《Bioresource Technology》：System-level metabolic and enzyme engineering enables high-titer gastrodin biosynthesis in yeast
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万晓文|李东昊|唐明海|刘泽文|潘家宇|于洪斌|杨金良|刘华义
国家生物治疗重点实验室/四川大学华西医院生物治疗协同创新中心，中国成都610041
摘要
胃蛋白酶是一种临床常用的神经保护性酚类糖苷，用于治疗偏头痛和其他神经血管疾病，然而其可持续和可扩展的生产仍然具有挑战性。胃
万晓文|李东昊|唐明海|刘泽文|潘家宇|于洪斌|杨金良|刘华义
国家生物治疗重点实验室/四川大学华西医院生物治疗协同创新中心，中国成都610041
摘要
胃蛋白酶是一种临床常用的神经保护性酚类糖苷，用于治疗偏头痛和其他神经血管疾病，然而其可持续和可扩展的生产仍然具有挑战性。胃蛋白酶的微生物生物合成受到限于向莽草酸途径输送的碳流、在chorismate节点的强烈代谢竞争以及植物来源的UDP-糖基转移酶对4-羟基苯甲醇的催化效率低的影响。在这项工作中，我们建立了基于机制的代谢和酶重编程策略，以克服这些瓶颈，从而在Saccharomyces cerevisiae中实现胃蛋白酶的工业级生产。通过改造对反馈不敏感的Aro3变异体增强了碳进入莽草酸途径的能力，并通过结构引导的Aro7减弱作用，减少了l-苯丙氨酸和l-酪氨酸的生成，同时保持了必要的生理功能。为了维持高流量的前体生成，我们系统地重新配置了中心碳代谢，增强了戊糖磷酸途径的活性，并调整了磷酸烯醇式丙酮酸-丙酮酸的分配，从而提高了赤藓糖-4-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸和NADPH的可用性。为了解决最后的瓶颈问题，通过对AtUGT72B1的结构引导进化，得到了一个催化效率比野生型酶高26.6倍的糖基转移酶变体，同时加强UDP-葡萄糖的生物合成进一步支持了在高途径流量下的有效糖基化。这些多层次的工程策略的整合使得在摇瓶培养中产生了19.01 mM（5.44 g/L）的胃蛋白酶，在补料发酵中产生了90.34 g/L的胃蛋白酶，这代表了迄今为止报道的最高微生物浓度。总体而言，这项工作表明，将中心代谢结构与定制的酶性能同步，为解锁复杂植物天然产物的工业级微生物生物合成提供了一个通用的框架。
引言
植物来源的天然产物是药用活性分子的主要储备。胃蛋白酶是Gastrodia elata Blume的主要生物活性化合物，1984年被中国国家药品监督管理局（NMPA）批准用于治疗神经衰弱、偏头痛、三叉神经痛、枕神经痛和其他神经血管疾病。除了其已确立的临床应用外，由于其更广泛的神经保护、肝脏保护、心脏保护、抗病毒和抗癌特性，胃蛋白酶最近引起了新的兴趣（Xiao等人，2023年）。然而，其在干燥的G. elata根茎中的天然含量极低（约0.41%）（Liu等人，2018年），使得植物提取不可持续。尽管化学合成可以达到高达58.1%的产率（Li和Ma，2014年），但需要对有害试剂和高压条件的需求限制了其环境和工业可行性。这些限制激发了对微生物生物合成的兴趣，因为它提供了一种可扩展、可持续且环保的替代方案。
到目前为止，已经有多种微生物宿主被改造以构建从chorismate到胃蛋白酶的新生物合成途径（Bai等人，2016年；Gu等人，2024年；Wu等人，2024年；Yin等人，2020年）。在这个途径中，chorismate通过chorismate pyruvate-lyase（UbiC）转化为4-羟基苯甲酸，然后通过羧酸还原酶（CAR）-phosphopantetheinyl transferase（PPTcg）还原为4-羟基苯甲醛，进一步还原为4-羟基苯甲醇（4HBA），最后通过植物UGT糖基化生成胃蛋白酶。使用这条途径，E. coli和S. cerevisiae分别达到了545 mg/L和2.1 g/L的浓度（Bai等人，2016年；Yin等人，2020年），而在具有强莽草酸途径流量的Crabtree阴性酵母Yarrowia lipolytica中，通过广泛的代谢重编程，最近在5-L生物反应器中实现了13.4 g/L的产量（Gu等人，2024年；Wu等人，2024年），这代表了迄今为止报道的最高浓度。尽管这些进展证明了微生物生产的可行性，但达到工业相关的浓度仍然具有挑战性。
