TaqMan实时PCR检测方法在检测对虾中的Enterocytozoon hepatopenaei（EHP）菌株中的应用开发与比较评估

《Scientific Reports》：Development and comparative evaluation of TaqMan real-time PCR assays for detecting Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) in penaeid shrimp

　　

摘要

Enterocytozoon hepatopenaei（EHP）是一种微孢子虫，会抑制虾的生长并对全球水产养殖业构成威胁，因此可靠且灵敏的检测方法对于其监测和控制至关重要。本文比较了六种基于TaqMan实时PCR技术的检测方法，这些方法针对EHP的不同基因位点：其中三种方法已发表（SSU rDNA、β-微管蛋白和半胱氨酸脱硫酶/NFS1），两种为Aquaculture Pathology Laboratory内部开发的未发表方法（DNA聚合酶和ATP/ADP转位酶），以及一种新设计的孢子壁蛋白（SWP）检测方法。检测方法的开发和验证遵循了世界动物卫生组织（WOAH）的框架，通过使用特定的质粒DNA标准来评估分析特异性、分析灵敏度/检测限（LOD）、重复性和再现性。所有方法均对EHP具有特异性，未与其他引起肠道疾病的甲壳类动物病原体（如NHP、AHPND、TPD）或系统感染病原体（如IHHNV、WSSV）发生交叉反应，也未与甲壳类微孢子虫Perezia属或新型核内Enterocytozoon属发生交叉反应。唯一的例外是SSU rDNA检测方法，该方法也会扩增新型核内Enterocytozoon属。所有方法的检测限均达到10个拷贝/μL。重复性表现良好（%CV < 1.65%），再现性也不错（%CV < 5.70%）；然而，在重复性测试中，β-微管蛋白和ATP/ADP转位酶检测方法的qPCR效率低于90–110%的范围，在再现性测试中，β-微管蛋白、NFS1和ATP/ADP转位酶检测方法的qPCR效率也较低，且这三项方法的线性度偶尔也会下降（R2 < 0.99）。通过对感染程度不同的实验虾样本进行检测，所有方法的诊断特异性均为100%（95%置信区间69.15–100）。β-微管蛋白（90.00%；95%置信区间73.47–97.89）和ATP/ADP转位酶（80.00%；95%置信区间61.43–92.29）检测方法的诊断灵敏度较低，而SSU rDNA、NFS1、DNA聚合酶和SWP检测方法的灵敏度均为100%（95%置信区间88.43–100）。SSU rDNA和SWP检测方法在低感染水平下具有最高的灵敏度，但SSU rDNA可能会与相关微孢子虫发生交叉反应。通过针对EHP特有的基因区域，SWP检测方法目前提供了更高的特异性，有助于加强EHP的监测，从而减缓其全球传播速度——因为根据WOAH的分类，EHP被列为一种新兴病原体。