利用荧光重组酶聚合酶扩增（RPA）技术开发并现场评估了一种快速检测微小巴贝斯虫（Babesia microti）的方法

《Scientific Reports》：Development and field evaluation of a rapid detection method for Babesia microti using fluorescent recombinase polymerase amplification(RPA) technology

　　摘要
巴贝西虫微小种（Babesia microti）感染的频繁发生已成为一个重要的全球公共卫生安全问题。患者的诊断是预防和控制巴贝西虫病的关键环节，因此迫切需要建立高效准确的分子生物学检测方法来检测B. microti。本研究旨在开发一种灵敏、特异且快速的荧光重组酶聚合酶扩增（RPA）技术，用于检测B. microti，并评估其适用于现场使用的可行性。本研究开发并优化了一种针对B. microti 18 S rRNA基因片段的荧光RPA检测方法，评估了该方法的灵敏度（检测限低至10 fg/μL基因组DNA）、特异性（能够区分疟原虫样本）以及在不同寄生虫血症水平下的检测能力。通过感染小鼠模型（感染后3-21天采集的尾尖血液）和两个确诊的人类病例样本验证了该方法的检测能力。此外，使用嵌套PCR和新开发的荧光RPA检测方法对119份伴有血小板减少的发热患者血液样本进行了检测。通过Kappa值分析了两种方法之间的一致性，并使用McNemar检验评估了它们之间的差异显著性。最终选择了一种针对两个B. microti 18 S rRNA片段（243 bp/191 bp）的荧光RPA检测方法，其中191 bp片段表现出更高的灵敏度（检测限为1 fg/μL基因组DNA）。该方法在39°C下孵育20分钟后，其检测阈值被定义为最低可检测浓度（1 fg/μL）。使用8个恶性疟原虫（P. falciparum）和8个卵形疟原虫（P. ovale）样本进行特异性测试，结果显示这些样本的荧光强度低于该阈值。该方法的检测限为0.046个寄生虫/μL血液，与嵌套PCR相比灵敏度提高了600倍（嵌套PCR的检测限为28.49个寄生虫/μL）。在感染小鼠中，RPA和嵌套PCR均在感染后第9天检测到寄生虫（显微镜检查结果为第15天），其中RPA的阳性率更高。该方法在2名患者中确认了感染。在河南省信阳市的119名发热伴血小板减少患者中，嵌套PCR检测出20例B. microti阳性病例，而荧光RPA检测出21例。两种方法之间的一致性Kappa值为97.05%（91.31%至100%），McNemar检验表明它们的检测率无统计学差异（S = 1，P > 0.1）。综合两种检测结果，该样本集中B. microti的分子阳性率为17.65%，其中10.08%的样本同时感染了布尼亚病毒（Bunya virus）。荧光RPA方法提供了一种快速、灵敏且特异的工具，适用于B. microti的检测，适用于现场筛查。

引言
巴贝西虫病是一种由巴贝西虫（Babesia spp.）感染引起的寄生虫人畜共患病。巴贝西虫的最终宿主是多种蜱虫，而中间宿主主要是哺乳动物，包括牛、狗和羊。人类也可以作为中间宿主。在中间宿主体内，巴贝西虫感染红细胞，以滋养体和裂殖体形式存在。感染后的潜伏期通常较长，常超过一周，主要症状为发热和贫血。在中国，B. microti和Babesia venatorum是最常见的病原体，已报告数百例病例。大多数B. venatorum病例发生在东北部地区，而B. microti感染则主要出现在南部省份，如云南、广西和福建。对发热或蜱虫叮咬患者的分子筛查发现了超过100例阳性病例。尽管中国仅报告了约320例巴贝西虫感染病例，但优先考虑预防、控制和快速诊断至关重要。B. microti感染的早期症状（如发热和疲劳）容易与疟疾或其他发热性疾病混淆。高灵敏度的诊断测试可以在寄生虫血症较低阶段快速确认感染，从而避免可能导致严重并发症（如溶血性贫血、器官衰竭甚至死亡）的治疗延误。B. microti是一种人畜共患病原体。高灵敏度的检测技术（如荧光重组酶聚合酶扩增（RPA）能够准确识别无症状携带者和环境或储存动物宿主体内的低水平感染，为疫情预警提供关键数据。高灵敏度检测对于确保输血安全至关重要，因为无症状感染者的血液可能通过输血传播巴贝西虫病。美国食品药品监督管理局（FDA）要求对献血者进行核酸检测（NAT），要求检测灵敏度达到1–10个寄生虫/μL（约1 fg/μL DNA），以中断输血传播链。

