通过元素标记、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）、指数放大技术和DNA酶实现甲基化DNA的灵敏检测

《Analytica Chimica Acta》：Sensitive detection of methylated DNA by elemental labeling inductively coupled plasma mass spectrometry using exponential amplification and DNAzyme

　　

刘少成|陈蓓蓓|何曼|胡斌

武汉大学化学系，中国武汉 430072

摘要

背景

通过将金纳米粒子（AuNPs）标记技术与电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）相结合，并与指数等温扩增（EXPAR）和脱氧核酶（DNAzyme）的级联扩增技术结合，开发了一种高灵敏度的甲基化DNA定量方法。在该方法中，目标甲基化DNA与特定的单链DNA（ssDNA）结合，形成复合物，该复合物可被修饰依赖的内切酶FspEI识别并切割。这种切割释放出一段独特的X序列，该序列随后作为引物启动EXPAR过程。扩增后的X序列作为脱氧核酶（DNAzyme）发挥作用，在磁性珠（MB-DNA-AuNPs探针）上切割底物链，并释放出AuNPs以供后续ICP-MS检测。

结果

通过ICP-MS检测释放的AuNPs浓度来确定目标甲基化DNA的量，而未甲基化的DNA无法触发切割和扩增级联反应，从而确保了高特异性。该方法对甲基化DNA的检测限低至5.2 fmol L^-1，比传统的元素标记ICP-MS方法低四个数量级。此外，该方法能够检测不同长度的目标甲基化DNA，并在混合样本中区分低至0.1%的甲基化水平。

意义

通过对实际血清样本中甲基化DNA的分析，验证了该方法的实用性，加标实验的回收率在89.6%到96.5%之间。这些结果表明该方法在复杂生物样本中灵敏可靠地检测甲基化DNA方面具有巨大潜力，为表观遗传学研究和临床诊断提供了有力工具。

引言

表观遗传学是指在不直接改变核苷酸序列的情况下，可遗传且可逆的基因表达变化。发生在CpG岛上的胞嘧啶甲基化被认为是最重要的表观遗传修饰[1],[2]。异常的DNA甲基化，如局部基因的甲基化不足或过度甲基化，以及整个基因组的甲基化不足，可能导致基因表达失调，从而引发阿尔茨海默病、肺癌、肝癌等人类的疾病[3],[4],[5]。因此，在区域和全局水平上检测DNA甲基化对于生理和病理研究具有重要意义。在血浆中检测甲基化DNA还可以实现非侵入性诊断并准确区分常见的原发性颅内肿瘤[6]。

甲基化特异性PCR是检测DNA甲基化水平的金标准，但对仪器和样品制备方法要求较高[7]。近年来，基于荧光[8],[9]、电化学[10],[11]、比色法[12],[13]、表面增强拉曼散射[14]、质谱[15]、表面等离子体共振[16]等的新生物传感器已被开发用于DNA甲基化检测，并已将其应用扩展到活细胞成像领域[17],[18]。尽管这些方法的检测限较低，但由于临床样本中的基质干扰，其分析性能可能会显著下降。因此，开发具有高灵敏度和强抗基质干扰能力的新型DNA甲基化检测方法非常重要。

作为强大的痕量元素分析技术，ICP-MS具有高灵敏度、宽线性范围、强抗干扰能力和同时分析多种元素的能力[19]。当与元素标记策略结合使用时，它在生物分析领域具有广泛的应用潜力。然而，关于ICP-MS检测甲基化DNA的报道较少。Wrobel等人[20]使用³¹P和¹⁸⁹Os作为元素标签，通过高效液相色谱（HPLC）-ICP-MS来确定整体DNA甲基化水平，其中³¹P作为内源性标签来测量DNA总量，而¹⁸⁹Os作为外源性标签来标记5-甲基胞嘧啶以确定甲基化DNA。该方法的检测限（LOD）为0.84 nmol L^-1。Zhou等人[21]提出了一种元素标记ICP-MS方法来检测甲基化DNA。他们首先将用镧系元素标签和8-氧鸟嘌呤修饰的单链DNA固定在磁性珠（MBs）表面以制备磁性探针。将磁性探针加入样品溶液后，单链DNA与甲基化DNA结合。形成的结合产物可被8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶（hOGG1）切割，从而将镧系元素标签从MBs表面释放出来。该方法可以区分混合物中0.1%的甲基化水平，但其LOD为84 pmol L^-1，相对较高，可能无法满足临床检测的要求。将等温核酸信号扩增技术等扩增系统与元素标记ICP-MS结合是一种提高方法LOD的有效策略。在各种扩增技术中，指数等温扩增（EXPAR）在短时间内（<30分钟）具有高效的扩增效率（10⁶-10⁹）。由于扩增过程仅涉及简单的模板链和两种酶，EXPAR非常适合扩增和检测短核酸[22],[23]。脱氧核酶（DNAzymes）是一类具有特定目标识别能力和相对高效催化能力的单链DNA分子。由于其单链DNA结构，DNAzymes稳定性良好，易于设计为其他核酸扩增方法的产物。因此，DNAzymes非常适合构建级联扩增系统，并在生物分析领域得到越来越多应用[24],[25]。

