非酶促拉曼传感与成像技术：直接从完整的微生物培养物中检测乳酸，并实现对其质子化状态的精确解析

《Talanta》：Non-enzymatic Raman Sensing and Imaging of Lactic Acid Directly from Intact Microbial Cultures with Protonation-State Resolution

　　

Mahamkali Sri Phaneeswar|Jiro Karlo|Katyayani Achyut Bhise|Sujal Sahu|Surya Pratap Singh

印度理工学院达尔瓦德分校生物科学与生物工程系，卡纳塔克邦达尔瓦德 – 580011

摘要

乳酸是重要的微生物代谢产物，在食品保存、化妆品、制药和聚合物工业等领域有广泛的应用。在复杂的微生物培养物中直接检测乳酸仍然是一个挑战。酶法测定和高效液相色谱是传统的检测乳酸的方法，但它们需要大量的样品制备工作。在这项研究中，我们报道了一种非酶法的拉曼传感技术，用于直接检测和绘制乳酸在微生物培养物中的分布图。我们使用Lactobacillus plantarum和Lactobacillus acidophilus作为代表性的产乳酸微生物，并在它们的培养上清液中检测到了乳酸的特征拉曼信号。该方法的另一个优点是能够在不同培养pH条件下检测到乳酸的质子化形式和去质子化形式。拉曼成像还可以直接在微生物培养物上进行，从而能够可视化乳酸的空间分布。拉曼图像显示乳酸在未处理的培养基质中呈扩散分布，这与活跃生长细胞的代谢分泌行为一致。这项工作突显了拉曼光谱在非酶法、无创且信号处理最少的乳酸检测平台中的分析效用，具有未来集成到生物反应器在线监测系统中的潜力。

引言

微生物发酵已成为可持续生物制造的基础，能够生产高价值的有机酸。乳酸是从微生物中获得的最有前景的生物产品之一，在食品加工、临床诊断和工业生物技术中具有重要作用。在食品和饮料工业中，乳酸及其盐类被用作防腐剂、pH调节剂和风味增强剂等。其他形式，如聚乳酸和乳酸乙酯，是具有生物降解性和生物相容性的成熟可持续聚合物，用于包装材料和制药领域[1]、[2]、[3]、[4]。美国食品药品监督管理局已将乳酸批准为GRAS（通常认为安全）[5]。乳酸可以通过细菌、真菌和蓝细菌产生；其中，Lactobacillus属的细菌被广泛用于乳酸生产，这些细菌被称为乳酸菌（LAB），已知可以在安全工业规模下生产乳酸[4]、[5]、[6]、[7]、[8]。在这项研究中，我们使用了已知的乳酸菌Lactobacillus plantarum和Lactobacillus acidophilus，以及野生型E. coli作为对照，在相同的生长条件下进行实验。然而，也有报道称工程化的E. coli菌株能够产生乳酸[5]、[9]。

传统的乳酸检测方法主要依赖于酶法或色谱技术，如高效液相色谱（HPLC）[10]、[11]。酶法乳酸测定因其灵敏性和简便性而被广泛采用，但需要多种试剂和受控制的反应条件以及孵育时间。HPLC是一种众所周知的乳酸分析技术，由于其高灵敏度而受到青睐；然而，基于HPLC的方法需要大量的样品制备工作。这促使人们寻找替代方法，以便无需大量样品制备即可直接从复杂的微生物培养物中检测乳酸，并保持无标记、无试剂的化学特异性。此外，减少试剂消耗和化学废物的产生对于可持续性非常重要，特别是在常规监测应用中。拉曼光谱在这方面具有明显优势，因为它能够基于生物分子的固有振动指纹进行原位检测，并提供空间信息[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]。拉曼仪器、数据处理和成像技术的进步使其应用范围超越了光谱分析，扩展到了空间分辨的化学映射。

尽管拉曼光谱具有无创、无标记的优势，但大多数基于拉曼的微生物代谢产物检测方法仍依赖于表面增强策略、稳定同位素探测、先进的化学计量信号处理或人工智能/机器学习算法。据我们所知，此前还没有研究使用拉曼光谱从乳酸菌培养基中检测和绘制乳酸的分布图。Gilioli等人证明了便携式拉曼光谱结合PLS回归可以实现乳酸的快速、实时和准确定量，为葡萄酒厂监测提供了实用的替代方法[21]。Wang等人开发了一种基于光纤的SERS传感器，能够高灵敏度、无标记且无创地检测人体汗液中的乳酸，从而实现生理变化的实时定性和定量监测[22]。Hsu等人表明，银纳米粒子增强的拉曼光谱可以在血液中快速敏感地检测到生理水平的乳酸，使得基于拉曼的分析适用于临床诊断[23]。在实际的微生物培养研究中，这些要求使得频繁或连续监测变得困难。

在这项研究中，我们展示了一种无试剂、信号处理最少的拉曼光谱方法，用于直接检测和可视化过滤后的上清液以及直接培养物中的乳酸。首先使用Lactobacillus plantarum和Lactobacillus acidophilus作为产乳酸的模型微生物，以及野生型Escherichia coli作为对照，通过酶法测定建立了乳酸的产生谱型。然后我们展示了乳酸及其质子化和去质子化形式的无标记拉曼检测，发现pH值的变化会影响拉曼峰位的变化。接着，利用拉曼光谱直接从培养上清液中识别乳酸的特征振动特征，然后通过拉曼成像在未经过离心或过滤的微生物培养物中可视化乳酸的分布。通过结合乳酸的光谱选择性和空间映射，这项工作确立了拉曼光谱作为一种无试剂、无创的传感平台，用于直接监测复杂生物基质中的微生物代谢产物。该研究的发现为将来将基于拉曼的光谱技术集成到生物反应器系统中进行连续、无试剂的乳酸监测奠定了基础。

章节摘要

微生物培养条件与动力学

Lactobacillus plantarum、Lactobacillus acidophilus和Escherichia coli在含有24 g/L D(-)-葡萄糖、8.0 g/L牛肉提取物、5.0 g/L酵母提取物、2.0 g/L磷酸二氢钾、1.0 g/L吐温80、2.0 g/L硫酸铵、3.0 g/L醋酸钠、0.1 g/L硫酸镁、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl、0.05 g/L硫酸锰的培养基中培养；培养在180 rpm的转速下进行持续搅拌。微生物生长情况如下：

首先评估了产乳酸菌L. plantarum和L. acidophilus以及作为对照的Escherichia coli的生长动力学。在选定的培养条件下评估了两者的生长情况（图S1A和1B）。对于L. plantarum和L. acidophilus，在最初的几个小时内OD₆₀₀值较低，表明存在延长的迟滞期。在6小时到24小时之间观察到指数生长阶段，随后进入稳态生长阶段

结论

本研究证明，拉曼光谱可以作为补充方法，用于直接检测和可视化复杂微生物培养物中的乳酸，无需进行酶法测定或提取。通过对两种产乳酸细菌的培养上清液进行直接测量，发现乳酸和乳酸盐（无论是质子化还是去质子化状态）都可以通过其特征拉曼峰来识别。将这些测量扩展到完整的培养物中，拉曼光谱技术

Sujal Sahu： 数据整理。Surya Pratap Singh： 写作 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理和资金获取。Mahamkali Sri Phaneeswar： 写作 – 初稿撰写、方法论设计、数据分析、概念阐述。Jiro Karlo： 写作 – 审稿与编辑、初稿撰写、软件开发、方法论设计、数据分析、概念阐述。Katyayani Achyut Bhise： 数据整理

作者声明没有竞争性财务利益。

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