一种基于镧系的快速灵敏荧光微球免疫层析检测方法，用于半定量检测家禽中的传染性法氏囊病病毒

《Poultry Science and Management》：A rapid and sensitive lanthanide-based fluorescent microsphere immunochromatographic test for semi-quantitative detection of infectious bursal disease virus in poultry

　　摘要
传染性法氏囊病病毒（IBDV）是一种主要的免疫抑制性病原体，对全球家禽生产构成威胁。 Highly virulent (vvIBDV) 和新型变异株（nVarIBDV）的出现增加了病毒的免疫逃逸能力，降低了疫苗的有效性，这凸显了快速可靠诊断工具的必要性。为了推动通常耗时且需要专业实验室设施的抗原检测技术的发展，本研究开发了一种简单、快速、敏感的荧光微球免疫层析试纸（FM-ICTS），用于半定量检测IBDV抗原。FM-ICTS 使用镧系荧光微球与抗VP2单克隆抗体结合，在双抗体夹心侧向流动格式中构建。通过优化反应条件，并使用灭活的IBDV（B87株）系列稀释液建立了定量标准曲线。该检测方法在15分钟内产生稳定的荧光信号，并显示出高分析灵敏度，能够检测到稀释比为1:5120的IBDV抗原。未观察到与鸡贫血病毒（CAV）、禽白血病病毒（ALV）、禽流感病毒（AIV）或马立克病病毒（MDV）的交叉反应，证实了其优异的特异性。重复性测试显示变异系数低于10%。在使用50个临床样本进行评估时，FM-ICTS与国家标准RT-PCR方法的一致性达到95%，并准确识别了vvIBDV、经典传染性法氏囊病病毒（clIBDV）和nVarIBDV株。凭借显著的成本优势和相对定量能力，所开发的FM-ICTS成为适合现场诊断和疫苗质量监测的候选方法。