巴贝西虫属的分子检测方法包括常规PCR、实时定量PCR（qPCR）、环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）。这些技术通过靶向特定基因（如18 S rRNA、线粒体基因或热休克蛋白基因）来扩增病原体核酸，确保高灵敏度和特异性。与传统PCR相比，RPA在20分钟内即可扩增核酸，无需热循环仪，非常适合现场或临床使用。虽然两种方法的灵敏度相当（均可检测到1个寄生虫），但RPA在低浓度样本中的稳定性更优。与LAMP相比，RPA具有更快的反应时间、简化的引物设计以及更低的温度要求（37–42°C），使其在资源有限的环境中更具应用性。RPA检测巴贝西虫属的主要优势包括能够诊断低寄生虫血症感染、快速诊断、通过便携式荧光检测器进行现场检测，以及利用多色探针设计同时检测多种物种（如B. microti和B. venatorum）。

本研究旨在建立一种灵敏、特异、高效且快速的荧光重组酶聚合酶扩增（RPA）检测方法，用于检测B. microti，并通过实验室评估和现场样本测试来评估其诊断价值。

**方法**
**样本收集**
标准B. microti Peabodymjr菌株（ATCC, RPA-99）从美国类型培养收集中心（Manassas, VA）购买，并按照先前描述的方法在BALB/c小鼠中连续传代维持。本研究中的所有动物实验均获得了寄生虫病预防与控制研究所动物中心和中国疾病预防控制中心（中国热带病研究中心）实验动物福利与伦理委员会的批准（动物伦理批准号：IPD-2019-14）。感染恶性疟原虫（P. falciparum）和卵形疟原虫（P. ovale）患者的血液样本由同一机构收集和保存。健康捐赠者的血液样本由上海市健康检查中心提供，而B. microti感染患者的样本由浙江省疾病预防控制中心提供。发热伴血小板减少患者的样本由河南省疾病预防控制中心收集并提供。

**伦理声明**
动物和人类血液收集研究得到了中国热带病研究中心实验室动物福利与伦理委员会（LAWEC，许可号：IPD-2019-14）和中国疾病预防控制中心国家寄生虫病研究所医学伦理委员会（中国热带病研究中心，伦理批准号2019004）的审查和批准。所有操作均遵循相关指南和法规，所有受试者及其法定监护人均签署了知情同意书。

**荧光RPA方法的建立**
**设计用于B. microti检测的RPA引物**
设计了针对B. microti 18S rRNA区域的RPA引物。根据RPA引物设计原则，RPA引物通常比传统PCR引物更长，但长度一般控制在27–35 bp之间，以避免因过长导致的二聚体形成。此外，引物两端的CG碱基含量也应进行优化，特别是5’端的G碱基过度聚集应避免，而3’端的CG比例应增加以提高扩增效率。使用Primer Premier 6.0和DNAMAN软件以及手动设计，生成了六组引物（见补充表1）。

**设计用于B. microti荧光RPA检测的引物和探针**
基于RPA扩增结果，为表现较好的引物组2和7设计了荧光RPA的引物和探针。为了确定最佳的B. microti荧光RPA引物和探针，为每个选定的片段（组2和7）设计了两对引物（长度27–35 bp）和一个探针（在5’端修饰了四氢呋喃[THF]位点并标记了FAM荧光团），每组得到三对候选引物（例如2–1、2–2、2–3；7–1、7–2、7–3）。使用B. microti基因组DNA作为模板，在39°C下孵育40分钟进行筛选。通过比较反应过程中生成的荧光强度曲线来确定最佳引物和探针。选定的引物和探针序列见表1。

**DNA提取**
根据制造商说明，使用Qiagen公司的血液和组织核酸提取试剂盒从血液样本中提取DNA。提取的DNA用50 μL AE洗脱缓冲液洗脱后储存在-20°C。使用NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA）评估DNA浓度和纯度。

