通过集成生物反应器发酵与膜乳化技术实现可持续的微生物生物 stimulant（生物促进剂）生产

《ACS Sustainable Chemistry & Engineering》：Sustainable Microbial Biostimulant Production by Integrated Bioreactor Fermentation and Membrane Emulsification

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促进植物生长的微生物代表了提高作物产量和营养质量的可持续替代化学投入品。但其商业化受到缺乏有效制剂技术和发酵方法的限制。事实上，它们的功能与实施保护性基质有关，这种基质对于增强微生物的存活率和应用效率至关重要。为了加速其应用，需要开发先进的制剂技术，这些技术应易于大规模生产，在温和条件下运行，并确保细胞固定化和存活率的高效性。通过实施能够产生高浓度活性微生物细胞的可持续高效发酵过程，可以进一步促进基于微生物的生物刺激剂的潜力。在本研究中，膜乳化被作为一种先进的包封方法来生产含有 Kosakonia pseudosacchari TL13（一种有前途的生物肥料细菌菌株）的藻酸盐胶囊。柑橘废弃物生物质在生物反应器中转化为 K. pseudosacchari TL13 生物质，然后同时将微生物和发酵产生的生物活性化合物进行包封。结果表明：(i) 膜技术可以用于基于乳化的传统包封过程的重设计，从而减少剪切应力，并在制剂质量和微生物装载及存活率方面提高效率；(ii) 可以使用低成本且易于获得的食品废弃物来获得高浓度的生物质和增值产品（即外多糖）；(iii) 通过使用整个培养液作为生物刺激剂的原料，可以简化后续工艺。总体而言，所提出的综合策略基于工艺效率和环境影响，提供了一种可持续的基于微生物的生物刺激剂生产方法。

**引言**
基于微生物的生物刺激剂日益被认为是可持续农业的关键组成部分，它们提供了创新策略，可以改善植物生长、抗逆性和生产力，同时减少传统农业投入对环境的影响。然而，它们的大规模应用伴随着重大的技术和经济挑战。主要的技术限制包括：
(1) 保质期和产品稳定性有限。基于微生物的生物刺激剂对温度、湿度和储存条件敏感，其活性会随时间下降，这在没有先进制剂或包装技术的情况下使得长期储存和分销变得困难；
(2) 质量和效果不一致。生产方法和菌株的变化导致产品质量不稳定，田间表现难以预测。在制造、储存和应用过程中保证微生物的活性和高质量仍然是一个技术挑战；
(3) 缺乏合适的载体材料和制剂。用于支持和输送微生物接种剂的材料往往不足，从而降低了微生物的存活率和效果。需要更好的载体和包封技术，以在各种条件下改善性能。

近年来，人们对将促进植物生长的微生物（PGPM）固定在各种载体中的兴趣日益增加，以确保它们在土壤环境中的长期存活。在各种载体中，包括基于藻酸盐的聚合物材料引起了广泛关注：
(1) 藻酸盐是褐藻（如 Macrocystis pyrifera、Laminaria hyperborea、Laminaria digitata、Saccharina japonica、Lessonia nigrescens、Lessonia trabeculata、Ecklonia arborea、Ecklonia radiata、Durvillaea potatorum 和 Ascophyllum nodosum）中最丰富的多糖。它由不同比例的乌洛糖酸、α-古洛糖酸 (G) 和 β-甘露糖酸 (M) 组成，这些成分通过 1→4 糖苷键均匀或非均匀地连接在一起，形成三种不同的结构单元：polyM、polyG 和 polyMG；
(2) 藻酸盐因其理想的特性（如高机械稳定性、持水能力、无毒、可生物降解、低成本和易获取性）而成为微生物细胞微囊化应用的最常用生物聚合物；
(3) 乳化技术是大规模生产用于农工业过程的封装细菌的最有效方法，因为它不需要热源，从而避免了可能损坏生物活性成分的热损伤；
(4) 膜乳化（ME）是一种相对较新的技术，已成功应用于活性分子的封装；
(5) 其主要特点是滴液形成是通过逐滴方式实现的，无需施加高破坏性力，这与传统乳化设备不同，后者可能会损害敏感封装成分（如活细胞）的结构和功能完整性；
(6) 尽管研究尚不充分，但 ME 作为一种细胞封装方法仍具有很大吸引力。已有研究报告使用 ME 对 Lacticaseibacillus rhamnosus GG (7) 和 Lacticaseibacillus casei YIT 9018 (8) 进行了封装；
(7?11) 还有报道使用藻酸钠 (SA) 单独或与乳清蛋白分离物、大米蛋白和豌豆蛋白作为载体材料对酿酒酵母细胞 (9) 以及噬菌体 (感染并杀死细菌的病毒) (10,11) 进行了封装。因此，尽管 ME 具有巨大潜力，但它尚未被用于 PGPM 的封装。

