个常用的免疫信息学研究平台，它利用位置特定评分矩阵（PSSMs）来模拟肽与免疫系统不同组分的相互作用[55, 56, 57]。为了全面评估长期免疫记忆，模拟时间延长到600步，相当于200天周期，远远超过了最初的四周观察期。初次加强免疫方法的模拟基于在0天、28天和56天时的3次接种，有机会详细检查抗体水平（IgM、IgG1和IgG2）和细胞因子水平（IFN-γ和IL-2），并稳定B细胞和T细胞群体。这种纵向设计足以提供所需的数据，用于监测活性抗原清除向稳定记忆平台的转变，从而更准确地预测疫苗产生持久免疫的能力。

为了增强外源基因在宿主生物体中的表达，密码子优化是一种关键策略，因为来源和宿主之间的密码子使用差异可能导致翻译效率低下和蛋白质产量降低。为此，使用JCAT（Java Codon Adaptation Tool）程序对多表位疫苗（MEV）的核苷酸序列进行了密码子优化，使密码子使用符合大肠杆菌K12的偏好，以最大化翻译效率和蛋白质表达[53]。优化后，使用SnapGene v5.0.8软件将适应的基因序列在体内克隆到pET28a(+)表达载体中[54]。这一步骤确保了MEV构在载体中的正确方向和定位，促进了在细菌宿主系统中的高水平表达和下游实验验证。

通过减法蛋白质组学方法预测了W. chondrophila MEV设计的最佳候选者。这种方法最终从W. chondrophila全蛋白质组中移除了不太合适的蛋白质。W. chondrophila（菌株：ATCC VR-1470）的蛋白质组通过Uniprot获得，包含1919个蛋白质，详见补充文件1。然后使用CD-HIT方法进行筛选，设置了80%的阈值（0.8）。通过CD-HIT程序排除了非同源蛋白质。使用GepTop服务器确定了必需蛋白质，仅发现了332个必需蛋白质，并通过blastP确定了它们与人类蛋白质组的同源性。消除人类同源物非常重要，以避免将自身细胞误认为是外来颗粒而引发的自身免疫反应。为了防止这种情况，预测有134个必需蛋白质存在于细胞质中，4个存在于外膜区域和细胞外区域。细胞质蛋白质已被剔除，剩余的4个蛋白质被选为未来研究的目标，如图1所示。

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图1。结果的一种图形表示方法，采用了减法蛋白组学技术。表1中提到了4个目标蛋白质的详细信息，包括分子量、亚细胞定位、名称、访问编号和抗原性。根据分析报告，WADCW UDP-N-乙炔醇吡ruvoyl葡萄糖胺还原酶蛋白被选为目标，因为它满足了所有标准。

表1. 使用不同工具调查的四个目标蛋白质作为潜在目标。
| 蛋白质名称 | 亚细胞定位 | 分子量 | TMHs | 抗原性 | 过敏性 |
| --- | -------- | ----- | ----- | ---- |
| WADCW UDP-N-乙炔醇吡ruvoyl葡萄糖胺还原酶 | 外膜，细胞外 | 32.02千道尔顿 | 0 | 抗原（0.5898） | 非过敏性 |
| Protein-export membrane protein SecF | 外膜 | 170.28千道尔顿 | 0 | 非抗原 | 非过敏性 |
| Outer membrane protein assembly factor yaeT | 外膜 | 93.09千道尔顿 | 0 | 抗原 | 0.5918 | 过敏性 |
| FeS assembly protein SufB | 外膜 | 53.56千道尔顿 | 0 | 非抗原 | 非过敏性 |

**表2. 选定的用于开发疫苗构建的顶级CTL表位**
| 表位 | 等位基因 | 位置 | 过敏性 | 抗原性 | 免疫原性 |
| FHVGAGFSFSR | HLA-A*68:01 | 1 | 0.5159 | 0.072 | 1 |
| HLA-A*31:01 | 1 | 0.9138 | 0.074 | 1 |
| HLA-B*08:01 | 1 | 0.845 | 0.392 | 1 |
| HLA-A*11:01 | 1 | 0.766 | 0.845 | 1 |
| HLA-A*23:01 | 1 | 1.246 | 0.835 | 1 |
| HLA-A*03:01 | 1 | 1.590 | 0.072 | 1 |
| HLA-A*68:02 | 1 | 1.66-177 | 0.845 | 0.8 |
| HLA-A*29:02 | 1 | 1.246 | 0.920 | 1 |
| HLA-A*25:01 | 1 | 0.913 | 0.074 | 1 |
| HLA-A*30:01 | 1 | 0.835 | 0.845 | 1 |
| HLA-A*02:01 | 1 | 0.766 | 0.845 | 1 |
| HLA-A*68:02 | 1 | 0.920 | 0.845 | 1 |
| HLA-A*31:01 | 1 | 1.590 | 0.072 | 1 |
| HLA-A*25:01 | 1 | 0.913 | 0.074 | 1 |