**建立荧光RPA反应系统**
按照TwistAmp exo Kits（T’wistDx, Cambridge, UK）协议，在50 μL反应体积中准备荧光RPA反应体系。反应混合物包含2.1 μL正向和反向引物（10 μmol/μL）、0.6 μL荧光探针（10 μmol/μL）、25 μL缓冲液和15.2 μL去离子水。轻轻混合并离心后，将溶液转移到冻干管中，分装到BIO-RAD八管条（TLS0851）中，并短暂离心去除气泡。随后向管盖中加入2 μL DNA模板和3 μL醋酸镁（280 mmol/L），再次离心。反应在39°C下孵育4分钟，反复倒置以混合均匀，然后短暂离心。使用CFX96荧光定量PCR仪器（Bio-Rad, USA）在39°C下进行40个循环（每个循环60秒，总计40分钟）。

**优化温度和时间参数及荧光RPA的灵敏度评估**
为了优化温度，使用B. microti基因组DNA作为模板，在不同温度（37℃、38℃、39℃、40℃、41℃和42℃）下进行核酸扩增，以确定最佳反应条件。通过将B. microti基因组DNA稀释至8种浓度（1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL、0.1 fg/μL）来评估灵敏度。荧光RPA反应最初设置为40分钟，观察后发现1 fg/μL组有明显的扩增现象，从而缩短了反应时间。后续测试在20分钟内进行，以评估该方法在此时间范围内的性能。使用相同的样本进行了平行嵌套PCR。使用提取的DNA作为模板，根据先前描述的协议，扩增18 S rRNA特异性片段。

**荧光RPA方法的实验室评估**
**评估荧光RPA方法的特异性**
使用8例恶性疟原虫感染患者和8例卵形疟原虫感染患者的血液样本进行荧光RPA反应，以评估方法的特异性。患者样本作为阳性对照，使用1 fg/μL的B. microti基因组DNA浓度作为阈值参考，健康个体的样本作为阴性对照。通过观察每个反应组的荧光强度来评估方法的特异性。

**确定荧光RPA的寄生虫密度最低检测限**
使用感染ATCC, RPA-99菌株B. microti的Balb/c小鼠。从感染小鼠的眶窦中采集血液（显微镜确认的寄生虫密度为4%），放入EDTA抗凝管中并充分混合。未感染小鼠的血液也采用相同方法抗凝。将20 μL B. microti感染血液与80 μL正常小鼠血液稀释5倍，得到初始寄生虫密度为445,200个寄生虫/μL。共制备了14个稀释组，最低寄生虫密度达到0.00037个寄生虫/μL。从每个稀释的血液样本中提取DNA。已建立的用于检测B. microti的荧光RPA方法被应用于样品分析，每个稀释后的血型样本使用了2 μL的模板DNA。正常小鼠的血液DNA作为阴性对照。为了评估荧光RPA方法在检测血液中B. microti DNA的性能，同时进行了嵌套PCR作为平行对照。通过观察琼脂糖凝胶电泳结果，确定了14种血型中B. microti DNA的最低检测限，然后将其与荧光RPA方法的检测限进行比较。

**在感染小鼠模型中检测B. microti**
使用低于嵌套PCR最低检测限的接种量对小鼠进行B. microti感染，以创建低感染率的动物模型。在感染后第3天、第6天、第9天、第12天、第15天、第18天和第21天采集小鼠尾尖的血液样本。制备薄血涂片，并用Giemsa染色。计算每1000个红细胞中的感染细胞数量。然后根据既定协议使用相同的方法计算感染率。每组观察三个载玻片，并提取DNA以进行后续检测。持续进行嵌套PCR和荧光RPA检测，直到所有小鼠检测结果均为阳性。通过记录通过嵌套PCR、荧光RPA和显微镜检测首次获得阳性结果的时间来确定检测率。同时记录每种方法在每个时间点检测到的阳性小鼠数量。

