硝化还原杆菌（Bacillus nitroreductase）的克隆、纯化及其在生物技术应用中的潜在用途

《Scientific Reports》：Cloning, purification and possible use of a Bacillus nitroreductase in biotechnological applications

　　

摘要

硝基还原酶（NRs）能够将具有毒性、致突变性或致癌性的硝基芳香化合物还原为亚硝酸盐、氨基或羟胺基团。我们利用从一种中温嗜热细菌Bacillus中克隆得到的硝基还原酶，在E. coli BL21菌株中进行了表达。通过纯化该酶并采用电泳和Western blotting技术，测得其分子量约为30 kDa。该酶的最佳作用温度为40°C，最佳pH值为8.0。我们研究了该酶在NADPH作为辅因子存在下对CB1954的代谢产物转化能力以及对硝呋唑的还原作用。以CB1954为底物、NADPH为辅因子时，测得的Km、kcat和kcat/Km值分别为42.5（μM）、5.07（s^?1）和0.1194（s^?1μM^?1）；而以硝呋唑为底物时，这些值分别为52.7（μM）、0.626（s^?1）和0.0119（s^?1μM^?1）。利用LC–ESI–MS技术分析该酶对CB1954的还原过程，发现产生了预期的分子离子：CB1954的[M?+?H]?离子（m/z = 253）、一级羟胺中间体（m/z = 239）以及氨基终产物（m/z = 223）。此外，纯化的酶还能将TNT转化为2-氨基-4,6-DNT。基于固定化硝基还原酶的电化学检测平台能够对硝呋唑产生可测量的阴极响应，证明了该酶的电化学应用潜力。方差分析（ANOVA）显示不同组间的活性存在显著差异，而回归分析则有助于预测酶的反应行为并揭示其动力学特性。