在本研究中，ME 被用于生产含有 Kosakonia pseudosacchari TL13 菌株的藻酸盐胶囊，该菌株被鉴定为一种有前景的生物肥料，可作为有害化学物质的环保替代品来提高农业生产。
(12) 以前曾使用藻酸钠 (SA) 作为分散相制备 W/O 乳液 (7,11,13?19)。通常使用石油溶剂（如煤油 (19)、环己烷 (13)、异辛烷 (14,18) 和石蜡油 (15,17) 作为连续相。在本研究中，石油溶剂被可再生溶剂 d-柠檬烯替代，d-柠檬烯是橙汁工业副产品的主要精油成分。它的使用作为溶剂提取已有充分文献记载 (21)，显示出许多优势，如提高生产效率、减少溶剂和化石能源的使用及有害物质的产生。d-柠檬烯还广泛用作食品和饮料工业中的调味剂和辅助剂，以及化妆品中的香料和其他个人卫生产品成分。由于其广泛的健康益处（包括抗癌、抗焦虑、抗炎、抗氧化、镇痛、抗糖尿病和抗过敏作用），它也被用作农业食品工业中不同配方中的功能成分 (23,24)，这表明它有可能被用作生物杀虫剂和防腐剂。虽然 d-柠檬烯的疏水性和可生物降解性使其成为传统溶剂的良好替代品，但迄今为止尚未考虑将其作为 W/O 乳液中的油相使用。内部 (13,15,16) 和外部 (7,11,14,17?19) 凝胶化与 ME 结合使用钙离子作为二价阳离子来交联藻酸盐乳液。向乳液中加入钙溶液会导致珠粒聚集成更大的团块，因为难以在双相系统中控制凝胶化过程。通常通过在分散相中添加不溶性钙盐并随后降低 pH 值来克服这一限制。另一种方法是在油中使用 CaCl2 乳液，使其与藻酸盐滴液接触时发生离子交联。只有一项研究将这种程序与 ME 结合使用 (19)。

在本研究中，研究了使用 CaCl2 乳液交联藻酸盐乳液的效果，评估了 CaCl2 乳液组成和交联反应时间的影响。

PGPM 广泛应用的主要障碍之一是它们的成本竞争力相对于传统肥料和农药而言较低。尽管具有环境效益，但生物刺激剂的生产成本往往较高。由于食品废弃物含有高有机物质且产量大，因此将其转化为有价值的产品是一种有前景的技术，具有高效率和广阔的应用前景，可以减少食物损失和对全球资源的压力，并提高可持续性。发酵后，目标产品的回收是一个关键问题，因为缺乏绿色和经济可行的方法。本研究还评估了发酵过程的效率和环境影响，考虑了将柑橘废弃物转化为 K. pseudosacchari TL13 生物质和外多糖 (EPS) 的过程，这两者都是封装材料的组成部分，从而简化了过程并提高了整体可持续性。

总体而言，本研究提出了一种从生物反应器发酵到封装的集成可持续生物刺激剂生产方法。使用废弃物（橙皮废弃物）作为生物质生产来源和乳液制剂成分（柠檬烯）符合欧盟的新环境政策，旨在最小化浪费并生产创新和环保的产品。预计这些成果将为进一步研究基于膜技术的 PGPM 封装过程铺平道路，这些技术能够确保高作物产量和营养质量，同时减轻环境变化的影响。

**材料与方法**
所有试剂（藻酸钠、氯化钙、柠檬烯、异辛烷和 Span 80）均从意大利 Merk Life Science S.r.l. 购买。K. pseudosacchari TL13 由意大利那不勒斯费德里科二世大学农业科学系提供。