**表3. 选定的用于开发疫苗构建的顶级HLA表位**
| 表位 | 等位基因 | 位置 | 过敏性 | 抗原性 | IFN-Y +ve | IL-4 | IL-10 |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| LVRNIQTQVKEKYGIE | HLA-DRB1*04:02 | 1 | 正 | 诱导器 | 非诱导器 |
| HLA-DRB1*04:26 | 1 | 正 | 诱导器 | 非诱导器 |
| HLA-DRB1*04:23 | 1 | 正 | 诱导器 | 非诱导器 |
| HLA-DRB1*04:26 | 1 | 正 | 诱导器 | 非诱导器 |
| HLA-DRB1*07:01 | 1 | 正 | 诱导器 | 非诱导器 |
| HLA-DRB1*13:07 | 1 | 正 | 诱导器 | 非诱导器 |

**表4. 选定的用于开发疫苗构建的顶级LBL表位**
| 表位 | 位置 | 分子量 | 抗原性 | 免疫原性 | 过敏性 | 毒性 |
| --- | --- | ------- | ---------- | ------------ | ------- |
| YHAYRLGPVFDEKNTQ | 30.92 | 0.92 | 0.50 | 27 | 非过敏性 | 非毒性 |
| TMHVEEGDQYRVGLIK | 35.40 | 0.92 | 0.79 | 32 | 非过敏性 | 非毒性 |
| HIEVEEGSTGNLGASV | 35.00 | 1.74 | 49 | 0.16 | 非过敏性 | 非毒性 |

**表5. MEV与MHC（I & II）和TLR（2 & 4）受体的分子对接分析**
| 参数 | TLR-4/MEV | TLR-2/MEV | MHC-1/MEV | MHC-II/MEV |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| HADDOCK得分 | -51.5 ± 10.3 | -60.5 ± 9.2 | -70.4 ± 23.7 | -79.7 ± 11.2 |
| 簇大小 | 107 | 48 | 12.8 | 18.5 | 11.2 |
| RMSD | 0.8 ± 0.4 | 12.8 | 18.5 | 11.2 |
| 范德华能量 | -51.2 ± 6.1 | -17.0 | -93.3 | -110.8 |
| 电静力量 | -312.3 | -505.3 | -544.7 | -291.3 |
| 凹陷表面面积 | 189 | 289 | 1487.0 | 200.8 | 344.7 |
| Z分数 | -2.2 | -1.5 | -1.9 | -2.0 |
| 结合亲和力（ΔG, kcal/mol） | -11.2 | -10.6 | -12.4 | -13.1 |

**表6. MEV与MHC（I & II）和TLR（2 & 4）受体的结合亲和力**
| TLR-4/MEV | TLR-2/MEV | MHC-1/MEV | MHC-II/MEV |
| HADDOCK得分 | -70.4 ± 23.7 | -79.7 ± 11.2 | -79.7 ± 11.2 |
| MMGBSA | -133.22 kcal/mol | -125.87 kcal/mol | -125.87 kcal/mol |
| MM-PBSA | -156.26 kcal/mol | -125.87 kcal/mol | -131.23 kcal/mol |

**表7. MEV与MHC-I和MHC-II的3D可视化**
| 参数 | TLR-4/MEV | TLR-2/MEV | MHC-1/MEV | MHC-II/MEV |
| RMSD值 | -60.5 ± 9.2 | -51.5 ± 10.3 | -60.5 ± 9.2 | -51.5 ± 10.3 |

**表8. 免疫模拟结果**
| 参数 | TLR-2/MEV | TLR-4/MEV | MHC-I/MEV | MHC-II/MEV |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| 结合能量 | -70.4 ± 23.7 kcal/mol | -79.7 ± 11.2 kcal/mol | -79.7 ± 11.2 kcal/mol |
| 极性溶解度 | 80.97 kcal/mol | 78.90 kcal/mol | 78.90 kcal/mol | 78.90 kcal/mol |
| 电静力量 | 80.97 kcal/mol | 78.90 kcal/mol | 78.90 kcal/mol | 78.90 kcal/mol |

