通过基于高内相乳液聚合物的μ固相萃取技术，结合高效液相色谱-质谱（HPLC-MS/MS）方法，对尿液基质中的胃癌生物标志物进行定量分析

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Quantification of gastric cancer biomarkers in the urine matrix by high internal phase emulsion polymer-based μsolid-phase extraction followed by HPLC-MS/MS

　　摘要
本文报道了一种分析方法的发展，该方法用于同时测定尿液中的4-甲基苯酚、4-羟基苯甲酸以及五种胆汁酸（即胆酸、甘氨醇脱氧胆酸、鹅去氧胆酸、脱氧胆酸和氢脱氧胆酸，logP值在1.6–4.9之间）。在高效液相色谱-质谱（HPLC-MS/MS）分析之前，作者探索了多孔丙烯酸聚合物作为非传统的固相萃取吸附剂的应用。这些材料是通过不同组成的高内相乳液聚合获得的，并在微型化设备（μSPE）中进行了初步测试，使用的合成尿液样品中每种化合物的浓度为200 ng/mL。研究发现，聚乙二醇（PEG）改性的聚合物在萃取效率方面表现出良好的分析性能（对于大多数分析物而言，萃取效率为76–100%），并且可以在纯乙醇中实现单次洗脱。在未经处理的真实尿液（1 mL，pH约3.5）中，对三种质量控制水平（50、200、500 ng/mL）的回收率进行了评估，结果显示日间RSD低于20%（n=3）。该聚合物至少可以经受十次吸附/解吸循环，这一优势通过绿色指标得到了进一步证实。此外，这种简化的程序还提供了令人满意的样品净化效果，其在HPLC-MS/MS分析中显示出了可以忽略的基质效应。为此专门开发了一种色谱方法，以实现所有目标物在单次运行中的同时分离和定量。在10–600 ng/mL的范围内观察到了良好的线性（R2 > 0.9919），并且灵敏度适当（几ng/mL），适用于未来对这些内源性化合物的监测。

引言
在生物分析领域，疾病的早期诊断是一个重要的应用方向。这在人类医学中尤为重要，例如对于癌症这种全球主要的死亡原因之一，但通过预防性诊断可以显著降低其危害。在最常见的致命癌症中，胃癌起源于胃的黏膜上皮细胞，由于其症状不具有特异性且可能由其他疾病引起，因此通常在晚期通过胃镜活检才被发现[1,2,3]。作为一种替代的诊断工具，定量胃癌肿瘤生物标志物对于实现早期确诊至关重要，这通常是通过监测内源性代谢物（如胆汁酸（BAs）和芳香化合物的浓度来进行的[1, 2, 4, 5]。胆汁酸是一类含羧基的内源性甾体，负责许多代谢功能和生理过程，首先是胆固醇的稳态和膳食脂质的吸收。然而，它们在体内的积累会导致细胞毒性，并且其浓度与多种对人类健康不利的效应相关。胆汁酸被认为具有致畸性和致癌性，并与内分泌病理、胃肠道化生以及导致转移性癌症的胃黏膜损伤有关[1, 5, 6]。在胃癌患者的尿液中，胆酸（CA）、鹅去氧胆酸（CDCA）、脱氧胆酸（DCA）和氢脱氧胆酸（HDCA）的水平显著升高，而甘氨醇脱氧胆酸（GCDCA）的水平则降低[1]。此外，小分子如4-甲基苯酚（4-MP）和4-羟基苯甲酸（4-HBA）也被认为是这种恶性肿瘤早期诊断的良好生物标志物，尤其是考虑到它们与生存率的高相关性[2, 4, 7]。由于尿液易于获取、收集速度快且无创，因此它是监测这些部分通过肾脏排泄的化合物的最方便的生物液体。根据现有的分析文献数据，由于胆汁酸和这两种芳香化合物在分子结构和理化性质上的明显差异，它们被作为两个不同的类别分别进行定量[1, 2, 4, 5]。尿液的组成以及目标分析物相对较低的浓度要求在仪器分析之前进行样品预处理。为此，采用了固相萃取（SPE），例如多孔聚合物已被用于4-MP和4-HBA在HPLC-UV前的磁吸附[2, 4]，以及使用传统吸附剂（如十八烷基硅胶）[5, 8]和共价有机骨架[1]的固定床离线/在线SPE进行胆汁酸的HPLC-MS分析。萃取步骤是在样品稀释[2, 4, 8]或蛋白质沉淀[1, 5]后对预处理过的尿液进行的，整个过程中需要使用乙腈、甲醇和Hexane等有机溶剂[1, 5]。看来，通过开发新的实验方案来改进样品处理方法还有很大的空间，以满足对更环保实验室实践的需求，同时不忽视分析要求。基于这些前提，本研究旨在开发一种新的、简便的方法，用于在同一色谱条件下同时定量尿液基质中的这些目标物，即通过单一SPE协议进行萃取/净化，随后进行LC-MS分析。近年来，由于多孔聚合物（polyHIPE）被证明具有多功能性和化学稳定性，因此受到了广泛研究。这些材料来源于水-油乳液，具有由“空隙”和“通道”组成的独特高连通性多孔结构[9]，适用于连续流动过程[10, 11]。通过改变预聚物混合物的组成，可以调节其亲脂性/亲水性及吸附亲和力[12,13,14,15]，因此有极大的应用潜力。实际上，文献中有关于polyHIPE材料作为吸附剂的应用报道，包括水净化[10]以及分析领域，例如在环境[16, 17]、食品[15, 18,19,20]和生物样品[21, 22]中多种分析物的SPE。然而，据作者所知，目前尚无关于使用这类多孔聚合物检测癌症生物标志物的文献。