**通过 ME 制备藻酸盐乳液**
使用配备圆形标准圆盘膜（整个表面分布有孔洞，有效横截面积为 2.76 cm2，孔径为 20 μm）的分散细胞（图 1）制备 W/O 乳液，该膜由 Micropore Technology 提供。使用辛基膦酸 (OPA) 在不锈钢膜上形成疏水涂层，遵循公司的协议。分散相使用 2% w/w 的藻酸钠溶液，连续相使用 2% w/w 的柠檬烯（或异辛烷）和 2% w/w 的 Span 80。

**研究乳化过程的流体动力学条件**
通过以 0.1 至 0.6 mL min–1 的流速（相当于分散相通量 7 至 42 L h–1 m–2）将 3 mL 分散相通过膜孔，同时通过将搅拌器速度设定在 554 至 1109 rpm（相当于剪切应力 3.5–10.7 Pa）来搅拌连续相，从而研究乳化过程的流体动力学条件。还考虑了 W/O 体积比 (v/v %) 在 10 至 30% v/v 范围内的影响。

**将 K. pseudosacchari TL13 封装在藻酸盐乳液滴中**
向 20 mL 2% w/w 的藻酸钠溶液中加入 1 mL 像四钠焦磷酸盐 (16% w/v) 的 K. pseudosacchari TL13 溶液（VWR, Italy），以实现初始细菌接种量与聚合物量的比例范围为 4 × 10^8 至 2.6 × 10^10 CFU g–1。聚合物和细菌溶液作为分散相，按前述方法进行乳化。

**通过外部凝胶化制备钙藻酸盐微球**
评估了两种不同的外部凝胶化策略（图 2）。
(1) 使用 CaCl2 溶液作为分散相和柠檬烯与 Span 80（30 mL）作为连续相，通过常规高剪切乳化方法制备 W/O 乳液。用于获得交联剂乳液的组成和操作条件总结在表 1 中。CaCl2 溶液的体积和浓度分别在 3 至 15 mL 和 0.5 至 2% w/w 范围内。该乳液通过 VELP Scientific VO5 均质机在 10,000–15,000 rpm 速度下、0.5 至 1 分钟的时间内制备，具体取决于最终 CaCl2 乳液的组成。同时，根据 CaCl2 的体积变化，Span 80 的浓度也在 0.05 至 2% w/w 范围内变化。目的是评估不同量的 CaCl2 溶液是否会影响交联反应。在搅拌（300 rpm）下，将 CaCl2 溶液逐滴加入通过 ME 制备的藻酸钠乳液中。还通过分别在 1、3、4 和 24 小时后取样来评估交联反应时间的影响。

**表 1.****CaCl2乳液粒径和组成对藻酸盐微球的影响**

| CaCl2 | CaCl2/SASpan 80 | 膜孔径 | CaCl2乳液浓度 | 藻酸盐微球浓度（% w/w） | 体积（mL） | 摩尔浓度（mol mol–1） | 相对标准偏差（CV）（μm） | 微球粒径（μm） |
|--------------|-------------------|-----------------------|------------|-----------------|-----------------|------------------|----------------:-|
| 2 | 10.05 | 5 | 0.39 ± 0.03 | 10,000 | 0.56 ± 0.5 | 0.3 | 10.05 |
| 3 | 10.00 | 0.5 | 0.39 ± 0.03 | 10,000 | 0.56 ± 0.5 | 0.3 | 10.05 |
| 2 | 10.05 | 0.5 | 0.43 ± 0.03 | 10,000 | 0.43 ± 0.03 | 0.4 | 10.05 |
| 3 | 10.05 | 0.5 | 0.46 ± 0.03 | 10,000 | 0.46 ± 0.03 | 0.4 | 10.05 |
| 3 | 10.05 | 0.5 | 0.52 ± 0.4 | 10,000 | 0.52 ± 0.4 | 0.4 | 10.05 |
| 3 | 10.05 | 0.5 | 0.53 ± 0.4 | 10,000 | 0.53 ± 0.4 | 0.4 | 10.05 |
| 3 | 10.05 | 0.5 | 0.53 ± 0.4 | 10,000 | 0.53 ± 0.4 | 0.4 | 10.05 |
| 3 | 10.05 | 0.2 | 14.5 | 0.50 ± 0.04 | 23.8 | 1.7 | 0.1 |
| 3 | 10.05 | 15 | 16.9 | 0.47 ± 0.03 | 22.4 | 1.6 | 0.1 |

