Indole-3-Carbaldehyde from Limosilactobacillus reuteriBoosts Chemotherapy Response in Diffuse Large B Cell Lymphoma by Blocking the Mechanistic Target of Rapamycin Pathway

《Research》：Indole-3-Carbaldehyde from Limosilactobacillus reuteri Boosts Chemotherapy Response in Diffuse Large B Cell Lymphoma by Blocking the Mechanistic Target of Rapamycin Pathway

　　

摘要：弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）因化疗敏感性下降和剂量限制性毒性难以管理而构成严峻的临床挑战。尽管肠道微生物群调节显示出“减毒增效”的潜力，但其在DLBCL中的作用机制尚不清楚。比较分析显示，DLBCL患者体内有益菌显著减少，特别是核心益生菌Limosilactobacillus reuteri的丰度显著降低。将健康捐赠者的粪便微生物群移植（FMT）到DLBCL小鼠模型中，可减少肿瘤负荷、提高化疗敏感性并减轻肠道毒性。从中分离出核心益生菌株L. reuteriHG001，其单独干预可复制上述效应，并通过代谢组学鉴定色氨酸代谢物吲哚-3-甲醛（ICAld）为其发挥辅助抗肿瘤活性的关键成分。机制研究表明，ICAld在小鼠模型中以剂量依赖性方式在体内外发挥显著的辅助抗肿瘤作用；其通过激活芳香烃受体（AHR）/细胞色素P450家族1亚家族A成员1（CYP1A1）/活性氧（ROS）轴，抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路，促进凋亡，并与环磷酰胺（CTX）产生协同效应。芳香烃受体拮抗剂可逆转L. reuteriHG001和ICAld的化疗增敏及肠道保护作用。本研究阐明了DLBCL中微生物群介导的机制，并支持将L. reuteriHG001作为一种益生菌佐剂用于增强治疗同时降低毒性。

论文解读：罗伊氏乳杆菌代谢产物通过AHR/mTOR轴调控弥漫大B细胞淋巴瘤化疗应答

研究背景与立项依据

弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是一种高度侵袭性的非霍奇金淋巴瘤，标准一线治疗方案R-CHOP（利妥昔单抗联合环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松）虽使约60%患者获益，但仍有40%患者因治疗相关毒性和肿瘤分子异质性面临复发或耐药风险。肠道微生物群在调节宿主免疫反应中至关重要，其失衡与肿瘤发展及治疗结局密切相关。然而，目前关于肠道菌群在DLBCL治疗中的具体调控机制及管理策略数据仍十分有限。Limosilactobacillus reuteri（罗伊氏乳杆菌）作为一种能产生多种代谢物（如罗伊氏素和吲哚衍生物）的核心人类共生菌，已在溃疡性结肠炎、动脉粥样硬化等疾病中显示出辅助治疗潜力。鉴于此，研究人员旨在阐明肠道微生物群在DLBCL化疗响应中的作用，并探索L. reuteri及其代谢物作为辅助治疗手段的可行性。该研究成果发表于《Research》期刊。

关键技术方法概述

研究人员采用了多组学整合策略。临床样本方面，纳入了21例初诊DLBCL患者和19例健康志愿者，通过全长16S核糖体RNA（rRNA）基因测序分析肠道菌群组成，并利用培养组学从健康供体粪便中分离菌株。动物实验方面，构建了NSG（NOD-Prkdc^scidIl2rg^em1/Smo）小鼠DLBCL异种移植模型，进行了抗生素预处理、粪便微生物群移植（FMT）以及口服L. reuteriHG001或吲哚-3-甲醛（ICAld）干预实验，并结合环磷酰胺（CTX）化疗。细胞实验方面，利用流式细胞术检测细胞凋亡与线粒体膜电位，通过蛋白质印迹法（Western blot）分析凋亡及信号通路蛋白表达，并采用靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行色氨酸代谢组学分析。此外，还运用了RNA测序（RNA-seq）和分子对接技术探究分子机制。

研究结果

DLBCL的发生发展与保护性肠道微生物物种丰度降低相关

通过对DLBCL患者与健康对照者粪便样本的全长16S rRNA测序分析发现，DLBCL患者的肠道菌群α多样性（香农指数和Chao1指数）显著低于健康对照组，且β多样性分析显示两组菌群结构存在明显差异。线性判别分析效应量（LEfSe）分析表明，Limosilactobacillus reuteri、Lactobacillus johnsonii和Bifidobacterium pseudocatenulatum等有益菌在健康个体中富集，而在DLBCL患者中显著减少。相关性分析显示，L. reuteri水平与DLBCL疾病负担（包括风险分层、临床分期、国际预后指数[IPI]评分、Ki67指数和p53突变率）呈显著负相关。