实验部分
化学品和材料
4-HBA、4-MP、HDCA和CDCA的高纯度标准品由东京化学工业株式会社（日本东京）提供；CA和DCA的高纯度标准品由Thermo Scientific（意大利）提供，GCDCA则由Apollo Scientific（英国曼彻斯特）提供。所选分析物的分子结构和辛醇-水分配系数（logP）见图S1（补充材料）。为每种生物标志物准备了1000 mg L?1的乙醇标准溶液，并储存在黑暗环境中（4°C），以获得140 mg L?1的多重标准品。工作溶液（0.56–5.6 mg L?1）通过连续稀释制备，既用于样品添加也用于校准。

高效液相色谱
梯度级乙腈（ACN）、乙醇（EtOH）、甲醇（MeOH）和超纯水、氟化铵（NH4F，用于ACS分析）、甲酸（FA，99–100% v/v）、甲酸钠、氯化钾（KCl）、硫酸钠（Na2SO4）、柠檬酸三钠（Na3C6H5O）、氢氧化钠（NaOH）和尿素由Carlo Erba Reagents（意大利米兰）提供。氯化钙（CaCl2·2 H2O）和氯化铵（NH4Cl）由VWR（意大利米兰）提供，而氯化镁（MgCl2·2 H2O）由Eurobase SpA（意大利San Giuliano Milanese）提供。磷酸二氢钾（KH2PO4）、氯化钠（NaCl）和肌酐由Merck（意大利米兰）提供。空聚乙烯管（容量3 mL）和聚乙烯滤膜（孔径20 μm）来自Sepachrom-Mega Srl（意大利Rho）。用于制备polyHIPE的原料包括丁基丙烯酸酯（BA）、4-羟基丁基丙烯酸酯（HBA）、聚乙二醇单甲基丙烯酸酯（PEGMA）、缩水甘油甲基丙烯酸酯（GMA）、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯（TMPTA）、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸钾（KPS），均购自Merck；而季戊糖三丙烯酸酯（PETA）则来自Chemcruz。表面活性剂Synperonic PE/L121由Croda Chemicals提供，光引发剂Irgacure 819由Ciba提供。脱气去离子水使用Merck Millipore（美国Burlington, MA）的Q-POD纯化系统制备，并随后通入N2气体。