**替代策略的探索：**

通过使用微射流（ME）将CaCl2分散到预先制备的SA乳液中（作为连续相），开发了一种新的方法。为了促进CaCl2以均匀液滴的形式直接分散到乳液中并与藻酸盐液滴接触，使用了一种孔径为5 μm的疏水膜。使用的CaCl2溶液浓度为2%（w/w），并考虑了不同体积（1 mL和3 mL）的影响。分散相的流量和剪切应力分别为7 L h–1 m–2和6.4 Pa。当达到所需的CaCl2/SA乳液比例（v/v）后，停止该过程，并在另一个容器中继续进行交联反应（300 rpm搅拌）。

**交联步骤后：**

通过离心（6000 rpm，10 min）将颗粒从溶液中分离出来，并用水或Ringer’s溶液洗涤以去除残留的交联剂。根据用于交联的CaCl2乳液的组成，可能需要多次洗涤（2–6次），然后进行相同次数的离心循环。

**颗粒观察与测量：**

使用配备相机的光学显微镜（Motic BA310，Motic Europe，巴塞罗那，西班牙）观察颗粒，并使用Motic Image Plus 3.0 ML软件测量颗粒直径。数据以平均液滴直径和变异系数（CV）的形式报告，每个样品测量了100多个液滴。

实验至少重复三次，报告的结果为平均值±标准偏差。

**封装效率与微生物存活率：**

通过ME封装K. pseudosacchari TL13菌株后，通过外部凝胶化过程，评估了其封装效率（EE）。K. pseudosacchari TL13是一种革兰氏阴性、非运动性的杆状内生菌（大约1 μm宽，2 μm长）。

首先将藻酸盐乳液离心（6000 rpm，25 °C，10 min）以诱导相分离，然后将离心后的胶囊悬浮在Ringer’s溶液中（10 mL），通过涡旋搅拌1分钟直至完全打开。然后进行10倍系列稀释（1:10），并用于接种脑心浸出液（BHI；Oxoid，米兰，意大利）琼脂平板。在30 °C下培养24小时后，通过测定形成的菌落单位（CFU）来评估细菌生长。每个样品重复三次实验。封装效率（EE）计算为封装细菌的数量（经过乳化或交联后）与初始藻酸盐溶液中存活细菌的数量之比。

**生物反应器发酵：**

K. pseudosacchari TL13菌株也在生物反应器（Applikon MiniBio生物反应器，Getinge，哥德堡，瑞典）中以批处理模式培养，工作体积为350 mL，温度为30 °C，pH值为6.5（通过添加3 M NaOH和15%（v/v）H2SO4来控制），转速为600 rpm。发酵使用的是通过水解橙皮废物获得的简单可再生培养基。水解过程在生物反应器容器内进行，将橙皮粉末重新悬浮在5 mM醋酸钠缓冲液中，生物量负荷为10%（w/v），并保持pH值为5.2，温度为50 °C；添加1%（v/v）的Cellic-CTec2商业混合物（Novozymes A/S，Bagsv?rd，丹麦）进行反应。24小时后，通过5000 rpm离心20分钟回收上清液，并用作发酵培养基。培养基中补充了13 g L–1的KH2PO4以调节pH值。过程中通过向生物反应器中添加纯无菌氧气维持20%的空气饱和度。发酵结束后，将培养液直接在?80 °C下冷冻2小时，然后在?90 °C下使用台式冻干机（Beta 2-8 LSC plus，Christ，Osterode am Harz，德国）进行升华冻干16小时，随后在0.01 mbar下再进行二次干燥2小时。冻干后的产品分散到藻酸盐溶液中，用于前述的微胶囊实验。藻酸盐溶液中的初始活细胞浓度为2 × 10^9 CFU g–1。