背景
传染性法氏囊病（IBD）是家禽行业中最具影响的免疫抑制性疾病之一，已给中国和全球的家禽产业造成了巨大的经济损失[1,2,3]。感染IBDV会导致年轻鸡只的法氏囊萎缩，这是关键的免疫器官，从而导致严重的免疫抑制。这种免疫受损状态增加了对继发感染的易感性，并显著降低了疫苗的效果[4]。IBDV是一种双链RNA病毒，其基因组由两个不同的片段组成[5]。A片段编码VP2蛋白，该蛋白不仅是病毒的主要结构成分，在毒力、抗原变异和细胞亲和性中也起着关键作用[6,7,8]。VP2基因包含一个高度变异的区域，尤其是在206aa-350aa之间，这是病毒中和和宿主细胞受体结合的关键抗原域[9]。
clIBDV于1957年首次在美国被发现。1987年出现了一种能够逃避基于经典株疫苗诱导的免疫力的突变株[10]。不久之后，vvIBDV出现并迅速在全球范围内传播，导致高死亡率并引发严重关切[11]。最近，家禽业又面临nVarIBDV的出现所带来的新挑战。研究表明，nVarIBDV可以逃避针对clIBDV和vvIBDV开发的疫苗提供的免疫保护[12, 13]。然而，新疫苗的开发需要相对较长的时间。因此，迫切需要建立快速有效的诊断工具，以准确区分感染群体和未感染群体，从而帮助减少疾病传播。
目前，有几种方法可用于临床检测IBDV，包括琼脂凝胶沉淀试验（AGPT）和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。尽管每种方法都具有特定的诊断价值，但它们也存在显著的局限性。琼脂扩散试验的灵敏度有限，需要较长的时间，并且结果解释具有高度主观性，仅适用于初步筛查，无法检测到病毒载量低或弱阳性样本。虽然RT-PCR具有高灵敏度，但它依赖于精密仪器和标准化的核酸预处理协议。此外，它还容易受到样本抑制剂和气溶胶污染的干扰，并且缺乏评估病毒活性的能力。其在现场检测中的应用存在重大限制，特别是在农场和资源有限的地区难以及时检测。许多现有技术耗时、劳动密集，需要熟练的技术人员以及昂贵的仪器和设备[14, 15]。因此，迫切需要开发更简单、更快速的检测方法，这些方法不需要精密设备。
由于速度快且操作简单，侧向流动免疫测定（LFIA），特别是胶体金免疫层析测定（GICA）在临床诊断中广泛用于多种疾病的检测[16,17,18]。然而，随着GICA应用的广泛化和研究的深入，一些局限性也变得明显。这些局限性包括由于肉眼观察导致的主观解释和相对较低的检测灵敏度[19]。此外，GICA仅提供定性结果，无法进行定量测量。为了克服这些限制，越来越多地使用创新的纳米材料，如嵌入荧光染料的微球来提高灵敏度并实现更可靠的检测。
时间分辨荧光微球（TRFM）由微量镧系元素（例如Eu3?、Tb3?、Sm3?、Dy3?）嵌入微球基质中组成。在紫外光源激发下，这些微球会发出具有独特荧光特性的光。它们的长荧光寿命、大的斯托克斯位移和高荧光强度显著提高了检测灵敏度和准确性，使得TRFM特别适合检测低浓度的物质[19,20,21]。传统的免疫层析技术因其高通量能力而受到重视。当加入荧光微球（FM）时，形成了荧光微球免疫层析（FMIA），不仅保持了高通量检测，还显著提高了更精细诊断应用的灵敏度[22]。FMIA的一个关键优势是其能够通过使用荧光分析仪测量荧光信号强度来定量评估病毒载量，从而提高了结果的准确性和可靠性。FMIA已在多种实际应用中得到广泛应用。在传染病的快速诊断中，FMIA用于SARS-CoV-2抗原和抗体的检测[23]。其检测限显著高于传统的胶体金试纸，为早期筛查和流行病监测提供了可靠的工具。在动物健康领域，FMIA的应用正在深刻改变动物疾病监测和食品安全监测的格局。对于重要动物疾病，如非洲猪瘟（ASF）[24]、口蹄疫（FMD）[21]和禽流感（AI）[25]，基于FMIA的试纸能够实现超早期、高灵敏度的病毒抗原或抗体检测，为疫情早期预警和畜牧业中的决策提供了宝贵时间。
在这项研究中，我们使用荧光微球作为高效的荧光探针，并通过精确的化学偶联技术将针对IBDV的抗IBDV单克隆抗体（IBD-mAb）共价连接到微球表面。这种方法基于双抗体夹心原理，构建了基于荧光微球的免疫层析试纸（FM-ICTS）。因此，我们的研究旨在利用特定的抗体-抗原识别机制，开发出一种高效、灵敏的IBDV检测方法。

材料与方法
临床样本和菌株
40个阴性样本来自健康鸡或疫苗，包括31个阴性组织样本（来自不同组织：12个来自法氏囊，7个来自脾脏，5个来自血液，4个来自鸡胚胎，3个来自泄殖腔拭子），6个疫苗样本（3个来自鸡胚胎来源的疫苗，3个来自细胞来源的疫苗），以及3个细胞培养物。RT-PCR检测确认它们均为阴性。
共从山东省滨州市动物科学与 Veterinary Medicine Academy 的山东省家禽产业和技术系统收集了50个样本。每个样本分为两部分：一半储存在-80°C以备后续FM-ICTS检测，剩余部分用于核酸提取进行RT-PCR分析。样本信息见表1。
IBDV疫苗株B87由中国国家食品药品监督管理局（北京）提供。

表1 50个样本的基本信息

样本制备
将组织样本（如法氏囊和脾脏）用无菌剪刀仔细剪碎并彻底匀浆以制备组织匀浆液。经过2-3次冻融后，以10,000 rpm的速度离心10分钟，收集上清液作为测试样本。疫苗样本用疫苗稀释剂重新悬浮至原体积，然后离心收集上清液。细胞培养物直接离心收集上清液以备后续使用。