尿液样品
在研究的初步阶段使用的合成尿液的组成如下[23]：0.65 g L?1的MgCl2·2 H2O、0.65 g L?1的CaCl2·2 H2O、2.8 g L?1的KH2PO4、1 g L?1的NH4Cl、4.6 g L?1的NaCl、25 g L?1的尿素、1.1 g L?1的肌酐、2.3 g L?1的Na2SO4、0.65 g L?1的Na3C6H5O7和1.6 g L?1的KCl，所有成分均溶于蒸馏水中。使用0.1 M的NaOH将pH调节至6.5，然后将溶液储存在黑暗环境中，温度为4°C。真实尿液样品由自愿参与的健康成年人提供，他们完全了解本研究的过程，收集了500 mL的尿液样本。样本被分装（含添加和不含添加物的情况），立即冷冻并储存在黑暗环境中的?20°C玻璃容器中。使用前，样品在室温下解冻，然后按照“尿液中生物标志物的μSPE萃取和净化”部分描述的程序进行μSPE处理。

polyHIPE吸附材料的合成
基于聚丙烯酸的聚合物，即Lipo-polymer、Hydrox-polymer和PEG-polymer，具有不同的亲水-亲脂平衡特性，通过自由基聚合表面活性剂稳定的水-油乳液一步法制备[20]，并在本研究中测试它们作为尿液中癌症生物标志物的潜在吸附剂。这三种不同的聚合物是根据表S1（补充材料）中报告的预聚物组成合成的，涉及的化学反应示意图见图S2（补充材料）。实验条件的详细描述以及使用Zeiss EVOMA10仪器（Carl Zeiss，德国Oberkochen）在镀金样品上获得的代表性扫描电子显微镜（SEM）图像见补充材料（图S3）。

μSPE用于尿液中生物标志物的萃取和净化
μSPE操作使用50 mg的聚合物粉末，将其装入2 mL蒸馏水中，在3 mL容量的空管中，在多位置真空歧管（Resprep manifold，Restek Corporation，美国Bellefonte）中进行。首先用1 mL乙醇、1 mL蒸馏水和1 mL pH约为3.5的甲酸-甲酸钠缓冲溶液依次清洗和活化吸附剂，然后以约0.3 mL min?1的流速将样品（1 mL合成或真实尿液，含或不含添加物，pH约为3.5）加载到吸附剂上。用1 mL蒸馏水洗涤后，将吸附的分析物用1 mL乙醇洗脱，然后加入少量1:6 v/v稀释的醋酸酸化至pH约为5，接着通过HPLC-MS/MS进行分析。分析方法的步骤见图S4（补充材料）。

高效液相色谱-质谱分析
整个研究过程中使用的色谱仪为Agilent（意大利Cernusco sul Naviglio）的HPLC 1260 Infinity系统，与Agilent 6460 C MS ESI-MS/MS光谱仪耦合。色谱分离在Zorbax Eclipse Plus C18柱（4.6 × 100 mm，3.5 μm）上进行，之前使用Ascentis C18 2 × 2.1 mm，5 μm的保护柱。柱温设定为30°C（±0.8°C），样品注入量为10 μL。流动相由（A）1 mM NH4F的水溶液和（B）ACN组成，流速恒定为0.5 mL min?1，在线性梯度下从30% B开始，13.5分钟内增加到80% B，保持1分钟，然后又在0.5分钟内增加到98% B，再保持2分钟（洗脱步骤）；初始条件（30% B）通过7分钟的平衡时间恢复。分流阀设置为仅在1.5–15.5分钟内将柱子中流出的洗脱液送往离子化器，以排除与溶剂峰一起洗脱的高极性基质组分和被较高比例有机流动相洗脱下来的高保留基质组分，从而防止灵敏度损失，并提高方法的准确性和稳健性。三重四极杆质谱（MS）检测器以电喷雾离子化（ESI）模式运行，其参数如下：干燥气体（N2）温度200°C；干燥气体流量12 L min?1；雾化器压力40 psi；鞘气温度200°C；鞘气流速10 L min?1；毛细管电压正极4500 V，负极3000 V；喷嘴电压正极2000 V，负极0 V。所有分析物在相同的色谱运行中通过设置极性切换工具被检测到。定量分析采用多反应监测（MRM）模式和选择离子监测（SIM）模式进行，具体参数见表S2。图1显示了标准溶液的典型总离子色谱图（TIC）与SIM/MRM色谱图的叠加图。