**使用荧光RPA方法在临床患者中检测B. microti**
为了评估已建立的荧光RPA方法对确诊的B. microti感染的诊断准确性，分析了浙江省两名显微镜检测呈阳性的患者的血液样本。首先使用属特异性引物BJ1（5’-GTCTTGTAATTGGAATGATGG-3’）和BN2（5’-TAGTTTATGGTTAGGACTACG-3’）进行 touchdown PCR分子检测。50 μL的反应混合物包含25 μL的PCR混合液（2× Taq PCR MasterMix（北京天根生物技术有限公司））、22 μL的去离子水、各1 μL的正向和反向引物（10 μmol/μL）以及1 μL的DNA模板。热循环条件包括：初始变性96°C 6分钟，随后是8个循环，每个循环分别为95°C 30秒、58°C 45秒和70°C 1分钟（每次循环退火温度降低1°C），然后是27个循环，每个循环分别为95°C 30秒、50°C 45秒和70°C 1分钟，最后在70°C下延伸8分钟。对Babesia属扩增呈阳性的样本进行测序并通过BLAST分析验证。随后应用嵌套PCR和荧光RPA方法检测B. microti。对照组包括B. microti基因组DNA（阳性对照）、健康人血液（阴性对照）和去离子水（空白对照），以确保检测的特异性和可靠性。

**荧光RPA的现场应用**
基于2012年河南省新乡市报告的病例，有患者出现发热和血小板减少症，并且同时感染了Babesia寄生虫。本研究使用荧光RPA方法检测了2015年河南省疾病预防控制中心收集的119名发热和血小板减少症患者的血液样本。对照组包括B. microti基因组DNA（阳性对照）、健康人血液（阴性对照）以及检测阈值浓度（1 fg/μL），以评估其在现场应用中的有效性。

**数据分析**
数据分析使用SAS 9.4软件进行。比较了荧光RPA和嵌套PCR的检测率及Kappa值，并使用McNemar检验来确定两种方法之间的显著差异。为了提高检测灵敏度，采用联合检测方法来确定样本中的B. microti感染情况。如果任一方法产生阳性结果，则将该样本分类为B. microti阳性。然后将这一结果与之前调查的Bunyavirus感染状态进行交叉参考，以评估这两种病原体之间的共感染模式。

**荧光RPA方法的建立**
**RPA引物的筛选**
在本研究中，从B. microti的18S rRNA基因中筛选目标序列。BLAST分析确定了7个具有高种间特异性的序列组。为片段筛选构建了PCR引物。如补充图1A所示，除了针对18S rRNA的第五组引物外，其他引物组均产生了一条明显的条带。为第六、七组引物设计了RPA扩增引物，这些引物产生了良好的PCR结果。扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，如补充图1B所示。第二和第七组引物产生了清晰、明显的条带。

**RPA荧光引物和探针的优化**
基于RPA引物设计原则，为基本RPA筛选中阳性扩增的每个片段（第2、7组）创建了两对引物。对每个片段组进行了引物优化测试。荧光RPA结果（补充图2）显示，第2片段的引物均未产生有效的荧光曲线。在第三组引物中，第一对引物（7-1-F/7-1-R）产生了最高的荧光强度和最早的峰值时间，因此被选为该片段的最佳引物。

**荧光RPA温度优化**
为了优化反应温度，使用第七组序列在六个不同温度下扩增B. microti基因组DNA：37°C、38°C、39°C、40°C、41°C和42°C。结果（补充图3）表明39°C是第七组序列的最佳温度，因为在该温度下产生了最高的荧光强度。因此，39°C被选为后续实验的理想反应温度。

**荧光RPA灵敏度实验**
为了确定荧光RPA的最低检测限和最佳时间，使用系列稀释的B. microti基因组DNA进行了反应。40分钟反应的结果（图1A）显示，该方法可以在低至1 fg/μL的浓度下检测到基因组DNA，并且在20分钟内观察到明显的扩增。随后在固定20分钟反应时间的灵敏度测试确认了1 fg/μL的检测限（图1C）。同时进行的嵌套PCR在同一稀释系列中的最低可检测浓度为10 fg/μL（图1D），但在更低浓度下未观察到条带。

