《Food Chemistry》：Rapid identification of binary and ternary adulteration in camellia oil by CRISPR/Cas12a assay
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石婷|戴腾辉|周静|李娟|张露露|崔洁宇|马晓东|戴俊宝|陈爱良|王新杰广东省岭南现代农业研究院基因组与多组学技术国家重点实验室，中国农业科学院深圳农业基因组研究所基因组分析实验室，深圳市，518120；国家市场监督管理总局食用油质量与安全重点实验室，武汉食品与化妆品控制研究所，
石婷|戴腾辉|周静|李娟|张露露|崔洁宇|马晓东|戴俊宝|陈爱良|王新杰
广东省岭南现代农业研究院基因组与多组学技术国家重点实验室，中国农业科学院深圳农业基因组研究所基因组分析实验室，深圳市，518120；国家市场监督管理总局食用油质量与安全重点实验室，武汉食品与化妆品控制研究所，武汉430040
摘要
山茶油掺假对消费者健康和食品安全构成严重威胁，然而现有的基于色谱的技术需要昂贵的仪器和受过培训的人员，这限制了其现场检测的应用。在这项研究中，我们使用了CRISPR/Cas12a技术来快速识别山茶油中的二元和三元掺假情况。基于我们筛选的RPA引物和相应的rbcL基因的crRNA，在40分钟内完成了CRISPR/Cas12a反应，对于掺入了大豆油、菜籽油、玉米油和花生油的山茶油，检测限可达到5%（w/w），并且可以通过肉眼观察得出结果。与传统的气相色谱技术相比，我们构建的CRISPR/Cas12a方法实现了100%的准确率，尤其是在掺假比例≤10%的情况下。这种成本低廉且设备要求不高的检测方法为现场检测掺假山茶油提供了有希望的工具，从而加强了食品质量控制和对消费者的保护。
引言
山茶油（Camellia oleifera Abel.）原产于中国南方，因其富含油酸（C18:1，74–87%）、多酚和植物甾醇以及许多其他有益健康的物质而成为最受欢迎的食用油之一（Shi, Dai, Zhang等，2025）。由于其相似的脂肪酸和独特的治疗特性，山茶油也被称为“东方橄榄油”（Gao等，2024）。由于其较高的营养价值，山茶油的售价远高于其他植物油，如大豆油（SOO）、菜籽油（RAO）、玉米油（COO）和花生油（PEO）。为了获取巨额利润，山茶油经常被掺入这些较便宜的油中，而不道德的商人会将这些二元或三元混合油标榜为纯山茶油（Wang等，2025；Yang等，2025）。这种行为不仅会对山茶油产业造成经济损失，还会对有特定饮食脂肪酸需求的消费者构成严重威胁（Lim等，2020）。因此，开发一种灵敏可靠的山茶油掺假检测方法对于确保其真实性至关重要。
在过去二十年中，验证山茶油是否与其他廉价植物油混合的最常用策略是监测小分子和代谢物的变化，如脂肪酸、甘油三酯、植物甾醇和生育酚（Dou等，2023；Mota等，2021）。基于此，已经开发了两种主要方法，即色谱法和非破坏性测试技术，广泛应用于山茶油掺假检测，包括质谱联用色谱（GC/LC）分离（GC–MS，LC-MS）、光谱技术（近红外/中红外光谱（NIR/MIR）、傅里叶变换（FT）拉曼光谱、核磁共振（NMR）以及电子感官检测（电子鼻/电子舌）（Shi等，2020）。虽然推荐的色谱方法可以提供精确的植物油质量评估，但需要昂贵的仪器和繁琐的样品预处理过程。而非破坏性方法虽然重复性好且样品消耗少，但产生的数据维度较高，需要强大的化学计量工具来提取复杂的诊断信息（Hong等，2023）。因此，这两种方法由于受到昂贵设备或复杂软件流程的限制，不适合快速现场检测。因此，迫切需要开发一种简单、低成本且高效的山茶油掺假检测平台。
另一方面，与那些在不同提取过程中变化较大的小代谢物不同，DNA分子不受环境条件和储存阶段的影响，可以被视为植物种类鉴定中高度可靠和明确的标记物，以确保食品安全（Costa等，2012；Ellis等，2012）。近年来，基于DNA的技术已成功应用于植物油的真实性评估。例如，基于聚合酶链反应（PCR），可以利用两种核糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基（rbcL）序列成功区分了中国最常见的六种食用油（橄榄油、大豆油、葵花籽油、花生油、芝麻油和玉米油）以及混合油（掺假比例为10%）（Zhang等，2012）。