移动相由（A）1 mM NH4F的水溶液和（B）ACN组成，流速恒定为0.5 mL min?1，线性梯度从30% B开始，13.5分钟内增加到80% B，保持1分钟，然后增加到98% B，再保持2分钟（洗脱步骤）；初始条件（30% B）通过7分钟的平衡时间恢复。分流阀设置为仅在1.5–15.5分钟内将柱子中流出的洗脱液送往离子化器，以排除与溶剂峰一起洗脱的高极性基质组分和被较高比例有机流动相洗脱下来的高保留基质组分，从而防止灵敏度损失，并提高方法的准确性和稳健性。三重四极杆质谱（MS）检测器以电喷雾离子化（ESI）模式运行，其参数如下：干燥气体（N2）温度200°C；干燥气体流量12 L min?1；雾化器压力40 psi；鞘气温度200°C；鞘气流速10 L min?1；毛细管电压正极4500 V，负极3000 V；喷嘴电压正极2000 V，负极0 V。所有分析物在相同的色谱运行中通过设置极性切换工具被检测到。定量分析采用多反应监测（MRM）模式和选择离子监测（SIM）模式进行，具体参数见表S2。图1显示了标准溶液的典型总离子色谱图（TIC）与SIM/MRM色谱图的叠加图。

移动相的组成包括（A）1 mM的NH4F水溶液和（B）ACN，流速恒定为0.5 mL min?1。梯度线性变化：从30%的B开始，在13.5分钟内上升到80%的B，保持1分钟，随后在0.5分钟内升至98%的B，再保持2分钟（作为洗脱步骤）；通过7分钟的平衡时间恢复到初始条件（30%的B）。分流阀被设置为仅将1.5–15.5分钟时间内从柱子中流出的洗脱液送往离子化器，这样可以排除高极性基质成分（这些成分随溶剂峰一起洗脱）和在高比例有机流动相作用下从柱子上洗脱下来的高保留基质成分，从而避免灵敏度损失，并提高方法的稳定性和准确性。三重四极杆质谱（MS）检测器采用电喷雾离子化（ESI）模式工作，源参数如下：干燥气体（N2）温度200°C；干燥气体流量12 L min?1；雾化器压力40 psi；鞘气温度200°C；鞘气流速10 L min?1；毛细管电压正极4500 V，负极3000 V；喷嘴电压正极2000 V，负极0 V。所有分析物通过设置极性切换工具在相同的色谱运行中被检测到。定量分析采用多反应监测（MRM）模式和选择离子监测（SIM）模式，详细参数见表S2。图1展示了标准溶液的典型总离子色谱图（TIC）与SIM/MRM色谱图的叠加图。

