《Bioresource Technology》：Efficient de novo biosynthesis of salidroside in Yarrowia lipolytica via integrated metabolic and glycosyltransferase engineering
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唐文彦|段希宇|刘胡胡|王崇|何月东|潘虎|李长柱|卢向阳|纪晓军| Tian云|杨晓娜湖南农业大学生物科学与生物技术学院，中国长沙410128摘要水苏糖苷是一种高价值的植物源苷类化合物，具有多种药理活性，但由于提取效率低下，目前其供应面临限制。微生物生物合成提供了一种可持续的替
唐文彦|段希宇|刘胡胡|王崇|何月东|潘虎|李长柱|卢向阳|纪晓军| Tian云|杨晓娜
湖南农业大学生物科学与生物技术学院，中国长沙410128
摘要
水苏糖苷是一种高价值的植物源苷类化合物，具有多种药理活性，但由于提取效率低下，目前其供应面临限制。微生物生物合成提供了一种可持续的替代方案，但其高效生产仍然具有挑战性。在这项研究中，我们首次在脂肪酵母（Yarrowia lipolytica）中建立了水苏糖苷的从头合成途径，通过整合代谢工程和糖基转移酶工程实现了这一目标。首先，为了增加前体物质的供应，我们通过减轻反馈抑制和消除竞争性途径，系统地重构了酪醇的生物合成途径，在摇瓶培养条件下酪醇的产量达到了566.73毫克/升。随后，为了解决糖基化瓶颈问题，我们利用包含计算机预测、同源建模、分子对接、丙氨酸扫描、分子动力学（MD）模拟以及底物通道改性的综合半理性设计策略，对来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的糖基转移酶UGT85A1进行了工程改造。最优突变体UGT85A1^C128A/F217A在体内的水苏糖苷产量比野生型UGT85A1提高了2.22倍。分子动力学模拟显示，该突变体优化了催化几何结构，并显著拓宽了底物通道。最终，经过批式发酵后，工程菌株T1的水苏糖苷产量达到了4.96克/升，葡萄糖产率为0.031克/克，生产速率为0.041克/升·小时。这项工作扩展了可用于水苏糖苷生物合成的微生物平台，并为进一步开发脂肪酵母作为糖基化天然产物生产的宿主提供了有用的工程基础。
引言
水苏糖苷（酪醇8-O-β-D-葡萄糖苷）是一种具有多种生物活性的高价值植物源苷类化合物，包括抗炎、抗氧化和抗癌作用。由于其有益的特性，它在制药、营养保健和化妆品行业中引起了广泛关注（Huang等人，2025年；Kasprzyk等人，2023年；Lei等人，2024年；Zhang等人，2025a年；Zhao等人，2021年）。目前，商业用水苏糖苷主要从生长缓慢的植物（如红景天属（Rhodiola）植物、唐古特大黄（Aconitum tanguticum）和光亮女贞（Ligustrum lucidum）的根中提取（Shi等人，1998年；Torrens-Spence等人，2018年；Zhang等人，2021年）。然而，这种方法受到生长周期长、产量低和成本高的限制。此外，化学合成路线通常复杂且不可持续。因此，迫切需要开发可持续、高效且可扩展的生物制造平台来满足日益增长的市场需求。
随着代谢工程和合成生物学的快速发展，微生物生物合成已成为生产植物天然产物的有前景的替代方法。最近的研究表明，使用传统微生物宿主在水苏糖苷生物合成方面取得了显著进展。例如，Zhao等人（2026年）在大肠杆菌（Escherichia coli）中通过协同代谢调控和发酵优化实现了33.68克/升的水苏糖苷产量；Li等人（2026年）通过重新编程碳流分配，在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中进一步提高水苏糖苷产量至40.46克/升。尽管这些传统宿主已成功实现了水苏糖苷的从头合成（见补充材料），但将其生产扩展到非传统微生物中仍然是扩大工业生物技术应用范围的研究方向。
脂肪酵母（Yarrowia lipolytica）是一种公认的安全（GRAS）非油用酵母，具有适合工业生物生产的优点，包括生长迅速、易于遗传操作、高效的碳利用能力（包括使用低成本底物）以及对环境压力的高耐受性。脂肪酵母已被成功改造用于生产多种有价值的化合物，如黄酮类（Ge等人，2025年）、萜类（Ma等人，2024年）、脂肪酸（Tang等人，2024年）、核苷类化合物（Duan等人，2025年）和芳香氨基酸衍生物（Qian等人，2024年）。特别是其天然的强乙酰辅酶A流和代谢灵活性使其成为合成源自中央碳代谢的芳香化合物的有希望的宿主。然而，此前尚未有报道在脂肪酵母中实现水苏糖苷的从头合成。
