《Talanta》：Low-cost microbioreactor based on 3D-printing and Arduino. Enzymatic monitoring of the water kefir fermentation using digital imaging analysis
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Nicolás A. Nario | Santiago Bernardini | Sophie F?ttinger | Marilina Lang | Sebastián A. Costa | Claudia E. Domini | Marcos Grünhut
INQUISUR
Nicolás A. Nario | Santiago Bernardini | Sophie F?ttinger | Marilina Lang | Sebastián A. Costa | Claudia E. Domini | Marcos Grünhut
INQUISUR（UNS-CONICET），化学系，阿根廷南部国立大学，Alem街1253号，B8000CPB，巴伊亚布兰卡
摘要
优化水基开菲尔的生产过程对于确保最终产品的可重复性、微生物稳定性和感官品质至关重要。此外，监测发酵过程中产生的化合物有助于控制细菌和酵母之间的代谢平衡，并标准化物理化学和功能性特征，特别是在扩大生产规模或产品开发时。在本研究中，结合了3D打印、Arduino电子设备和数字图像分析等当前可用技术，开发了一种便携式微生物反应器（重3.61公斤），用于优化水基开菲尔的生产，并开发基于酶的分析方法来定量该类型样品中的代谢物。该微生物反应器由易于组装的部件构成，这些部件采用PLA打印而成，包含四个由耐灭菌材料（玻璃、PTFE和不锈钢）制成的生物反应器。每个生物反应器中的温度和搅拌速度均通过Arduino电子设备独立控制。发酵过程（32小时）在不同温度（23-43°C）下进行，并通过数字图像分析进行监测，同时轻轻搅拌（40转/分钟；每5分钟10秒），使用的设备包括3D打印部件、智能手机、LED照明系统以及32孔聚苯乙烯微孔板（每孔300微升），从而能够同时对多个样品（共32个样品）进行分析。获得的浓度曲线符合预期，且所提出的方法与紫外-可见光谱法之间没有统计学上的显著差异（p = 0.05）。此外，该方法的环保性能表现出色（绿色指数为0.82），有助于开发符合绿色分析化学原则的可持续方法。
引言
近年来，水基开菲尔因其作为益生菌和生物活性化合物来源的潜力而受到越来越多的关注，这使其成为一种有前景的功能性食品。此外，由于其非乳制品特性，它适合乳糖不耐受者和素食者，从而扩大了其在功能性饮料市场中的应用范围。当前的研究工作主要集中在对其进行微生物多样性、健康促进作用及其技术方面的研究，以支持其发展和工业化生产[1]。
水基开菲尔是通过将开菲尔颗粒接种到含有干果和蔗糖的水溶液中获得的[2]。发酵过程通常在室温下厌氧条件下进行2至4天。发酵完成后，将液体部分与颗粒分离，得到所谓的水基开菲尔。这种饮料具有独特的物理化学特性，包括轻微的甜味、酸味、酒精味和气泡感，以及黄色调和果香。开菲尔颗粒是由多种微生物组成的复杂共生体，主要包括葡聚糖外多糖，它们形成透明、易碎且不溶于水的结构[3]。此外，这些颗粒还包含乳酸菌和酵母等微生物[4]。蔗糖是这些微生物的主要底物，经过代谢后会生成葡聚糖外多糖、甘油、乙醇、二氧化碳、乳酸、乙酸、甘露醇以及多种芳香化合物[5]。温度、发酵时间、搅拌方式和氧气浓度等因素都会影响发酵动态。这些变化可以通过监测底物（如葡萄糖）的消耗量或代谢物（如甘油、乳酸和乙醇）的形成来检测。通常使用色谱技术（如GC和HPLC）来定量这些化学物质[6]。然而，这些技术成本较高且实施难度大，特别是在生产设施和小型食品检测实验室中。此外，它们往往需要使用有机溶剂并产生废弃物，因此对环境不利。而且，使用这些方法获取实时发酵信息较为困难，主要是因为分析时间较长。