在此，我们提出了一种结合元素标记ICP-MS与EXPAR和DNAzyme级联扩增的灵敏方法，用于定量检测甲基化DNA。选择septin 9基因启动子区域的部分序列作为目标甲基化DNA，因为它对结直肠癌的检测具有较高的诊断价值[26],[27]。实验原理如图1所示。单链DNA与甲基化DNA结合后，含有5-甲基胞嘧啶的结合产物可被修饰依赖的内切酶FspEI识别并在修饰位点的3'侧N12/N16处切割，从而在单链DNA末端释放出X序列。X序列可用作引物，与模板链的X'部分结合，并在Nt.AlwI内切酶和Klenow聚合酶片段的作用下引发链置换扩增。由于模板链包含两个重复的X'序列，扩增会产生一个新的X序列，该序列可以与其他模板链结合进行新一轮的链置换扩增，从而实现EXPAR的目的。生物素修饰的底物链末端带有polyA序列，可以与链霉亲和素修饰的磁性珠（SA-MBs）和AuNPs结合，形成MB-DNA-AuNPs探针。通过EXPAR扩增产生的大量X序列可用作DNAzyme，在MB-DNA-AuNPs探针上切割底物链，从而将AuNPs标签从SA-MBs表面释放出来。经过简单的磁分离后，将上清液引入ICP-MS以检测¹⁹⁷Au的信号，从而实现目标甲基化DNA的定量检测。相反，当单链DNA与未甲基化DNA结合时，不含5-甲基胞嘧啶的结合产物不能被FspEI内切酶识别，X序列被封闭在单链DNA中，因此无法进行后续扩增，系统也没有信号响应。

章节片段

仪器和试剂

使用Agilent 7500a ICP-MS（Agilent，日本东京）检测¹⁹⁷Au，操作条件详见表S1。其他仪器的详细信息见文本S1。所有列在表S2中的核酸序列均来自上海桑贡生物技术有限公司。其他材料、试剂和缓冲液组合物见文本S2和S3。

AuNP探针的合成

AuNP探针使用大约5纳米的AuNPs制备，这些AuNPs是根据我们之前的工作合成的[

AuNP探针和MB-DNA-AuNPs探针的特性

合成的AuNPs和AuNPs探针通过透射电子显微镜（TEM）和UV-Vis光谱进行了表征，结果如图S1所示。从TEM表征可以看出，制备的AuNPs具有均匀的球形形态（图S1A），合成AuNPs的粒径为5.01±0.64纳米（图S1B）。UV-Vis吸收光谱（图S1C）显示AuNPs的最大吸收峰位于516纳米。

结论

通过结合EXPAR和DNAzyme的级联扩增系统与元素标记ICP-MS技术，实现了对甲基化DNA的超灵敏检测。与其他单步或级联扩增系统相比，该方法在短时间内引入了具有极高扩增效率的EXPAR。EXPAR的产物被设计为DNAzyme，用于切割底物链并释放MB-DNA-AuNPs上的AuNPs

作者贡献声明

何曼：撰写 – 审稿和编辑。胡斌：撰写 – 审稿和编辑、监督、方法学、资金获取、概念构思。刘少成：撰写 – 初稿、验证、方法学、研究、数据分析、数据管理。陈蓓蓓：撰写 – 审稿和编辑、方法学、概念构思

作者声明没有已知的利益冲突。

利益冲突声明

?作者声明没有可能影响本文工作的已知利益冲突或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号：22374111、21974100、21775113）的资金支持。