HPLC-MS/MS方法的发展
通过LC-MS/MS对许多胆汁酸进行精确定量时，常常受到ESI源中裂解效果不佳的阻碍。因此，一些现有方法采用SIM模式而不是MRM扫描[24, 25]。在本研究中，通过对每个分析物进行单次标准溶液（0.5 mg L?1的乙醇溶液）的直接注射，研究了其在ESI源中的最佳裂解条件，包括极性、前体离子和产物离子、裂解器电压以及碰撞能量。由于流动相的组成显著影响裂解行为，设计了不同的流动相组成以增强分析物的响应。本研究中测试了在流动相A中加入1 mM氟化铵的方法，因为已知铵盐能够促进[M+NH4]+加合物的形成[26, 27]。研究确认[M+NH4]+离子是CA的主要前体离子，通过NH3和多个H2O分子的丢失产生强烈的产物。对于GCDCA，[M+H]+是最强烈的前体离子，通过单个和双重H2O分子的丢失产生强烈的裂解产物。然而，胆汁酸在其甾体骨架的侧链上具有羧酸基团，可以通过氟化物有效去质子化生成[M-H]?前体离子。实际上，DCA和CDCA在负离子模式下显示出最大的响应，而在正离子模式下则难以检测到。尽管HDCA在两种模式下都可以检测到，但在正离子模式下背景信号较强，影响了分析的准确性（见补充材料中的图S5）。尽管尝试了不同的碰撞能量（0–60 V），但在负离子模式下未能检测到HDCA、DCA和CDCA的特定产物离子，因此采用了SIM模式[28]。同样的方法也应用于4-MP，得到了[M-H]?作为唯一的离子。4-HBA可以容易地去质子化成[M-H]?离子，并失去一个H2O分子，形成MRM模式下的产物。为了避免位置异构体的共定量，在MS分析之前必须对化合物进行良好的分离。如图1所示，混合物在色谱上得到了优异的基线分离，同时也实现了胆汁酸异构体（HDCA、CDCA和DCA）的满意分离。由于反相固定相上的色谱行为主要受流动相组成和pH值的影响，因此使用了0.5% v/v的醋酸作为柱后添加剂。这为所有分析物在广泛的亲脂性范围内提供了更好的峰形和分离度（见补充材料中的图S6）。表S2提供了最终条件以及通过单次标准分析获得的标准溶液的保留时间（RT）。

在合成尿液中对三种基于聚丙烯酸酯的polyHIPEs进行了评估，分别是Lipo-polymer、PEG-polymer和Hydrox-polymer。这些材料已在之前的研究中得到了充分表征[12, 14, 20, 29]，它们具有独特的polyHIPE形态（通过SEM验证，见补充材料中的图S3），并且具有不同的亲水-疏水性质，这一点在我们最近关于水样和牛奶样中类固醇激素的多类吸附的研究中得到了很好的体现[20]。制备的吸附剂在填充柱格式（50 mg）中进行了一系列筛选测试，以评估它们对七种生物标志物的吸附亲和力，显示出不同的分子结构和宽广的亲脂性范围（logP值在1.6–4.9之间，见补充材料中的图S1）。选择这种量的吸附剂是为了在μSPE格式下使用[22, 30]，并符合绿色样品制备（GSP）的标准，即减少化学物质的消耗和由此产生的废物[31]。SPE实验是在合成尿液样品（1 mL）中进行的，pH值调节为酸性以促进最亲水目标物（4-HBA和4-MP）以未带电未解离的形式的吸附，每种化合物添加了200 ng mL?1。提取效率（EE%）是通过比较μSPE前后样品溶液中的峰值面积来计算的。图2a显示了分析物吸附的结果：在非连续三天内进行的三个独立试验的平均值（RSD < 15%）。