随着电子技术和3D打印的进步，化学过程的自动化程度得到了显著提升。Arduino[7]使得能够构建用于感知和控制各种对象（包括仪器和设备）的数字交互式设备。Arduino的主要优点是使用简便、组件成本低廉，且硬件和软件均为开源。Arduino板可以作为预组装单元或套件形式购买，支持多种微控制器和微处理器，通过USB供电，并可通过串行端口进行编程。这使得系统内不同组件的协调、简单和高效控制成为可能。另一方面，3D打印技术能够以高精度和细节水平设计各种组件，特别适合用于构建反应器、连接器、支架和其他自动化系统所需设备，有助于实现小型化和降低成本[8],[9]。
此外，在开发分析方法时，采用简单的样品处理和检测技术非常重要，这些技术应依赖于分析实验室中常见的仪器。酶是具有催化活性的蛋白质，在分析方法开发中非常有价值，因为它们对有限数量的底物具有高度选择性，在参与化学反应后保持不变，并且在低浓度下仍能有效发挥作用。此外，与非酶反应相比，酶可以使反应速率提高103至1011倍[10]。这些特性大大简化了样品预处理步骤，避免了色谱技术的需求。在许多情况下，反应产物带有颜色，可以通过基于智能手机的比色传感技术进行检测和定量。这种方法是一种有前景的替代方案，因为它完全可行且用户友好[11]。在许多情况下，可以根据红色、绿色和蓝色（RGB）通道的强度获得分析信号，从而间接反映分析物的浓度，而无需依赖传统仪器的吸光度信号[12]。
用于发酵研究的商业实验室设备往往复杂且昂贵，对于小型制造商来说成本过高。目前缺乏简单、廉价且可靠的中间设备。3D打印、基于Arduino的电子设备和数字图像分析的结合为实验室设备开发提供了一个高效的技术平台，同时体现了作者在先前研究中强调的可持续性[13],[14]。3D打印技术可以快速且低成本地制造出具有复杂几何形状的部件，减少材料浪费，并允许使用可回收或生物基聚合物，以及选择性更换组件。Arduino平台能够精确可编程地控制温度和搅拌等关键参数，通过高效的操作策略优化能源消耗。同时，数字图像分析能够实现化学参数的非侵入式实时定量，减少试剂和一次性用品的使用，降低废液产生。总体而言，这种技术融合有望带来模块化、可扩展、低成本的系统，具有较小的环境足迹，符合循环经济原则，适用于动态发酵研究。
在本研究中，使用3D打印和Arduino电子设备开发了一种实验室制造的微生物反应器，以优化开菲尔发酵过程中的相关参数。此外，通过结合酶法和数字图像分析来监测发酵动态，符合绿色分析化学的多个原则。
节选内容
试剂和溶液
所有试剂均为分析级化学品。使用超纯水（18 MΩ cm-1）。
通过将45.0克蔗糖（Wellness，阿根廷）溶解在矿泉水（Glaciar?，阿根廷）中，直至体积达到1000毫升，制备了4.5%的糖溶液。通过磁力搅拌和35°C加热确保糖完全溶解。
使用了Wiener lab.（阿根廷）提供的商业试剂盒来检测人血液中的葡萄糖、甘油三酯和乳酸。
微生物反应器
视频S1展示了实验室中开发的基于3D打印和Arduino电子设备的微生物反应器。该系统允许独立控制每个生物反应器中的发酵温度和搅拌条件，这对进行多组实验非常有用，显著减少了工作量和时间。在我们的案例中，大多数发酵过程持续超过30小时。
结论
本研究提供了一个易于使用且可持续的实验平台模型，用于研究、控制和优化水基开菲尔，具有在日益增长的消费市场中开发和标准化这种食品的潜力。3D打印和Arduino电子技术的结合产生了模块化、经济实用、便携且多功能的设备，扩展了研究和小型食品生产或创业项目中的控制工具应用。该系统使得
CRediT作者贡献声明
Nicolás A. Nario：撰写——原始草稿、方法论、研究。Santiago Bernardini：方法论、研究。Sophie F?ttinger：方法论、研究。Marilina Lang：方法论、研究。Sebastián Costa：研究。Claudia Domini：撰写——原始草稿、概念设计。Marcos Grünhut：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、监督、项目管理、方法论、研究、资金获取、概念设计
利益冲突声明
? 作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
感谢南部国立大学（UNS；PGI-UNS /Q117）和阿根廷国家科学技术研究委员会（CONICET；PIP-CONICET 11220200102603）的财政支持。