**荧光RPA和嵌套PCR方法的灵敏度检测**
(A) 曲线1–8分别代表在去离子水中稀释的B. microti基因组DNA（浓度为1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL和0.1 fg/μL）的扩增谱型，引物和荧光探针基于第七组的18S rRNA序列设计。曲线9代表阴性样本的扩增谱型。
(B) 曲线1–8分别代表在去离子水中稀释的B. microti基因组DNA（浓度为1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL和0.1 fg/μL）的扩增谱型，引物和荧光探针基于第八组的18S rRNA序列设计。曲线9代表阴性样本的扩增谱型。
(C) 曲线1–8分别代表在去离子水中稀释的B. microti基因组DNA（浓度为1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL和0.1 fg/μL）的扩增谱型，引物和荧光探针基于第七组的18S rRNA序列设计。曲线9代表阴性样本的扩增谱型。
(D) 曲线1–8分别代表在去离子水中稀释的B. microti基因组DNA（浓度为1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL和0.1 fg/μL）的嵌套PCR结果。H代表阴性样本，M代表DNA标记。部分D的完整凝胶包含在补充信息文件中。

**荧光RPA检测方法的评估**
**荧光RPA的特异性**
来自8名P. falciparum和8名P. ovale患者的样本未显示峰值，其荧光强度远低于B. microti基因组DNA浓度1 fg/μl的阈值（补充图4）。

**确定荧光RPA的寄生虫密度最低检测限**
在小鼠感染模型中比较了显微镜、嵌套PCR和荧光RPA的时间检测灵敏度。荧光RPA检测同时应用于14组具有不同寄生虫密度的Balb/c小鼠血液样本（补充表3）。结果（图2A）显示，该方法可以检测到每微升血液中最低0.046个B. microti寄生虫的负荷。寄生虫密度更低的三个组样本未显示扩增曲线（荧光强度与阴性对照相似）。在检测呈阳性的组中，寄生虫密度较高的样本显示出更高的荧光强度。嵌套PCR检测结果（图2B）显示，在每微升血液中含有445,200、89,040、17,808和3,561.6个B. microti的样本中出现了清晰的条带。而含有712.32、142.46和28.49个寄生虫的样本仅显示微弱条带，其余组未观察到条带。因此，嵌套PCR方法能够有效检测到每微升血液中最低28.49个B. microti寄生虫的负荷。

**在感染小鼠模型中检测B. microti的不同方法**
从感染后第3天开始，每3天使用薄血膜涂片和显微镜检查对10只小鼠进行检测。在感染后第3天、第6天、第9天和第12天，10只小鼠的血液涂片中均未观察到B. microti。在感染后第15天，2个血液涂片中观察到B. microti；到第18天，8个样本呈阳性。到感染后第21天，所有样本均呈阳性（表2）。同时进行了嵌套PCR检测，在感染后第3天和第6天未观察到条带。在感染后第9天，一个血液样本中检测到一个条带；到感染后第12天，7个样本呈阳性。到感染后第15天，所有10只小鼠均检测到B. microti（补充图5）。在感染后第3天和第6天，小鼠的血液样本中未观察到上升的荧光曲线，其荧光强度接近阴性对照（图3A）。到感染后第9天，检测到4个阳性样本（图3B）。到感染后第12天，10只小鼠的所有血液样本在等温扩增后的荧光强度超过200 RFU（图3C）。这表明荧光RPA方法可以在感染后第12天有效检测到所有小鼠中的B. microti感染。

**使用荧光RPA方法在临床患者中检测B. microti**
对两名显微镜检测呈阳性的患者的血液样本进行了分析。首先使用属特异性引物BJ1（5’-GTCTTGTAATTGGAATGATGG-3’）和BN2（5’-TAGTTTATGGTTAGGACTACG-3’）进行touchdown PCR分子检测。50 μL的反应混合物包含25 μL的PCR混合液（2× Taq PCR MasterMix（北京天根生物技术有限公司））、22 μL的去离子水、各1 μL的正向和反向引物（10 μmol/μL）以及1 μL的DNA模板。热循环条件包括：初始变性96°C 6分钟，随后是8个循环，每个循环分别为95°C 30秒、58°C 45秒和70°C 1分钟（每次循环退火温度降低1°C），然后是27个循环，每个循环分别为95°C 30秒、50°C 45秒和70°C 1分钟，最后在70°C下延伸8分钟。对Babesia属扩增呈阳性的样本进行测序并通过BLAST分析验证。随后应用嵌套PCR和荧光RPA方法检测B. microti。对照组包括B. microti基因组DNA（阳性对照）、健康人血液（阴性对照）和去离子水（空白对照），以确保检测的特异性和可靠性。