关于(a)提取效率（EE%）和(b)回收率（R%）的结果，在三种聚合物（50 mg）上获得。条件为：1 mL合成尿液中添加了200 ng mL?1的每种分析物；柱子预处理：1 mL乙醇，1 mL蒸馏水，1 mL自来水（pH值约为3.5）；洗涤：1 mL蒸馏水；洗脱：1 mL乙醇；误差条代表日间实验的标准偏差（n = 3）。结果表明Lipo-polymer和PEG-polymer的行为相似，所有化合物的定量保留率（80–100%，4-HBA约为50%），且日间精度可接受（2–15%，n = 3）。相比之下，Hydrox-polymer在四种分析物上的吸附率较低，日间精度也较低（RSD在21–44%范围内）。由于吸附是在酸性介质中进行的，水分子可能会减少分析物与Hydrox-polymer上-OH结合位点的相互作用，从而导致提取效率降低。这一趋势也通过使用1 mL乙醇进行洗脱的回收数据得到了验证（见图2b），乙醇因其类似于甲醇的性质而被首先测试，但它具有更高的可持续性和较低的物理和健康风险[32, 33]，这证明了Hydrox-polymer和Lipo-polymer的性能不佳，因此不再进一步考虑。尽管测试了不同的碰撞能量（0–60 V），但在负离子模式下未检测到HDCA、DCA和CDCA的特定产物离子，因此采用了SIM模式[28]。同样的方法也应用于4-MP，得到了[M-H]?作为唯一的离子。4-HBA可以容易地去质子化成[M-H]?离子，并失去一个H2O分子，形成MRM模式下的产物。为了防止位置异构体的共定量，在MS分析前对化合物进行良好的分离是必不可少的。如图1所示，混合物在色谱上得到了优异的基线分离，同时实现了胆汁酸异构体（HDCA、CDCA和DCA）的满意分离。由于反相固定相上的色谱行为主要受流动相组成和pH值的影响，因此使用了0.5% v/v的醋酸作为柱后添加剂。这为所有分析物在广泛的亲脂性范围内提供了更好的峰形和分离度（见补充材料中的图S6）。表S2提供了最终条件以及标准溶液的观察到的保留时间（RT），这些数据是通过单次标准分析获得的。

在初步实验中评估了三种基于聚丙烯酸酯的polyHIPEs，分别是Lipo-polymer、PEG-polymer和Hydrox-polymer。这些材料已在之前的研究中得到了全面表征[12, 14, 20, 29]，它们具有独特的polyHIPE形态（通过SEM验证，见补充材料中的图S3），并且具有不同的亲水-疏水性质，这在我们最近关于水和牛奶样品中类固醇激素的多类吸附研究中得到了很好的体现[20]。这里，在填充柱格式（50 mg）中对这些吸附剂进行了系列筛选试验，以评估它们对七种生物标志物的吸附亲和力，这些吸附剂具有不同的分子结构和广泛的亲脂性范围（logP值在1.6–4.9之间，见补充材料中的图S1）。选择了这种量的吸附剂用于μSPE格式[22, 30]，并符合绿色样品制备（GSP）的标准，即减少化学物质的消耗和相应的废物产生[31]。SPE实验是在合成尿液样品（1 mL）中进行的，pH值调节为酸性以有利于最亲水目标物（4-HBA和4-MP）以未带电未解离的形式的吸附，每种化合物添加了200 ng mL?1。提取效率（EE%）是通过比较μSPE前后样品溶液中的峰值面积来计算的。图2a显示了分析物吸附的结果：在非连续三天内进行的三次独立试验的平均值（RSD < 15%）。

结果表明Lipo-polymer和PEG-polymer的行为相似，所有化合物的定量保留率（80–100%，4-HBA约为50%），且日间精度可接受（2–15%，n = 3）。相反，Hydrox-polymer对其中四种分析物的吸附率较低，日间精度也较低（RSD在21–44%范围内）。由于吸附是在酸性介质中进行的，水分子可能会减少分析物与Hydrox-polymer上-OH结合位点的相互作用，从而导致提取效率降低。这一趋势也通过使用1 mL乙醇进行洗脱的回收数据得到了验证（见图2b），乙醇首先因其类似甲醇的性质而被测试，但它具有更高的可持续性和较低的物理和健康风险[32, 33]，这证明了Hydrox-polymer和Lipo-polymer的性能不佳，因此不再进一步考虑。通过分析收集的洗涤液中的分析物百分比（4-HBA和4-MP两种最亲水化合物约为10–15%）验证了洗涤过程中没有显著的损失。因此，保留了这一步骤，以便应用于实际尿液中去除盐分和松散结合的基质成分[22]。接下来的工作重点集中在PEG-polymer上，这种材料也因其生物相容性得到了认可，已经通过细胞毒性试验得到了证明[12]。通过测试其他溶剂及其混合物，并在酸性条件下进一步研究了洗脱步骤。从补充材料中的图S7可以看出，纯乙醇被确认为最方便的洗脱液。实验验证单次洗脱就足以实现彻底的脱附，第二次洗脱中释放的分析物比例低于5–10%，这被认为可以避免增加操作步骤。在我们之前的工作中已经验证了合成的可重复性[20]，在这里通过对三个独立合成的吸附剂批次进行回收测试再次得到了确认，得到的RSD < 15%。基于这些发现，PEG材料被证明适合同时进行不同胃癌生物标志物的μSPE分析，这些标志物通常需要分别进行分析[1, 2, 4, 5]，从而提供了有效的多分析物提取，这在分析通量方面具有优势，符合绿色分析化学的第八原则[34]。随后，基于PEG的材料在真实尿液中得到了进一步研究。

