在发酵过程中使用PCR-CRISPR/Cas12a技术对地衣状芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）进行定量监测

《Food Research International》：Quantitative monitoring of Bacillus licheniformis during fermentation using PCR-CRISPR/Cas12a

　　

赵国宁|魏俊林|李远林|朱楚天|唐洁|龚嘉欣|黄永光

贵州大学酒与食品工程学院，中国贵阳550025

摘要

Bacillus licheniformis是白酒发酵中的关键功能细菌，在风味化合物的形成中起着重要作用，因此对其进行定量检测至关重要。本研究开发了一种基于CRISPR/Cas12a的微生物核酸定量（CRMNQ）方法，用于测定白酒发酵中的B. licheniformis含量。该方法结合了高效的PCR扩增和高度特异性的CRISPR/Cas12a识别技术，通过终点荧光测量实现定量分析，无需使用定量实时PCR仪器。在优化条件下，该方法检测限（LOD）达到72.3拷贝/μL，并具有较高的特异性。该方法成功应用于模拟样品和实际白酒发酵样品中B. licheniformis含量的监测，其稳健性和抗干扰能力优于qPCR方法。总之，该方法为白酒发酵中B. licheniformis的高灵敏度和特异性检测提供了有效且实用的工具，有助于发酵过程监控和质量控制。

引言

发酵食品因其风味、营养和保存性能而成为人类饮食的重要组成部分（Hernandez-Velazquez等人，2024年）。这类食品是由细菌、酵母和霉菌等微生物群共同作用产生的（Auchtung等人，2025年；Zhang等人，2025年）。然而，不同微生物在发酵过程中的复杂相互作用和竞争使得发酵过程的控制变得具有挑战性（Xin & Qiao，2025年）。同时，复杂发酵系统中关键功能微生物的数量变化会直接影响发酵过程和发酵食品的质量（Shi, An等人，2022年）。因此，通过对关键功能微生物进行定量监测来优化发酵过程对于提高发酵食品的质量至关重要（Yao, Zhu等人，2024年）。

白酒是一种典型的中国发酵食品，其发酵过程依赖于多种微生物之间的相互作用（Gong等人，2023年；Zhu等人，2023年）。其中B. licheniformis是白酒发酵中不可或缺的菌株。与其他Bacillus种类相比，B. licheniformis具有更强的酶和风味化合物生成能力（Ren等人，2025年；Zhu等人，2025年）。其代谢产生的吡嗪、呋喃和愈创木酚等关键风味化合物赋予白酒独特的香气，如烘烤香气、奶油香气和酱香（Tang等人，2025年；Wu, Lu等人，2021年）。此外，多项研究表明，白酒发酵过程中主要风味化合物的变化与B. licheniformis数量的变化密切相关（Meng等人，2015年；Wang等人，2017年；Wang等人，2023年）。因此，准确定量监测B. licheniformis对于提高白酒品质至关重要。