**表9. 在菌株W. chondrophila中表达的MEV的二级结构分析**
| 参数 | SOPMA数据 | 结果 |
| --- | --- | --- |
| 抗原性 | 147个氨基酸形成α-螺旋（50%） | 56个氨基酸形成β-链（19.05%） | 66个氨基酸形成coil（22.45%） |
| MEV在大肠杆菌中的溶解度 | 高度可溶（概率0.916889） |

**表10. MEV疫苗构建的策略**
| 考虑因素 | 说明 |
| --- | --- |
| 无毒素 | MEV必须无毒 |
| 无过敏原 | 必须无过敏原 |
| 免疫原性 | 必须具有免疫原性 |
| 抗原性 | 必须具有抗原性 |
| 多表位疫苗设计 | 通过连接3个CTL表位、3个HLA表位和3个B细胞表位及其匹配的连接子和佐剂来创建疫苗 |
| 佐剂 | 使用EAAAK连接子将霍乱毒素B连接到疫苗构建物的N端 |

**图2. 用于构建MEV的人群策略**
**图3. 疫苗构建**
最终，我们创建了一个长度为294个氨基酸的线性疫苗设计。在进入下一步之前，还检查了其分子量。该构建物的分子量为30.95千道尔顿。该构建物没有跨膜螺旋，是非过敏性的，无毒的，抗原性为0.6922（可能的抗原）。此外，使用protparam工具评估后，它符合所有其他特征，包括脂肪族指数为88.03，不稳定指数（II）为28.45。

**图4. 疫苗构建的3D可视化和评估**
使用I-TASSER创建了疫苗的3D结构。然后，使用Ramachandran图和Z分数来评估I-TASSER预测的结构的有效性。主要基于Z分数，选择了最佳预测模型（-0.92）。疫苗3D模型的Ramachandran图分析显示，85.8%的残基位于最优选区域，11.5%位于允许区域，2.7%位于异常区域，表明整体模型质量良好。

**图5. MEV的二级结构分析**
使用SOPMA检查了MEV的二级结构。疫苗的氨基酸序列影响了SOPMA的预测。根据SOPMA数据，147个氨基酸形成α-螺旋，56个氨基酸形成β-链，66个氨基酸形成coil。最后，使用SOLpro工具量化了MEV在大肠杆菌中的溶解度，结果显示MEV具有很高的溶解度。

**图6. MEV与MHC（I & II）和TLR（2 & 4）受体的分子对接分析**
为了使多表位疫苗（MEV）能够引发强烈且持久的免疫反应，它必须有效地与关键的免疫细胞受体相互作用，包括主要组织相容性复合体（MHC）分子和Toll样受体（TLRs）。使用HADDOCK v.2.2服务器进行了蛋白质-蛋白质对接分析，以评估MEV构建物与MHC I和II分子以及TLR2和TLR4受体的结合亲和力和结构兼容性。结果总结了表5中显示的分子相互作用，这些相互作用支持疫苗激发先天性和适应性免疫反应的潜力。

**图7. 免疫模拟**
扩展的计算机模拟时间跨度为200天，证实了疫苗能够诱导并维持长期的免疫记忆。在初始的初级反应期间，抗原水平迅速升高，在前15天内被有效中和，同时IgM和IgG滴度急剧上升。与较短的模拟不同，这个200天的窗口清楚地表明，尽管抗原被完全清除，总抗体水平（IgM + IgG）并未归零，而是建立了一个持续的平台。这种同型转换和IgG1及IgG2亚类的显著维持反映了高亲和力的体液反应和记忆B细胞群体的成功建立。此外，图8B突出了一个强烈的细胞信号网络，其特征是IFN-γ和IL-2的巨大峰值，表明Th1导向的免疫反应对于细胞介导的保护至关重要。

**图8. 克隆和密码子优化**
为了确保疫苗蛋白在大肠杆菌表达系统中的有效翻译，进行了密码子优化和计算机克隆。疫苗基因的密码子被调整以匹配目标宿主大肠杆菌K12的首选密码子使用，以最大化表达效率。优化后的DNA序列显示出0.98的密码子适应指数（CAI）和49.2%的GC含量，表明其与宿主有很强的兼容性；CAI值接近1.0被认为是高效蛋白质表达的最佳值。优化后，疫苗基因被克隆到pET-30a(+)表达载体中，两侧分别带有NcoI和XhoI限制位点，以便于正确的插入和表达（图9）。所得重组分子的长度为480个碱基对，确保全长疫苗蛋白可以高效地在大肠杆菌中表达，用于后续的结构和功能研究。