来自健康捐赠者的FMT可实现DLBCL的化疗增敏和减毒

在抗生素清除内源性菌群的DLBCL荷瘤小鼠模型中，给予健康供体FMT（MCH组）联合CTX治疗，相比单纯化疗组（MC组）进一步显著降低了肿瘤负荷（体积、重量）和血清肿瘤标志物（乳酸脱氢酶[LDH]、血清铁蛋白[SF]、β2微球蛋白[β2-MG]），并促进了肿瘤组织中促凋亡蛋白（Bax、cleaved-caspase3）的表达，降低了Ki67和p53阳性率。相反，给予DLBCL患者来源的FMT（MCD组）则部分削弱了CTX的治疗效果。此外，健康供体FMT还能修复CTX诱导的肠道屏障损伤，增加紧密连接蛋白（ZO-1、occludin）的表达，并降低炎症因子水平。

鉴定出L. reuteriHG001是提高DLBCL化疗疗效的关键益生菌株**

利用培养组学技术，研究人员从健康人粪便中分离出L. reuteriHG001，并证实其对DLBCL细胞系（SU-DHL-4和OCI-LY3）具有显著的促凋亡和线粒体膜电位去极化作用。体内实验显示，口服L. reuteriHG001联合CTX（MCL组）比单纯化疗更有效地抑制了肿瘤生长，降低了血清标志物，并上调了肿瘤组织中的促凋亡蛋白。同时，L. reuteriHG001干预显著提高了小鼠结肠、血清和肿瘤组织中的ICAld浓度，且Lactobacillus的丰度与炎症及肿瘤负荷呈负相关。

DLBCL细胞增殖的抑制主要由L. reuteriHG001产生的ICAld介导**

为明确活性成分，研究人员比较了活菌、热灭活菌和细菌上清液的作用，发现仅活菌和上清液能显著抑制细胞增殖并诱导凋亡。靶向代谢组学分析锁定色氨酸代谢物ICAld和吲哚-3-乳酸（ILA）。体外功能验证显示，ICAld在0.5 mM浓度下表现出最强的抗DLBCL活性，且与CTX联用（CI组）在抑制增殖、诱导线粒体膜电位去极化和上调促凋亡蛋白方面效果最佳，其作用显著优于ILA和黄尿酸（XA）。

L. reuteriHG001对DLBCL的抑制作用源于其色氨酸代谢途径

通过构建色氨酸缺乏饮食模型（MCL_neg组），研究人员发现低色氨酸饮食虽未完全消除L. reuteriHG001的抑瘤作用，但显著削弱了其效果。与正常饮食组相比，MCL_neg组肿瘤负荷更高，炎症更重，且肿瘤组织和血清中ICAld水平显著降低。这表明L. reuteriHG001对DLBCL的抑制作用依赖于其色氨酸代谢产生的ICAld，色氨酸缺乏会逆转其保护作用并加剧肠道屏障损伤。

ICAld以浓度依赖的方式抑制DLBCL荷瘤小鼠的疾病进展

体内剂量梯度实验表明，在饮水中给予50、100或200 mM的ICAld均可显著抑制肿瘤生长并减轻体内炎症状态，且呈明显的浓度依赖性，其中200 mM组（MCI_200）疗效最佳。同时，ICAld治疗改善了结肠屏障结构，增加了杯状细胞数量，降低了炎症因子水平，且未引起心、肝、脾、肺、肾等主要脏器的病理损伤，显示出良好的短期安全性。

ICAld通过AHR激活和mTOR通路抑制介导DLBCL细胞增殖抑制

转录组测序（RNA-seq）及京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析提示ICAld处理后细胞凋亡和mTOR信号通路发生改变。分子机制上，ICAld通过激活AHR，上调其下游细胞色素P450家族1亚家族A成员1（CYP1A1），诱导活性氧（ROS）生成。ROS协同CTX代谢产生的氧化应激，共同抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路的磷酸化，并上调磷酸酶与张力蛋白同源物（PTEN）表达，最终促进线粒体凋亡。使用AHR拮抗剂CH-223191可阻断上述效应。此外，ICAld对肿瘤细胞（SU-DHL-4、HT29）表现出选择性细胞毒性，对正常细胞（GM12878、NCM460）影响较小。

L. reuteriHG001和ICAld对DLBCL的化疗增敏作用可被AHR拮抗剂逆转

体内实验进一步证实，无论是口服L. reuteriHG001还是给予ICAld，其与CTX联用均能显著抑制肿瘤生长并减轻肠道毒性，而联合使用AHR拮抗剂则完全逆转了这两种干预措施的抗肿瘤和保护肠道屏障的效应。这确证了AHR是L. reuteriHG001和ICAld发挥化疗增敏作用的关键分子靶点。

讨论与结论

本研究首次揭示了DLBCL患者肠道菌群失调的主要特征是普遍的有益菌减少，而非致病菌的扩增。研究确定L. reuteriHG001及其色氨酸代谢物ICAld是调控疾病进展和化疗反应的关键因素。ICAld通过激活AHR/CYP1A1/ROS轴，抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，促进线粒体凋亡，从而增强CTX的抗肿瘤疗效并修复化疗引起的肠道屏障损伤。尽管该研究样本量相对较小，且未对其他代谢途径进行深入探讨，但它为基于微生物群的DLBCL防治策略提供了坚实的理论基础和实验依据。