在选定的条件下，该设置被应用于真实尿液样本中的回收测试，每种化合物添加了200 ng mL?1，观察到吸附剂的行为与在合成尿液中进行的相同试验相比没有显著变化（见补充材料中的图S8），从而证明了该方法适用于未经处理的生物基质。为了进一步评估在感兴趣的浓度下的准确性[1, 2, 4, 5]，在三个质量控制水平（50 ng mL?1、200 ng mL?1和500 ng mL?1）下进行了一系列回收测试。所得结果见图3，与在合成尿液中评估的EE%一致。虽然回收率不完全，特别是对于4-HBA和4-MP，但由于它们的化学性质，这种回收率是可以接受的，并且观察到的良好重复性允许对这些生物标志物进行准确的定量。图3显示了在真实尿液中PEG聚合物的回收率（R%），日间RSD < 20%（n = 3）。图4显示了在添加了每种化合物50 ng mL?1的尿液样本进行μSPE后的代表性色谱图（TIC色谱图与SIM/MRM色谱图的叠加图）。

通过将标准溶液（200 ng mL?1）和SPE提取物（来自QCM水平）在室温下保存1天以及在4°C下保存3天，证明了稳定性。在基质中也测试了冻融稳定性：在QCM水平下添加的尿液样本在-20°C下冷冻24小时，然后在每个循环之间解冻并按照最终程序处理。回收率与立即处理后的样本进行了比较，表明一个冻融循环后的稳定性良好，真实度的差异小于15%[35]。在QCM浓度下评估了polyHIPE的重复使用性。每次使用后，柱子按“μSPE用于尿液中生物标志物的提取和清洁”部分中详细描述的相同方式进行了洗涤和预处理。尽管这种生物基质含有许多浓度远高于目标分析物的成分，但在九次连续使用中既没有观察到效率损失也没有携带效应（见图5），这与之前的研究结果一致[22]。至少十次微固相萃取（μSPE）的满意使用寿命提高了所开发协议在绿色实践视野中的市场竞争力，这一点在用于尿中4-HBA和4-MP的磁性多孔聚合物的研究中也得到了观察[4]。图5：该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像。

在添加了200 ng/mL的的真实尿液中，每个生物标志物的回收率（n=3）进行了重复测试；平均回收率、标准偏差（括号内）以及RSD%以粗体显示。总体而言，这项工作的主要成就在于采用了微型化的工作流程，并且能够用单一协议同时检测不同类型的胃癌生物标志物，这与现有文献[1, 2, 4, 5]相比是一个重大进步。这一点在“绿色指标评估样本处理”部分得到了更好的证明，与[36]或[37]中传感器仅能检测单一生物标志物的方法相比，这种方法还具有多组分定量分析的优势。