**荧光RPA的现场应用**
根据2012年河南省新乡市报告的病例，有患者同时感染了Babesia寄生虫并出现发热和血小板减少症。本研究使用荧光RPA方法检测了河南省疾病预防控制中心在2015年收集的119名发热和血小板减少症患者的血液样本。对照组包括B. microti基因组DNA（阳性对照）、健康人血液（阴性对照）以及检测阈值浓度（1 fg/μL），以评估其在现场应用中的有效性。

**数据分析**
数据分析使用SAS 9.4软件进行。比较了荧光RPA和嵌套PCR的检测率及Kappa值，并使用McNemar检验来确定两种方法之间的显著差异。为了提高检测灵敏度，采用联合检测方法来确定样本中的B. microti感染情况。如果任一方法产生阳性结果，则将该样本分类为B. microti阳性。然后将这一结果与之前调查的Bunyavirus感染状态进行交叉参考，以评估两种病原体之间的共感染模式。阳性对照是来自B. microti的基因组DNA，阴性对照是健康个体的血液样本，空白对照是水。两个患者样本都显示出了明显的荧光峰值，其荧光强度超过了1000 RFU（图4B）。图4的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像：使用荧光RPA方法检测临床患者中的B. microti。（A）通过巢式PCR检测出B. microti的患者结果。1-2表示B. microti患者，+表示阳性对照，-表示阴性对照，M表示DNA标记物。（B）来自感染患者和对照组的B. microti基因组DNA的扩增曲线。曲线1和2代表浙江省的B. microti患者，+表示阳性对照，-表示阴性对照，H表示空白对照。A部分的完整凝胶包含在补充信息文件中。

初步应用荧光RPA方法：使用Babesia引物对119份发热和血小板减少症患者的血液样本进行了巢式PCR扩增。根据河南省疾病预防控制中心的数据，119名患者中有71人Bunya病毒检测呈阳性，48人呈阴性。通过电泳和自动凝胶成像分析了产物。巢式PCR方法在119份血液样本中的20份中检测到了目标条带，而荧光RPA方法在21份样本中识别出了B. microti（补充图6）。因此，通过荧光RPA检测出的B. microti阳性率为17.65%，通过巢式PCR检测出的阳性率为16.81%。两种方法之间的Kappa值为97.05%（91.31%-100%），结果没有显著差异（S = 1，P > 0.1）。此外，根据上述两种方法的联合实验结果（任一方法呈阳性即视为B. microti阳性），12名患者同时感染了这两种病原体（10.08%），9名患者仅感染了B. microti（7.56%），59名患者仅感染了Bunya病毒（49.58%），39名患者两种病原体均呈阴性（32.77%）。两种病原体的感染情况见表3。

讨论：巴贝西虫病是一种主要通过蜱虫叮咬传播的寄生虫病。输血传播的巴贝西虫病对血液制品的安全性构成重大威胁，尤其是在流行地区。献血者中的无症状B. microti感染可以逃避常规筛查方法，导致免疫功能低下的受者发生输血相关感染，并出现严重后果12,21。目前FDA的建议强调在高风险地区加强筛查，但仍存在局限性：血清学检测在窗口期内会出现血清转化延迟（>20%的假阴性），而病因学检测仍然耗时且依赖设施22。这些限制凸显了迫切需要高度敏感、快速的即时诊断方法，以确保及时发现病原体。快速检测血液中的B. microti对于患者治疗和防止通过输血传播巴贝西虫病具有重要意义23。在这项研究中，我们成功开发了一种基于18s rRNA基因的荧光RPA检测方法，与传统显微镜检查相比，该方法更方便、更高效，所需技术技能也更少。此外，与广泛使用的分子检测方法巢式PCR24,25相比，我们的方法显著缩短了检测时间，同时保持了高灵敏度。该检测的有效灵敏度为1 fg/μL，超过了巢式PCR所达到的10 fg/μL的限值。吴芬26的研究使用LAMP建立了一种B. microti的检测技术，灵敏度略高于我们的RPA方法（0.687 fg/μL）。然而，LAMP需要一小时才能完成检测，而我们的方法将检测时间缩短至仅20分钟，从而在效率上具有明显优势。我们的方法对于检测低寄生虫密度也非常有效。作为对比，聂等人的研究27开发了一种结合流式色谱和重组酶RPA的方法。该方法的结果可以通过观察试纸条是否产生条带来确定。该方法的最低检测密度为每微升血液0.5个B. microti27，但我们的方法显示出更高的灵敏度。由亚临床寄生虫血症（通常<100个寄生虫/μL）驱动的B. microti隐匿性传播对公共卫生构成了严峻挑战。无症状携带者由于持续的低水平感染——常规显微镜或血清学方法无法检测到——可能会在不知情的情况下捐献受污染的血液，导致输血传播的巴贝西虫病（TTB），在脾切除或免疫功能低下的受者中死亡率超过20%21。监测数据显示，超过80%的TTB病例来自寄生虫密度低于显微镜检测限（约500个寄生虫/μL）的无症状个体捐献的血液，而标准PCR无法可靠地识别<10个寄生虫/μL的感染22,23。这种诊断空白持续存在，特别是在美国东北部和中国河南省等流行地区，那里其他蜱传病原体（如Bunya病毒）的共存可能进一步掩盖早期感染迹象。我们的荧光RPA检测方法能够检测到0.046个寄生虫/μL——比当前的金标准低200倍——直接解决了这一脆弱性问题，通过在寄生虫进入血液供应系统之前就将其拦截，从而减轻了对输血安全性的普遍但未被充分认识的威胁。