**实验结果与讨论：**

**通过ME制备W/O乳液：**

在将K. pseudosacchari TL13封装到钙藻酸盐微球之前，优化了ME过程的操作条件以获得均匀的液滴。考虑使用柠檬烯作为连续相，并将结果与异辛烷进行了比较。在相同的分散相流量和剪切应力条件下，使用这两种溶剂获得了粒度范围和均匀性相同的颗粒（图4A），这表明柠檬烯可以用作乳液生产中的可再生溶剂，替代异辛烷。研究了分散相流量（图4A）、剪切应力（图3B）和W/O比例（图3D）对藻酸盐乳液液滴平均直径和均匀性的影响。在研究的分散相流量（7–42 L h–1 m–2）和剪切应力（3.5–10.7 Pa）范围内，平均液滴直径从50 μm增加到104 μm，从62 μm减小到43 μm。这些结果与先前的研究一致。（27?29）在所使用的流量和剪切应力条件下，产生了均匀的液滴（CV小于0.2）。只有当剪切应力为3.5 Pa时，CV大于0.2。数据表明，可以增加分散相流量而不影响乳液分布的均匀性，从而使过程的生产率（即获得的藻酸盐颗粒质量）从140 g h–1 m–2增加到840 g h–1 m–2。此外，W/O比例也从10%增加到30%，平均直径和CV基本保持不变，同时将乳液中的藻酸盐浓度从1.8 g L–1增加到4.6 g L–1。

**通过外部凝胶化制备钙藻酸盐微球：**

藻酸盐乳液与通过将一定量的CaCl2均匀加入到柠檬烯中的Span 80溶液中获得的CaCl2乳液进行交联（见表1）。在此过程中，Ca2+离子以小液滴的形式与藻酸盐液滴的外表面接触，增加了其表面积并促进了Ca2+通过连续相的扩散。（30）评估了交联反应时间的影响（图4）。在4小时的反应时间内，观察到藻酸盐微球尺寸略有减小。胶囊尺寸从26 μm减小到22.8 μm，相当于颗粒尺寸相对于乳液液滴尺寸缩小了48%到55%。这种行为可以与外部凝胶化的典型机制相关联。当两种乳液接触时，交联发生在藻酸盐液滴的周边，而它们之间的进一步接触促进了Ca2+通过外部凝胶层的扩散，从而导致液滴核心的固化。（25）基于优化实验，选择4小时作为交联步骤的时间。

**Ca2+乳液组成的调整：**

修改了Ca2+乳液的组成以评估其对交联过程的影响（表1）。无论CaCl2溶液的浓度和体积如何，CaCl2液滴的尺寸几乎都在相同的范围内（5.7 ± 0.9 μm），约为SA液滴尺寸（50 μm）的9倍。获得了大约22.8 ± 0.6 μm且呈球形的藻酸盐微球（图4B），这些微球经过交联过程后的恢复和洗涤程序显示出了良好的抗变形性。当CaCl2/SA摩尔比降低到1（使用浓度为0.5% w/w的CaCl2溶液和体积为3 mL）时，观察到藻酸盐微球的尺寸有所增加（最大达到30 μm），这是由于藻酸盐聚合物链和Ca2+离子之间的交联作用较弱。较低的CaCl2/SA摩尔比可能在藻酸盐液滴的周边形成了半固体膜，而核心仍然保持液态。（31）将藻酸盐液滴浸入更高浓度的交联剂中，进一步促进了Ca2+的扩散，使得固化延伸到液滴核心。此外，数据表明，将CaCl2/SA摩尔比提高到3并不是必需的，因为使用浓度为2% w/w的CaCl2溶液和体积为3 mL即可获得结构良好的微球。即使将CaCl2溶液体积减少到1 mL并保持2% w/w的浓度，也获得了类似的结果（尽管CaCl2/SA摩尔比降至1）。这表明，通过在液滴-液滴界面使用适当浓度的交联剂，可以优化藻酸盐液滴与CaCl2溶液之间的反应。

**从油环境中原位和外部凝胶化后回收藻酸盐微球：**

从油环境中回收藻酸盐微球是该过程的重要步骤。（32）分离时间和水相体积可能会限制大规模生产的发展。（32）降低Span 80浓度（至0.05% w/w）和CaCl2溶液体积（1 mL和3 mL）可以缩短微球与交联反应环境的分离时间，简化整个生产过程。结果表明，ME与使用CaCl2乳液的外部凝胶化相结合，是一种有前景的大规模生产藻酸盐凝胶珠的方法。为了简化扩大规模并使过程连续化，还评估了直接将CaCl2溶液分散到SA乳液中的方法。使用浓度为2% w/w的CaCl2溶液，并考虑了不同体积（1 mL和3 mL）的影响（表2）。