Waddlia chondrophila是一种新兴的细胞内细菌病原体，目前尚无有效的疫苗来预防女性感染[66]。衣原体感染的无症状特性及其严重的长期后果（如妊娠并发症、早产和不孕）凸显了开发针对这些病原体疫苗的迫切需求[67]。该菌最初是从流产的牛胎儿中分离出来的，后来大规模临床研究显示它与孕妇的流产有关。此外，最近的证据表明这种细菌也可能影响男性生育能力。本研究探讨了W. chondrophila对人类精子的侵袭作用。

W. chondrophila WSU 86-1044株的基因组由一条2.1 Mb的环状染色体和一条15.6 Kb的质粒组成，其G/C含量分别为43.8%和37.6%[68]。尽管有有效的抗菌治疗方法，但过去十年W. chondrophila感染的发病率显著增加，这强调了需要替代预防策略[69]。由W. chondrophila引起的感染常常与生殖并发症相关——这突显了开发疫苗作为预防措施的重要性。尽管已投入大量精力开发针对相关物种（如Chlamydia trachomatis）的疫苗，但至今尚未成功研制出有效的疫苗[70]。因此，开发能够预防和控制严重感染的W. chondrophila疫苗至关重要[71]。

开发活减毒或灭活疫苗是一个复杂、昂贵且耗时的过程，常常受到生物安全、大规模生产和免疫效价有限等问题的阻碍[72]。传统的疫苗方法可能无法引发强烈且持久的免疫力，并且偶尔会带来不良反应，包括恢复毒力或不希望的免疫反应。这些限制促使人们转向现代计算方法，将免疫信息学、分子生物学和结构疫苗学结合起来设计更安全、更具针对性的疫苗。其中，基于表位的疫苗设计已成为对抗Waddlia chondrophila等病原体的有希望且高效的选择[73]。

为了识别和表征W. chondrophila核心蛋白质组中的潜在抗原肽，采用了一种综合计算流程，结合了差异蛋白质组学、反向疫苗学和分子对接技术。差异蛋白质组学策略根据毒力、抗原性、与宿主蛋白质的非同源性以及非致敏性等关键标准筛选蛋白质组，以确保选择出最佳的疫苗候选者。另一个关键筛选标准是排除含有多个跨膜螺旋的蛋白质，因为具有多个跨膜结构域的蛋白质通常难以纯化和实验表达[74]。在基于表位的疫苗开发中，安全性问题至关重要，因为不当选择的肽可能导致过敏反应、毒性或免疫耐受。因此，独立于抗原性预测进行了致敏性和毒性的测定，以确保方法的严谨性。最终选定的MEV构建体和单个表位被预测为无毒且无致敏性，这意味着其具有良好的安全性。此外，还通过筛选与人类蛋白质组的表位来分析免疫伪装，以防止引起免疫耐受或自身免疫反应的宿主样序列。任何有意义的同源性缺失表明所设计的疫苗构建体没有显著的免疫掩盖或与宿主蛋白质发生交叉反应的风险。这些发现与其他基于免疫信息学的疫苗设计研究一致，这些研究在实验验证前要求严格的安全性筛选。计算机预测可以作为初步的安全性数据，但还需要体外和体内研究来确定候选疫苗的免疫原性和安全性。使用TMHMM服务器的分析确认，入围的抗原蛋白均不含跨膜螺旋，表明它们可能是细胞外的，并且能够被抗原呈递细胞（APCs）识别。这一特性增强了其引发强烈B细胞和T细胞介导的免疫反应的潜力。

经过严格筛选后，确定了四种潜在的疫苗靶点：UDP-N-乙炔基吡 ruvoyl 葡萄糖胺还原酶、蛋白输出膜蛋白SecF、外膜蛋白组装因子YaeT和Fe–S组装蛋白SufB。随后使用VaxiJen v2.0服务器评估了这些蛋白质的抗原性[75]，结果显示外膜蛋白组装因子YaeT和UDP-N-乙炔基吡 ruvoyl 葡萄糖胺还原酶具有很强的抗原性。进一步的AllerTOP致敏性评估显示只有UDP-N-乙炔基吡 ruvoyl 葡萄糖胺还原酶是非致敏性的，因此它是最合适的疫苗候选者，适用于后续表位预测和设计。