尽管取得了令人鼓舞的进展，胃蛋白酶的高水平微生物生物合成仍然受到多个相互关联的挑战的限制。糖基化仍然是主要的瓶颈：迄今为止使用的植物UGT在微生物环境中的催化效率有限，即使前体供应充足，也会导致4-羟基苯甲醇的积累。尽管在个别情况下尝试了结构引导的UGT工程，但迄今为止报道的改进都很有限，不足以在工艺相关规模上解决这一下游限制。在途径层面，增加莽草酸流量主要依赖于经典的Aro4反馈不敏感变异体、部分抑制丙酮酸激酶或普遍增强戊糖磷酸途径（PPP）。这些策略仅部分缓解了别构抑制，并未能充分克服芳香族氨基酸生物合成的竞争。尝试通过删除ARO7、PHA2或TYR1等基因来重新引导流量可以进一步增加前体的可用性，但不可避免地会产生营养缺陷，使放大生产变得复杂。此外，中心碳代谢和合成途径通常是在孤立的情况下进行优化的，而不是完全整合前体供应、分支点调节、氧化还原平衡和末端糖基化到一个协调的设计中。这些限制突显了需要一个更统一的工程框架，该框架结合了酶活性、前体生成、代谢分支点控制和辅因子可用性，以实现工业相关的浓度。
在这项研究中，通过在S. cerevisiae中整合酶级重设计与系统级代谢重编程来解决了这些瓶颈。首先，确定了AtUGT72B1是一个高效的4HBA UGT，并构建了一个稳健的生产平台。为了增强莽草酸流量，改造了一个对反馈不敏感的Aro3变异体，并开发了结构引导的Aro7突变体，以减弱竞争性的芳香族氨基酸生物合成，同时保持必要的生理功能。同时，通过增强戊糖磷酸途径的活性、调整磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）到丙酮酸的转化、提高赤藓糖-4-磷酸（E4P）和PEP的池以及改善NADPH的可用性，重新编程了中心碳代谢，从而更好地支持前体和辅因子的需求。最后，通过对AtUGT72B1的结构引导定向进化，得到了一种催化效率比野生型酶高26.6倍的糖基转移酶变体，从而解决了糖基化瓶颈。这些策略共同建立了一个协调的工程框架，重新平衡了前体流量、氧化还原代谢和末端糖基化，构建了一个高效的酵母细胞工厂，用于高水平的胃蛋白酶生产。
章节片段
菌株和培养基
本研究中使用的所有S. cerevisiae菌株列在补充材料中。根据实验目的，酵母菌株通常在YPD培养基或最小MV培养基中培养。MV培养基根据需要添加了l-Phe和/或l-Tyr以进行营养缺陷评估。对于基因组编辑，菌株在含有G418的YPD琼脂上选择。Escherichia coli DH10β和NEB Stable菌株用于质粒构建，并在适当的LB培养基中培养
在s. Cerevisiae中识别高效的UGT用于de novo胃蛋白酶生物合成
UDP-葡萄糖转移酶（UGT）通过将葡萄糖部分转移到4HBA上来催化胃蛋白酶生物合成的最后一步，形成胃蛋白酶（图1A）。然而，先前的研究表明，来自Rauvolfia serpentina的UGT（AsUGT）在S. cerevisiae中的催化效率较低（Yin等人，2020年），从而限制了整体生产效率。这可能是因为AsUGT对4HBA的催化活性有限，这一点从其相对较低的活性中可以反映出来
结论
在这项研究中，通过协同重新设计前体进入莽草酸途径的途径、精确减弱竞争分支点的流量、合理平衡中心碳代谢以及通过酶进化解决末端糖基化瓶颈，实现了高产量的生产。最终菌株在摇瓶培养中产生了5.44 g/L的胃蛋白酶（0.272 g/g葡萄糖，0.057 g/L/h），并在5 L补料发酵中产生了90.34 g/L的胃蛋白酶（0.228 g/g葡萄糖，0.47 g/L/h）
CRediT作者贡献声明
万晓文：撰写 – 审阅与编辑、调查、正式分析、数据管理。李东昊：撰写 – 审阅与编辑、正式分析、数据管理。唐明海：撰写 – 审阅与编辑、验证、方法学、正式分析、数据管理。刘泽文：撰写 – 审阅与编辑、验证、数据管理。潘家宇：撰写 – 审阅与编辑、验证、数据管理。于洪斌：撰写 – 审阅与编辑。杨金良：撰写 – 审阅与编辑、监督、项目
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。