**表2：膜乳化法将CaCl2分散到SA乳液中对藻酸盐微球的影响**

| CaCl2 | CaCl2/SASpan 80 | 膜孔径 | CaCl2乳液浓度 | 藻酸盐微球浓度（% w/w） | 体积（mL） | 摩尔浓度（mol mol–1） | 相对标准偏差（CV）（μm） | 微球粒径（μm） |
|--------------|-------------------|-----------------------|------------|-----------------|-----------------|------------------|----------------:-|
| 2 | 10.05 | 5 | 0.39 ± 0.03 | 10,000 | 0.56 ± 0.5 | 0.3 | 10.05 |
| 3 | 10.00 | 0.5 | 0.39 ± 0.03 | 10,000 | 0.56 ± 0.5 | 0.3 | 10.05 |
| 2 | 10.05 | 0.5 | 0.43 ± 0.03 | 10,000 | 0.43 ± 0.03 | 0.4 | 10.05 |
| 3 | 10.05 | 0.5 | 0.46 ± 0.03 | 10,000 | 0.46 ± 0.03 | 0.4 | 10.05 |
| 3 | 10.05 | 0.5 | 0.52 ± 0.4 | 10,000 | 0.52 ± 0.4 | 0.4 | 10.05 |
| 3 | 10.05 | 0.5 | 0.53 ± 0.4 | 10,000 | 0.53 ± 0.4 | 0.4 | 10.05 |

使用分散相流量为7 L h–1 m–2和剪切应力为6.4 Pa的条件，可以制备出平均直径为50 μm且CV为0.1的均匀液滴，用于制备含有细菌的藻酸盐微球。

通过微射流将CaCl2溶液分散到SA乳液中后，使用表1中指定的方法进行交联。在这个过程中，Ca2+离子以小液滴的形式与藻酸盐液滴的外表面接触，增加了其表面积并促进了Ca2+通过连续相的扩散。（30）评估了交联反应时间的影响（图4）。在4小时的反应时间内，观察到藻酸盐微球尺寸略有减小。胶囊尺寸从26 μm减小到22.8 μm，相当于颗粒尺寸缩小了48%到55%。这种行为可以与外部凝胶化的典型机制相对应。在两种乳液接触时，交联发生在藻酸盐液滴的周边，而它们之间的进一步接触使得Ca2+通过浓度梯度扩散到外部凝胶层，最终导致液滴核心的固化。（25）基于优化实验，选择了4小时作为交联步骤的时间。

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使用分散相流量为7 L h–1 m–2和剪切应力为6.4 Pa的条件，可以制备出平均直径为50 μm且CV为0.1的均匀液滴，用于制备含有细菌的藻酸盐微球。

**结论：**

结合ME和使用CaCl2乳液的外部凝胶化方法，成功地制备了大规模生产的藻酸盐凝胶珠。为了简化放大过程并使其连续化，还评估了直接将CaCl2溶液分散到SA乳液中的方法。使用浓度为2% w/w的CaCl2溶液，并考虑了不同体积（1 mL和3 mL）的影响（表2）。**包封效率与微生物存活**
将PGPM引入土壤并实现其效果，关键在于确保有足够数量的细菌存活。因此，在本研究中，评估了K. pseudosacchari TL13的包封效率，考察了初始细菌浓度对包封效率的影响，以及乳化和交联反应在优化条件下的表现。这些因素是微生物包封成功的关键。以往关于PGPM包封的研究并未明确指出被包封微生物的浓度，即使有所报告，数据也存在较大差异（通常范围在10^6至10^12 CFU g^-1之间）。(1) PGPM的包封产率变化较大，而且经常报告的包封后生物量中的CFU数量较少，这可能与包封过程中生物活性的损失有关（例如海藻酸盐凝胶化及硬化时间的影响）。(33) 将不同浓度的K. pseudosacchari TL13与海藻酸盐溶液混合，得到初始活细胞浓度分别为4.4 × 10^8、4.4 × 10^9和2.6 × 10^10 CFU g^-1（图5）。实验过程中保持海藻酸盐浓度及乳化和交联的操作条件不变。特别研究了基于膜的方法对细菌通过膜孔转移的影响，以此评估其对菌株存活率的影响。