为了确保广泛的免疫覆盖范围，从选定的蛋白质中详细预测并分析了B细胞和T细胞表位，因为协调激活体液和细胞介导的免疫反应对于实现有效的长期保护至关重要。群体覆盖分析显示，所选表位共同代表了大约94.87%的全球人口，表明它们在免疫应用方面的广泛适用性。这些发现强调了综合计算策略在加速疫苗设计和优先选择W. chondrophila有效抗原靶点方面的效用。本研究采用的免疫信息学设计策略与其他报告一致，这些报告表明多表位疫苗在诱导强烈免疫反应方面是有效的[76]。与先前的研究一样，我们的疫苗构建体具有抗原性，并显示出高亲和力，能够与免疫受体结合，这有利于其免疫原性。其他研究人员也记录了疫苗构建体与先天免疫受体（如TLR-4和MHC分子）之间的稳定相互作用[77]。我们的对接和200 n分子动力学模拟结果也支持这些发现，显示出稳定的和持久的结合构象，因此这些结果与其他计算结果相关。C-ImmSim免疫模拟研究表明，多表位疫苗有潜力引发强烈的体液和细胞免疫反应[78]。根据这些发现，我们观察到了高水平的抗体滴度、记忆B细胞和T细胞以及细胞因子的产生，但要确认长期免疫记忆的生成仍需通过实验验证。

MEV构建体的溶解度、稳定性和整体物理化学性质经过了严格评估。其溶解度表明其在宿主细胞内的有效表达和可及性，而脂肪族指数和GRAVY得分分别反映了热稳定性和亲水性。理论等电点（pI）证实了该构建体的碱性特征，计算出的不稳定性指数支持其预期的表达后持久性，表明其适用于实验和治疗应用。疫苗的三维结构揭示了表位和佐剂的空间排列，有助于理解蛋白质行为、功能和潜在的蛋白质-蛋白质相互作用[79]。疫苗结构的进一步优化进一步改善了其性质，B细胞表位谱也确认了足够的抗原位点以供抗体识别。为了在大肠杆菌K12中实现高表达，进行了密码子优化，以确保下游研究的高产量[80,81]。

有效的疫苗递送需要与免疫受体有强烈的相互作用。分子对接研究表明，MEV构建体与MHC-I、MHC-II和TLR4受体形成了多个氢键，且能量损耗最小。这些相互作用对于启动初级免疫反应至关重要，从而促进保护性体液和细胞免疫的发展[82,83]。免疫模拟表明，疫苗在受体结合过程中保持结构稳定，支持其潜在的效力。当通过鼻内或舌下给药时，这种多表位疫苗可能触发黏膜免疫，阻止病原体进入并激活全身和局部的防御性T细胞和B细胞。这些发现表明MEV是一种对抗细菌感染的有希望的策略。然而，由于本研究基于综合计算流程，还需要进一步的体外和体内研究来实验验证疫苗的安全性、免疫原性和保护效果。

尽管本研究的结果很有前景，但仍存在一些局限性。首先，所有分析均使用了计算和免疫信息学工具，因此预测的抗原性、免疫原性和安全性需要在体外和体内进行验证。其次，用于模拟对树突毒素免疫反应的计算机建模框架并未完全反映宿主免疫反应的复杂性和长期免疫记忆的发展及宿主遗传变异。第三，分子对接和分子动力学模拟仅理论化了疫苗与受体在细胞环境中的相互作用、翻译后修饰和生理条件，而这些因素并未考虑。此外，用于预测表位的群体覆盖率和预测算法基于参考数据库和预测算法，可能会产生偏差。因此，需要更多的实验和临床研究来确认所提出的多表位疫苗构建体的有效性和安全性。

研究人员正在努力寻找新的靶点以帮助开发抗菌药物，因为抗生素耐药性正在蔓延。本研究在W. chondrophila中发现了两个新的靶点。本研究专注于设计针对特定代谢途径的治疗方法，因为这些方法在其他细菌中已被证明是成功的。研究人员可以利用计算机技术快速高效地开发新疫苗。通过这种研究，使用了多种工具构建了一个包含CTL、HTL和LBL的MEV，这些成分能够引发强烈的免疫反应。通过对接研究和免疫模拟，我们确认了MEV的稳定性。计算机表达也证实了MEV存在于宿主细菌中。因此，我们认为所提出的疫苗设计适合进一步测试，以确定其对W. chondrophila感染的生物有效性。

作者贡献：概念构思 - BHA和RB；数据管理 - HNBA和AMES；形式分析 - BHA、RB和AMES；实验设计 - BHA、HNBA和RB；项目管理 - BHA和RB；软件使用 - BHA和RB；监督 - AMES；验证 - HNBA和RB；初稿撰写 - BHA；审稿与编辑 - RB和AMES。所有作者均已阅读并同意发表的手稿版本。

未引用的参考文献[30]