目前，有多种分子方法用于微生物的检测和定量分析（Guo等人，2025年；Wang, Du等人，2024年；Xu等人，2025年）。定量实时PCR（qPCR）被广泛用于核酸定量。然而，qPCR需要专业技术人员和昂贵设备（Jiang等人，2023年；Kaminski等人，2021年），且易出现假阳性和扩增偏差，这在复杂发酵系统中降低了其可靠性（Baek等人，2021年；Yao, He等人，2024年）。因此，迫切需要开发一种在复杂发酵系统中具有更高稳定性、抗干扰能力和灵敏度的分子检测方法。近年来，CRISPR/Cas12a检测技术因其高度特异性和灵敏度而为微生物核酸检测提供了新的解决方案（Yao, He等人，2024年）。目前，CRISPR/Cas12a已广泛用于检测食品相关微生物，尤其是食源性病原体，并显示出良好的灵敏度和特异性（Wang, Chen等人，2024年；Yin等人，2023年；Zhou等人，2023年）。例如，该技术已被用于检测食品中的诺如病毒（Le等人，2025年）、金黄色葡萄球菌（Guo等人，2025年）和单核细胞增多李斯特菌（Safenkova等人，2026年）。随着基于CRISPR的检测方法的不断发展，CRISPR/Cas12a系统已与多种核酸扩增技术结合使用，包括PCR、环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）（Hu等人，2023年；Ji等人，2025年；Wei等人，2025年）。特别是等温扩增方法（如LAMP和RPA）与CRISPR/Cas12a结合使用时，可在温和反应条件下快速检测目标微生物（Chen等人，2025年；Zhong等人，2025年）。然而，这些等温扩增检测系统通常涉及复杂的引物设计及引物二聚体形成的风险，可能影响检测的稳定性和准确性（Ji等人，2025年）。在白酒发酵系统中，由于发酵基质的复杂性，这些限制可能会更加明显。此外，众多干扰物质的存在可能进一步影响检测结果的可靠性（Dong等人，2024年；Huang等人，2025年）。目前报道的CRISPR/Cas12a检测方法主要集中在食源性病原体的检测上（Chen等人，2023年；Han等人，2026年；Xing等人，2023年）。相比之下，关于复杂发酵系统中关键功能微生物定量监测的研究相对较少。与传统PCR相比，由于其成熟的技术、可控的扩增特性和较强的适应复杂基质的能力，传统PCR仍然是一种可靠且稳健的扩增方法（Yin等人，2024年）。

本研究开发了一种基于CRISPR/Cas12a的微生物核酸定量（CRMNQ）方法，用于白酒发酵过程中B. licheniformis的定量监测。该方法结合了PCR扩增和CRISPR/Cas12a检测系统，这种双重识别策略提高了检测特异性和抗基质干扰能力，同时保持了可靠的定量性能。该方法为复杂发酵系统中关键功能微生物的监测提供了敏感且实用的工具，从而促进了白酒生产过程中的过程监控和质量控制。

部分内容片段

材料与试剂

所有引物和crRNA均由Sangon Biotech Co., Ltd.（中国上海）合成。报告基因由Tsingke Biotechnology Co., Ltd.（中国北京）合成。引物、crRNA和报告基因的序列详见表S1。LbCas12a、2× SG Fast qPCR预混液和无RNase水均从Sangon Biotech Co., Ltd.（中国上海）购买。琼脂糖、细菌DNA提取试剂盒和土壤DNA试剂盒从Solarbio Science & Technology Co., Ltd.（中国北京）购买。

工作原理

CRMNQ的方法原理如图1A所示。该方法依赖于Cas12a在特定crRNA引导下的目标DNA诱导的转切割活性。PCR扩增后，B. licheniformis的gyrB基因片段被富集，以产生足够的扩增子供后续CRISPR/Cas12a识别。当扩增的目标DNA与crRNA结合时，Cas12a–crRNA复合物被激活，对单链DNA表现出非特异性的转切割活性。

结论

本研究开发了一种基于CRISPR/Cas12a的微生物核酸定量（CRMNQ）方法，用于白酒发酵过程中B. licheniformis的定量监测。该方法结合了传统的PCR扩增和CRISPR/Cas12a介导的特异性识别，实现了不需要实时PCR仪器的灵敏且特异的终点荧光定量。此外，PCR引物与crRNA的双重识别机制有效防止了干扰。

作者贡献声明

赵国宁：撰写 – 审稿与编辑，原始草案撰写，数据可视化，方法学设计，数据分析，数据整理。魏俊林：撰写 – 审稿与编辑，实验设计。李远林：撰写 – 审稿与编辑，数据可视化。朱楚天：撰写 – 审稿与编辑。唐洁：撰写 – 审稿与编辑。龚嘉欣：撰写 – 审稿与编辑。黄永光：撰写 – 审稿与编辑，结果验证，项目统筹，资金申请。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本项目的支持来自国家自然科学基金（项目编号32360571和32472319）；贵州科技计划项目（平台与人才项目），GCC[2023]064；贵州科技成就项目（项目编号[2023] 477）；贵州基金项目（ZK[2024]重点项目编号016）；贵州科技支持计划项目（[2024]一般项目编号343）；贵州省基础研究计划（Qiankehe Zhongyindi [2026]006）。