**图5**显示了乳化和交联后的包封效率与初始活细胞浓度之间的关系。高分辨率图像可下载MS PowerPoint幻灯片。

所有初始微生物浓度下的包封效率（EE）范围为95.5 ± 2.5%至97.0 ± 2.8%，表明该方法能够有效保持微生物的活力并实现较高的包封效率，这与先前研究结果一致。(8,9,11) 然而，Camelo-Silva等人报告称，在液滴固化后获得的胶囊的最终包封效率≥93%，但未说明乳化步骤结束时的EE值。(8) 只有Morelli等人具体证明酵母细胞无法通过非曲折的孔道被包封，其包封效率为100%。(9) 总体而言，数据表明基于膜的包封方法是可行的：该过程中的流体动力学条件不会影响细菌存活，且逐滴包封机制确保了包封效果。交联步骤后的EE也有显著变化，表明乳化步骤是限制因素，由于剪切应力较低，导致细胞活力下降（图5）。

**发酵过程效率**
如今已明确，将微生物生物刺激剂用于现代农业是至关重要的；然而，其广泛应用仍面临诸多挑战。(34) 其中之一是制造过程的效率和经济可行性，该过程涉及从培养基设计到保存及制剂制备的多个环节。首先需要使用低成本发酵底物，以最大化生物量产出和可发酵糖的转化率。本研究评估了这一过程的整体效果。据报道，橙子皮中的纤维素和半纤维素含量分别介于9%至37%和10%至18%之间。(35?42) 基于文献中的最高值（纤维素34.13 ± 2.9%、半纤维素12.9 ± 4.1%），对一家意大利Calabria地区果汁生产公司的废弃物生物质进行酶分解后发现，约88%的纤维素和79%的半纤维素分别转化为葡萄糖和木糖（公式1和2）。

发酵过程中消耗的葡萄糖分别转化为8.0 ± 0.4 g L^-1的干生物质和9.4 ± 1.4 g L^-1的胞外多糖（EPS），对应的YP/S为0.25 g g^-1，YP/S为0.30 ± 0.04 g g^-1。所使用的培养基和发酵条件同时促进了两种增值产物的生成——生物质和EPS，以便在最终制剂中加以利用。Kosakonia菌株通常会产生富含岩藻糖的异聚糖（还含有葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和丙酮酸），在生物技术领域具有多种潜在应用。

考虑到生物质、EPS、乙酸和乳酸为主要发酵产物，以及葡萄糖为唯一碳源（未消耗木糖），碳平衡计算结果显示（表3），约22%的碳存在于未测量的含碳产物中；由于K. pseudosacchari采用需氧代谢，这部分碳很可能以二氧化碳的形式释放，这在葡萄糖代谢中很常见。

综上，整个发酵过程的转化效率（ηglobal）为0.48 g g^-1，其中纤维素转化为葡萄糖的转化效率（ηcellglu）为0.88 g g^-1，葡萄糖转化为生物质和EPS的转化效率（ηgluX_EPS）为0.25 + 0.30 = 0.55 g g^-1。在添加酵母提取物和NaNO3的甘蔗汁培养基上生长的K. pseudosacchari表现出较高的YP/S（0.52 g g^-1）但较低的XY/S（0.06 g g^-1）。(43,44) 本研究结合了高水解效率和高的附加值产物产率，使这一过程成为将纤维素高效转化为富含EPS的生物刺激剂生物量的可行且可持续的方法。EPS不仅具有抗菌潜力，还有助于微生物在根际定殖的初期附着。

**K. pseudosacchari TL13基生物刺激剂的生产**
多种因素影响微生物生物刺激剂的应用效果。本研究重点关注了两个方面的可持续性和生物制剂效率：(1) 上游过程利用可再生废弃物，无需生物质预处理（减少污染物生成），且水解效率高，产生大量可发酵糖；培养基完全基于水解物，无需额外氮源，显著降低成本，同时促进高浓度生物质和EPS的生成；(2) 下游过程简化了分离步骤，直接使用全部发酵液作为生物刺激剂原料，不仅降低了下游处理和废弃物处理成本，EPS还能在后续加工及产品储存过程中保护细胞。高浓度的EPS在冻干过程中与海藻糖同等有效地保护细胞。(46) 此外，EPS在制剂中的存在还有助于促进植物与微生物间的相互作用，增强微生物对环境条件的抵抗力。

