一种基于BP26单抗的新型间接ELISA方法，用于区分布鲁氏菌（Brucella melitensis）M5-90BPΔ26疫苗接种后的免疫反应

《Analytical Biochemistry》：A Novel Indirect ELISA Based on BP26 mAb to Differentiate Brucella melitensis M5-90BPΔ26 Vaccine Immunization

　　

崔玉洁|刘淑丹|蔡国华|李阳|周彦军|柯文婷

中国湖北省荆州市长江大学动物科学与技术学院，邮编434025

摘要

布鲁氏菌病主要由高度侵袭性的Brucella melitensis（B.melitensis）引起，仍然是全球主要的动物源性疾病威胁。区分感染动物和接种疫苗的动物（DIVA）对于有效的监测至关重要。在这项研究中，我们开发了一种基于新型单克隆抗体（mAb）的间接ELISA（iELISA），该抗体针对BP26蛋白。在优化条件下，该检测方法的临界值为0.4，诊断灵敏度为96.6%（29/30），特异性为100%（30/30）。iELISA显示出高分析灵敏度，且对常见病原体（E. coli、Salmonella和Y. enterocolitica）无交叉反应。检测内和检测间的变异系数（CV）均小于10%，证实了其良好的重复性。与商业试剂盒的比较分析显示，接种M5-90BPΔ26疫苗的山羊血清（90.18%）、M5-90疫苗血清（94.29%）以及未免疫对照组血清（96.02%）之间具有高一致性。这些结果表明，这种iELISA是区分临床实践中野生型感染和M5-90ΔBP26疫苗感染的可靠诊断工具。

引言

布鲁氏菌病仍然是全球最普遍的动物源性疾病之一，被世界动物卫生组织（WOAH）列为需报告的疾病[1]，[2]。在Brucella属中，Brucella melitensis（特别是生物型3）被认为是最具毒力和最普遍的病原体[3]，[4]，[5]，通过严重的生殖病理对公共卫生和畜牧业经济造成双重负担[6]，[7]。尽管使用减毒活菌株进行大规模疫苗接种是控制该疾病的基石，但传统的血清学检测方法（如玫瑰红平板试验（RBPT）和补体结合试验（CFT）无法区分感染动物和接种疫苗的动物（DIVA）[8]，[9]。这种诊断干扰造成了一个“灰色地带”，从根本上阻碍了监测的准确性和国家根除计划的进展。

周质蛋白BP26（也称为CP28或OMP28）已成为符合DIVA要求的策略的核心[10]，[11]，[12]，[13]，[14]。由于其强大的免疫原性和仅在暴露于野生型菌株完整抗原库的宿主体内引发特异性体液反应的能力，BP26是一个理想的诊断标志物。2022年5月，一个基因缺失的活疫苗M5-90ΔBP26在中国正式获得临床使用批准，这是一个里程碑式的进展——该疫苗能诱导抗Brucella的特异性IgG反应，同时缺乏BP26特异性抗体特征[15]，[16]，[17]，理论上可以实现DIVA。然而，缺乏标准化的高精度检测方法仍然是布鲁氏菌病控制过程中的一个关键瓶颈。

现有的布鲁氏菌病商业ELISA平台经常受到技术限制的影响，包括抗原纯度不足以及在被动吸附到固相过程中构象表位的丢失。这些因素通常会导致检测信号减弱或假阴性结果。在本研究中，我们设计了一种高亲和力的mAb 3G5，专门针对BP26蛋白。通过将mAb 3G5作为新型间接ELISA（iELISA）的分子支架，我们实现了BP26抗原的原位二次纯化。这种策略确保了构象的准确性，并最大化了诊断表位的暴露程度，优于传统的直接包被方法[18]，[19]。当与广谱商业cELISA结合使用时，这种新型诊断方法为区分自然B. melitensis感染和M5-90ΔBP26诱导的免疫提供了强大的工具，为布鲁氏菌病根除的最终阶段提供了重要的技术支持。

章节片段

动物、细胞和试剂

SPF级BALB/c小鼠购自中国三峡大学实验动物中心（宜昌）。小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）在我们的实验室中维持。B. melitensis M5菌株的bp26基因序列（GenBank: KF780860.1）由武汉清科生物技术有限公司合成。

血清样本

针对E. coli O157、Salmonella、Y. enterocolitica O:9的参考阳性血清以及Brucella阳性国家标准抗血清（BPNS）由中国研究所提供

重组BP26的表达、纯化和免疫反应性

His标签的BP26融合蛋白在E. coli Transetta（DE3）中成功表达，并通过Ni亲和层析纯化。SDS-PAGE分析显示约28 kDa处有一个明显的条带，与预测的分子量一致（图1A）。为了评估其诊断潜力和DIVA兼容性，通过Western blotting验证了重组BP26的抗原性。结果表明，BP26与接种了B. melitensis M5-90疫苗的山羊血清有强烈反应

讨论

全球布鲁氏菌病根除的进程不仅依赖于高覆盖率疫苗接种，还依赖于能够应对传统减毒疫苗造成的“诊断灰色地带”的DIVA兼容诊断方法。B. melitensis M5-90ΔBP26菌株在中国的正式批准标志着向“检测后扑杀”策略的关键转变。然而，这种和其他下一代疫苗的潜力取决于将它们与同样有效的

结论

本研究成功在E. coli上表达了高活性的His标签BP26蛋白。通过筛选用于iELISA的特异性mAb，我们显著提高了检测灵敏度。此外，将商业cELISA与M5-90ΔBP26菌株结合使用，为区分和根除B. melitensis提供了可行的策略。

CRediT作者贡献声明

柯文婷：撰写 – 审稿与编辑、监督、方法学、资金获取。周彦军：资源准备。李阳：资源准备、方法学。蔡国华：方法学。刘淑丹：撰写 – 原始草稿、方法学。崔玉洁：方法学、数据分析、数据管理

伦理声明

动物实验按照中国湖北省长江大学动物伦理与福利委员会批准的方案进行（伦理编号：202501041）。

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

数据可用性

作者确认支持本研究发现的数据在文章中可供查阅。

资金来源

本研究得到了中国国家自然科学基金（编号：32402873）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。