荧光微球探针的制备
为了激活荧光微球，依次向100 μL荧光微球（365/610 nm，1%固体；南京微检测生物技术有限公司，南京，中国）中加入0.4 mL硼酸盐缓冲液（0.05 M，pH 8.2）和15 μL 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC, 10 mg/mL; Sigma Aldrich）。在室温下轻轻摇匀15分钟。然后以12,000 rpm的速度在10°C下离心10分钟以去除上清液，并将其重新悬浮在0.5 mL相同的硼酸盐缓冲液中。超声处理1分钟后，加入40 μg单克隆抗体-1 (mAb-1; 洛阳古硕生物技术有限公司，河南，中国)，并在摇床中孵育2小时。然后加入牛血清白蛋白（BSA）至最终浓度1%，再孵育2小时。最后，离心微球，将其重新悬浮在0.1% BSA的硼酸盐缓冲液中（0.05 M，pH 8.2），再次超声处理，并储存在4°C直至进一步使用。

FM-ICTS的组成和实施
FM-ICTS组装在塑料基板上，包括样品垫、结合垫、吸收垫和硝化纤维素（NC）膜（上海洁益生物技术有限公司，上海，中国）。使用BioDot-XYZ3210喷雾器（Irvine, CA, USA）将mAb-1–荧光微球复合物涂布在结合垫上。山羊抗小鼠IgG和抗IBDV mAb-2分别固定在NC膜上作为对照线（C线）和测试线（T线）。试纸被切成4.0 × 80 mm，包装并干燥保存直至使用。
来自IBDV感染鸡的法氏囊和脾脏组织被匀浆，溶解在PBS（0.01 M，pH 7.2–7.4）中，上清液与样品稀释液（含有0.3% BSA和0.2% Triton X-100的PBS）混合。向每个试纸添加65 μL样本，使样本迁移。IBDV抗原与mAb-1结合在T线处被捕获，产生荧光信号，通过荧光免疫分析仪（南京微检测生物技术有限公司，南京，中国）进行测量，而过量的mAb-1到达C线作为对照。C线信号弱或缺失表示操作不当、试纸故障或样本干扰。FM-ICTS在检测过程中的反应过程见下图1。最后，通过荧光免疫分析仪计算T/C值（即T线峰值面积除以C线峰值面积）。

图1
FM-ICTS在检测过程中反应过程的示意图。试纸包括样品孔、结合垫、含有测试（T）和对照（C）线的硝化纤维素膜以及吸收垫。样品与缓冲液混合后横向流动，IBDV与荧光mAb-1结合。复合物被捕获在T线处，过量的结合物结合在C线处，荧光在紫外光下可视化或通过荧光分析仪测量。（用BioRender创建。Wu, Y. (2024) BioRender.com/f14s606）

FM-ICTS反应条件的确定
为了确保FM-ICTS的准确性，将阳性和阴性样本以1:50的比例稀释后加入样品孔中。在室温下每2分钟测量T线和C线的荧光，并计算T/C比率。当T/C比率稳定时，就定义了解释时间。对于T线的优化，mAb-2的浓度分别设置为0.2、0.4、0.6和0.8毫克/毫升，而C线抗体的浓度固定为1毫克/毫升。样本被稀释1:50，然后选择产生最高T/C比率的阳性样本浓度作为最佳浓度。

在使用FM-ICTS进行定量IBDV检测时，采用了用β-丙内酯灭活的B87疫苗株（10^4.5 TCID50/0.1毫升）作为标准。将样本孔进行两倍系列稀释（2^1–2^12），并测量T/C值。生成标准曲线，并计算决定系数（R^2）来评估拟合度。

为了确定FM-ICTS的阈值，测试了40个通过国家RT-PCR标准（GBT19167-2020dz）[26]验证的IBDV阴性样本。测量T/C值，并将阈值设定为平均值（X）加上三个标准差（X + 3SD）。

系统的敏感性、特异性和重复性在三个独立的实验中进行了系统评估。为了确定检测限，IBDV阳性样本被进行10倍系列稀释，从1:10到1:10,240，然后将结果与阈值进行比较。特异性测试是针对含有其他常见禽类病毒（包括CAV、ALV、AIV和MDV）的样本进行的，以排除交叉反应。对于重复性分析，在相同条件下重复测试了从1:10稀释到1:320的IBDV阳性样本，以验证检测法的重复性和一致性。