关于仪器定量，首先在纯溶剂（乙醇）和基质（μSPE洗脱液）中探究了校准曲线，范围为10–1700 ng/mL?1，所有分析物的选定线性范围为10至600 ng/mL?1（表S3），这个浓度区间适合在μSPE后进行目标物质的检测，涵盖了三个质量控制水平。通过基质匹配的校准曲线计算得到的检测限和定量限分别为基线噪声与最低浓度校准物尾部比值的三倍和十倍（考虑了整个样本处理过程[20]）。基于平均质量控制回收率（图3），尿液样本中的方法定量限（MQLs）范围为几ng/mL?1，分别为胆汁酸10 ng/mL?1、4-HBA 13 ng/mL?1和4-MP 40 ng/mL?1。这些数值可以用于健康个体和肿瘤患者的尿液样本分析[1, 2, 4]。方法的系统误差可以忽略不计（根据分析物的不同，在-10%到+2%之间，4-HBA为16%，表S3），这表明可以使用纯溶剂进行外部校准进行定量，并且这种步骤简化的程序能够有效地净化如此复杂的实际基质。

通过在重复测试的连续洗脱液之间或注射最高校准标准品之后，注射纯乙醇和空白尿液μSPE洗脱液，排除了仪器携带效应。

通过绿色和蓝色指标进行评估：为了评估最终方法的绿色程度，使用了两种专门开发的软件，即AGREEprep（用于样本准备的分析绿色指标）[39]和SPMS（样本准备的可持续性指标）[40]。每个评估参数的数据包含在补充材料中（图S9）。图6显示的每个指标的得分表明绿色程度令人满意。实际上，该协议包含的步骤较少，使用的化学品和废弃物量也很少，样本处理中仅使用了2 mL乙醇作为有机溶剂，以及纯水清洗吸附剂。尿液酸化使用甲酸进行，且用量非常少，每个样本只需10 μL缓冲溶液。μSPE的微型化特性体现在所使用的吸附剂量少，可以重复使用于多个样本。其他优点包括处理少量原始尿液所需的操作时间短，提取和净化步骤整合在单个微柱μSPE过程中，以及在多位置μSPE装置上并行处理多个样本的能力，这对提高通量非常有用。作为现有绿色指标的补充，还应用了蓝色适用性等级指数（BAGI）工具来评估分析方法的实用性[41]。图6c中的象形图以蓝色为主，其中最亮的蓝色（深蓝色和蓝色）表示定量和确认性多类分析，这些分析之前是基于实验室容易合成的商用试剂进行的简化样本处理。由于最终得分超过60，BAGI表明该方法在常规生物医学分析中的易用性较高。

图6：该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像。

AGREEprep（a）、SPMS（b）和BAGI（c）指标得到的绿色/蓝色评估的图形输出。对于AGREEprep：（1）样本准备；（2）有害物质；（3）材料的可持续性、可再生性和可重复使用性；（4）废弃物；（5）样本的体积经济性；（6）样本通量；（7）集成和自动化；（8）能耗；（9）样本分析后的配置；（10）操作员安全。对于SPMS：样本量；萃取剂信息（萃取剂的量和性质）；程序信息（步骤数量；萃取时间；萃取后的额外步骤；样本通量）；能耗（分散；分离；温度）；总废弃物；萃取剂的可重复使用性（星形标记）。对于BAGI：（1）分析类型；（2）同时确定的分析物数量；（3）分析技术和分析仪器；（4）同时处理的样本数量；（5）样本准备；（6）每小时分析的样本数量；（7）使用的试剂和材料类型；（8）预浓缩的需求；（9）自动化程度；（10）样本量（为了方便，在BAGI象形图中添加了每个参数的数量）。

结论：开发了一种用于同时定量尿液基质中不同胃癌生物标志物的方法。样本处理步骤采用微型化的μSPE格式，使用了一种非传统的、生物相容且可重复使用的吸附剂，在原始尿液中进行，从而避免了如去蛋白化等耗时的步骤和额外化学品的使用。通过少量样品的萃取和单步纯乙醇洗脱，实现了目标分析物的联合提取/净化，通过HPLC-MS/MS在临床感兴趣的浓度范围内获得了准确的定量结果。从环境和职业安全的角度来看，这种方法非常有吸引力，并且有可能进一步考虑将其作为胃癌的诊断工具。