同样，Christopoulou等（2024）利用PCR和来自rbcL基因的多重植物鉴别反应，在20分钟内通过肉眼观察成功区分了掺假比例为5–10%的橄榄油混合物。在所有基于DNA的生物传感器方法中，最新且最令人兴奋的技术之一是基于规则间隔短回文重复序列（CRISPR）的检测系统，其目标识别特异性和灵敏度高于PCR和实时定量PCR（qPCR）。由于其基于室温反应条件且仅需要单碱基分辨率，这种方法在即时检测领域得到了广泛应用（Huang等，2024；Liu等，2024）。结合Cas12a蛋白的靶向诱导切割功能，开发的CRISPR/Cas12a技术能够轻松识别这些目标核酸，已成为食品安全快速检测的首选技术，例如在肉类产品（Wu等，2021；Xiang等，2024；Xiaobo Zhang等，2024；Zhao等，2024）、牛奶（Pan等，2022）、转基因生物（Liu等，2021；Pataer等，2024）和植物成分（Wax等，2023）中的应用。尽管CRISPR/Cas12a技术具有很大潜力，但目前尚无关于使用该技术检测山茶油的文献报道。
本研究旨在利用CRISPR/Cas12a技术针对五种不同植物物种的rbcL基因，快速识别掺入了大豆油、菜籽油、玉米油和花生油的山茶油，掺假比例≥5%（w/w）。为此，根据我们之前发表的论文（Shi等，2021；Shi, Dai, Wu等，2025），首先分析了五种不同植物油（CAO、SOO、RAO、COO和PEO）中的脂肪酸和甘油三酯组成（通过GC-脂肪酸和LC/MS-甘油三酯指纹图谱）。这些脂质组成可用于确认收集的所有油样是否具有代表性，为潜在的二元和三元掺假油样的制备提供基础。然后使用BLAST进行多序列比对，选择特定于植物的独特rbcL基因，从而区分上述五种植物种子。在此基础上，比较了两种不同的DNA提取方法，以获得更高浓度和纯度的DNA。随后，使用我们设计的重组酶聚合酶扩增（RPA）引物和CRISPR RNA（crRNA）序列，进一步测试了CRISPR/Cas12a技术的有效性，包括特异性、重复性和实际样品检测。本研究将提供一种有效的方法，用于快速识别山茶油中的常见二元和三元掺假。
部分摘要
材料与方法
作为标准样品的五种植物种子分别来自山茶（Camellia oleifera Abel.，Acc. Num. NC_023084.1:57021–58,448）、大豆（Glycine max，Acc. Num. NC_007942.1:c6739–5312）、菜籽（Brassica napus，Acc. Num. NC_016734.1:53645–55,084）、玉米（Zea mays，Acc. Num. NC_001666.2:56874–58,304）和花生（Arachis hypogaea，Acc. Num. NC_037358.1:c6527–5100），从可靠的在线市场或本地市场购买，并在4°C、避光的条件下保存
工作原理
我们构建的基于CRISPR/Cas12a的核酸测试方法用于山茶油 authenticity 的检测，依赖于CRISPR/Cas12核酸酶的直接激活。这一快速方法包括三个连续步骤：DNA分离、RPA 和 CRISPR/Cas12a 反应，如图1所示。首先通过最优提取方法获得浓度和纯度最高的DNA模板。然后使用RPA，从不同的油样中识别目标rbcL基因区域
结论
本研究成功构建了RPA-CRISPR/Cas12a技术，用于快速识别山茶油中的二元和三元掺假。通过脂肪酸和甘油三酯谱型，并结合HCA和PCA模型，所有收集的山茶油、大豆油、菜籽油、玉米油和花生油都被证明具有代表性，其中21个掺假比例为5–30%的混合样品被筛选为潜在的掺假目标。
作者贡献声明
石婷：撰写——原始草案、验证、资源提供、研究设计、概念构建。戴腾辉：撰写——审稿与编辑、数据分析。周静：数据可视化、形式分析。李娟：数据验证、方法论设计。张露露：数据可视化、方法论设计。崔洁宇：数据验证、方法论设计。马晓东：撰写——审稿与编辑、项目管理。戴俊宝：项目管理。陈爱良：撰写——审稿与编辑、项目管理。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（32571681）、中国农业科学院青年人才计划和优秀农业计划的专项资助（2202000029990240004）、WIIRI试点研究计划（XD23002）以及国家市场监督管理总局食用油质量与安全重点实验室开放研究基金（SYYKF202505）的支持。