生物反应器发酵与膜乳化结合使用，生产含有发酵产物的海藻酸盐胶囊（图6）。优化条件使得颗粒大小统一（25 ± 1.3 μm），包封效率达到94.9 ± 10.6%，起始活细胞浓度为2 × 10^9 CFU g^-1。由于ME过程的高度重复性，这一结果虽在意料之中但并不明显（通常负载物为纯物质或定义培养基中的细胞）。据我们所知，这是首例直接用ME过程包封整个发酵液（包括EPS）而不需额外步骤的案例。此前曾有研究将从橄榄厂废水流中纯化和浓缩的多酚化合物通过油水乳液法成功包封。(47)

**环境影响评估**
根据公式3计算，若将橙子皮废弃物计入总废弃物质量，生物反应器发酵的环境影响因子（E-factor）为6.2：
$$
E-\text{factor} = \frac{\text{废弃物质量（橙子皮+酶+缓冲液+盐）?\text{产物（微生物生物质+EPS）}}{\text{产物（微生物生物质+EPS）}
$$
若将木质纤维素废弃物视为既存废物（公式4），E-factor为0.46。

生物过程的环境影响评估较为复杂，相关参考文献有限。Becker等人报告了大肠杆菌BL21生产及纯化过程中E-factor的完整计算值（37.835）。(48) 本研究采用了简化的计算方法，但由于发酵介质简单且无需纯化步骤，E-factor值较低。同样根据公式5计算了膜乳化和交联反应的E-factor。(49?51)

对于颗粒生产，还需考虑溶剂（包括水）的贡献及总体E-factor。（50,51）表4总结了相关数据。结果表明，薄膜乳化法生产K. pseudosacchari TL13负载海藻酸盐微球的过程中，溶剂和水的贡献显著（%溶剂 + 水占总试剂质量的百分比分别为98.78%和950%）。考虑到柠檬烯作为一种更环保的溶剂，整个微球生产过程具有可持续性。此外，如果将生物刺激剂视为精细化学行业的一部分（该行业的E-factor通常在5至50之间），则这种综合工艺有望促进污染预防和可持续生产。

**结论**
尽管生物刺激剂具有环保优势，但在农业中的广泛应用仍存在障碍，亟需在配方和生产工艺上进行创新。在本研究中，评估了一种集成生产过程的潜力，该过程结合了生物反应器发酵和微胶囊化（ME）技术，用于生产和封装K. pseudosacchari TL13作为有前景的生物肥料。ME技术被提出作为一种创新且可持续的方法，用于生产用于封装K. pseudosacchari TL13的海藻酸微球。实验数据表明：（i）柠檬烯可以作为可再生溶剂替代异辛烷用于乳液的生产；（ii）在所研究的分散相流量（7–42 L h–1 m–2）和剪切应力（3.5–10.7 Pa）范围内，液滴的平均直径从50 μm增大到104 μm，同时从62 μm减小到43 μm；（iii）在不影响乳液分布均匀性的前提下，可以增加分散相流量，从而提高生产效率；（iv）随着乳液中海藻酸浓度的增加（从1.8 g L–1增加到4.6 g L–1），W/O（水/油）体积比从10%增加到30%，同时平均直径和变异系数（CV）基本保持不变。通过串联连接两个ME装置（一个用于生产SA乳液，另一个用于生产CaCl2乳液），实现了连续模式的液滴生成和外部凝胶化反应，这似乎是大规模生产海藻酸凝胶珠的一种有前景的方法。实验获得了较高的封装效率（EE > 95%）。使用橙皮废弃物作为微生物发酵的底物，生物反应器发酵将超过一半的纤维素转化为生物质和高附加值产品。该过程结合了高的水解效率和高的总附加值产品产量，使其成为一种高效且可持续的微生物途径，能够将纤维素转化为富含EPS的生物刺激剂生物质，并通过ME技术进行封装。所开发的集成工艺有望促进K. pseudosacchari TL13或其他PGPM的广泛应用，作为一种可持续且高效的微生物生物刺激剂生产及制剂方法。