在异源宿主中高效生产水苏糖苷需要克服两个主要瓶颈：确保足够的前体供应和实现高效的糖基化。其他微生物系统中的研究表明，通过减轻反馈抑制、消除竞争性途径和增加前体流量可以提高酪醇的产量（Jiang等人，2018年；Song等人，2024年；Zeng等人，2024年）。此外，由UDP-糖基转移酶（UGTs）催化的糖基化步骤往往是主要瓶颈，因为植物来源的UGTs在微生物宿主中的催化效率通常较低（Li等人，2024a年；Liu等人，2020年；Liu等人，2022年）。尽管已经鉴定出用于水苏糖苷合成的特定UGTs（如RrU8GT33和UGT85A1），但其在异源宿主中的活性通常需要进一步工程改造以满足工业需求（Fan等人，2017年；Li等人，2024b年；Ma等人，2026年）。半理性设计结合了计算机预测（如同源建模、分子对接和分子动力学模拟）与实验验证，能够在不依赖繁琐随机突变的情况下高效识别催化活性位点（Cheng等人，2015年）。
在这项研究中，我们在脂肪酵母中首次建立了水苏糖苷的从头合成途径。我们首先通过涉及反馈不敏感突变体和消除竞争性途径的代谢工程策略优化了内源酪醇合成途径。随后，酪醇的残留浓度表明糖基化是一个下游瓶颈。为了解决这一问题，我们采用综合半理性设计策略对植物来源的UGT85A1进行了工程改造，结合了同源建模、分子对接、分子动力学引导的活性口袋分析、底物通道预测和有益突变的组合优化。这一策略筛选出了最优突变体UGT85A1^C128A/F217A，显著提高了酪醇向水苏糖苷的转化效率。分子动力学分析进一步表明，性能提升与催化几何结构的优化和底物通道的拓宽有关。最终，经过批式发酵后，工程菌株T1的水苏糖苷产量达到了4.96克/升，葡萄糖产率为0.031克/克，生产速率为0.041克/升·小时。这些结果证明了脂肪酵母作为水苏糖苷生物合成的新宿主，并为微生物生产中有价值的苷类化合物的糖基转移酶工程提供了有用的框架。
章节片段
菌株和质粒
本研究使用了大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株进行质粒构建。贫营养型脂肪酵母菌株Po1f（Leu^-，Ura^-，Δku70）保存在我们的实验室中。所有使用的菌株和质粒均列在补充材料中。
质粒和菌株构建
pUC19质粒作为模块化组装的骨架。突变基因YlARO3^K225L（YlARO3*）、YlARO4^K221L（YlARO4*）和YlARO7^G139S（YlARO7*）是通过定向突变产生的。这些突变基因来自脂肪酵母Po1f的基因组DNA。
脂肪酵母中的水苏糖苷从头合成
水苏糖苷是通过酪醇与UDPG的糖基化反应生成的，这一过程由糖基转移酶催化（图1C）。尽管脂肪酵母具有酪醇和UDPG的内源性合成途径，但其内源性酪醇供应不足以支持高效的水苏糖苷生产。为了增加前体物质供应，我们采用多方面策略系统地改造了酪醇的生物合成途径：
结论
在这项研究中，我们成功建立了第一个用于水苏糖苷从头合成的脂肪酵母细胞工厂。通过结合系统性的代谢工程来增强前体供应，并通过半理性工程改造糖基转移酶UGT85A1以克服下游糖基化瓶颈，我们开发了一种在非传统酵母中生产水苏糖苷的整合策略。最优突变体UGT85A1^C128A/F217A的水苏糖苷产量提高了2.22倍。
未引用的参考文献
Guo等人，2020年；Liu等人，2018年。
CRediT作者贡献声明
唐文彦：撰写——初稿撰写、方法论开发、数据整理、概念构思。段希宇：资金筹措。刘胡胡：资金筹措。王崇：资金筹措、数据分析。何月东：资金筹措、数据分析。潘虎：数据分析。李长柱：数据分析。卢向阳：数据分析。纪晓军：资源协调。田云：撰写——审稿与编辑、监督、资金筹措、概念构思。杨晓娜：撰写——审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或可能影响本文工作的个人关系。
致谢
本研究得到了湖南省自然科学基金（2024JJ6242）、湖南省自然科学基金（2024JJ6311）、国家自然科学基金（32400313）、西藏自治区重点研发和转化计划（XZ202501ZY0098）、湖南省科技创新人才培养项目——青年和中年优秀科技人才培训计划（2023TJ-Z04）以及微生物技术国家重点实验室开放项目的支持。