此外，疟疾在临床表现上与巴贝西虫病有相似之处，仅凭临床显微镜检查难以区分这两种疾病28,29。我们的特异性评估证实，荧光RPA方法不会扩增P. falciparum或P. ovale感染的样本，显示出极好的特异性。这对于准确诊断至关重要，特别是在多种蜱传或寄生虫疾病共存的地区，因为它降低了假阳性的风险，并确保患者得到适当的治疗。此外，这还确保了荧光RPA能够准确区分疟疾和巴贝西虫病，防止误诊，并指导这两种相似但不同的疾病的治疗策略。我们进一步使用已建立的RPA方法检测了中国河南省新乡市119名发热和血小板减少症患者的血液样本中的B. microti30。巴贝西虫和Bunya病毒都是蜱传病原体，但这项回顾性研究没有收集患者的蜱虫叮咬历史信息。未来的研究应该收集这些数据。Seo等人的研究旨在确定韩国大田及其周边地区的蜱虫和蜱传病原体的分布情况，他们发现了严重发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV，一种Bunya病毒）（2例）、伯氏疏螺旋体（32例）和B. microti（7例），这表明在两种病原体共存的地区可能同时发生SFTSV（一种Bunya病毒）和B. microti的感染。

对于发热和血小板减少症患者的实验室诊断，应考虑巴贝西虫感染，特别是在未检测到其他病原体（如Bunya病毒）的情况下31,32。因此，在两种病原体共存的地区，对发热和血小板减少症患者的诊断应包括B. microti的检测，特别是在Bunya病毒检测呈阴性的情况下，并应考虑Bunya病毒阳性病例中的共感染可能性。虽然重组酶聚合酶扩增（RPA）提供了快速和敏感的巴贝西虫检测，但也必须承认一些局限性。首先，由于资源有限环境下的非特异性扩增以及未经处理的血液样本中的抑制剂或极低寄生虫水平（<0.01%）导致的假阴性，RPA容易出现假阳性19,33。其次，现场测试期间的温度波动（最佳RPA温度为37℃）和样本处理不当等环境因素可能会影响重复性34,35。第三，尽管RPA可以用于多重检测，但其目前识别共感染的能力仍然有限。引物/探针之间的交叉反应或一种病原体信号的主导可能会掩盖共感染，特别是在蜱传病原体经常共存的地区（如中国）36。解决这些挑战需要优化探针设计、严格验证现场可用的方案，并与互补方法结合进行全面的病原体筛查。

结论：本研究建立了一种使用荧光重组酶聚合酶扩增（RPA）技术检测B. microti的新方法。该方法表现出高灵敏度、强特异性和快速响应，仅需20分钟即可完成DNA扩增和检测。此外，还进行了一项回顾性研究，以评估荧光RPA技术在中国河南省新乡市人群中检测巴贝西虫病典型症状的应用。研究发现了Bunya病毒的共感染病例，突显了RPA技术在流行地区增强分子诊断的潜力。总之，RPA方法用于检测B. microti在实地调查中显示出巨大前景。