在15分钟内，T线和C线的荧光强度及其相应的T/C比率被测量。所有值在15分钟后稳定下来，这被选为最佳解释时间（图2A）。不同mAb-2涂层浓度的评估显示，0.4毫克/毫升产生了最强且最稳定的T线信号，同时对阴性样本的背景干扰最小（图2B）。

使用两倍系列稀释（2^2–2^12）的灭活IBDV（B87株）构建了标准曲线。获得了一个拟合度很高的非线性回归模型（R^2 = 0.9861），定义了半定量检测范围（图3A）。在极高的病毒浓度（2^1稀释）下，由于钩效应，T/C值下降。

测试了40个RT-PCR阴性的样本，得出的临界值为0.0152，计算方法为平均T/C值加上3个标准差。高于此值的样本被认为是阳性的（图3B）。

通过便携式紫外灯观察，灭活IBDV的序列稀释显示，检测限为1:5120。稀释到1:10240的样本产生的T/C值低于阈值（图4B），这与紫外光下的视觉结果一致（图4A）。B87株的初始浓度为10^4.5 TCID50/0.1毫升。结果表明，该检测方法能够在最低浓度4.01 TCID50时识别IBDV。与一些使用酶联免疫吸附测定（ELISA）[27]和RT-PCR [14]的已发表论文相比，FM-ICTS显示出更高的敏感性，强调了其在非常低浓度下检测IBDV的能力。

针对CAV、ALV、AIV和MDV的测试确认，只有IBDV阳性样本产生了高于阈值的T线荧光。没有观察到交叉反应（图5A–B）。

在三个重复的检测中，每种稀释度（1:10–1:320）的所有变异系数（CV）值都低于25%，最大CV为8.31%，平均值为4.88%（见表2）。

总共使用FM-ICTS和国家标准RT-PCR [28]测试了50个临床样本。RT-PCR检测到40个阳性样本，而FM-ICTS检测到38个。测序引物分别为：F: CGGATCCATGACAAACCTGCAAGAT，R: CCAAGCTTCACAGCTATCCTCCTTAG。阳性PCR产物被送往Sangon Biotech[上海]有限公司进行Sanger测序。测序确认在RT-PCR阳性样本中有23个vvIBDV、9个clIBDV和8个nVarIBDV。根据标准中规定的符合率算法（WS/T 505–2017）[29]，FM-ICTS和RT-PCR之间的总体一致性率为95%（表3）。对于两个RT-PCR阳性但FM-ICTS检测阴性的样本，使用鸡胚接种进行了重新检测，结果仍然为阴性。追踪这些样本的来源后，我们发现它们来自山东省以外的农场提交的肝脏和血液样本。我们推测，长时间运输或存储不当可能破坏了病毒的完整性。

IBD继续对全球家禽的健康和生产力构成重大威胁。由于vvIBDV和nVarIBDV的出现，IBDV的流行病学情况变得越来越复杂，这些病毒常常能够逃避免疫疫苗所赋予的免疫保护[10, 11, 13]。VP2高变区（HVR）快速进化，决定了抗原性和毒力，从而增加了诊断的复杂性[6, 9]。因此，及时的现场诊断对于控制疫情、指导疫苗接种策略和支持监测计划至关重要。然而，现有的方法如RT-PCR、ELISA和AGPT需要训练有素的人员、实验室基础设施以及较长的周转时间[14, 15]。此外，尽管GICA提供了快速的现场检测，但它们的缺点是灵敏度低和需要主观的视觉解释[16, 30]。

本研究通过开发一种时间分辨的FM-ICTS来应对这些挑战，利用了镧系荧光探针的优势。这些微球具有延长的荧光寿命、较大的斯托克斯位移和高信号稳定性[20, 22]，可以实现定量和敏感的检测，适用于现场和资源有限的场景。优化反应条件对于快速诊断检测的可靠性至关重要。15分钟的最佳解释时间的确定表明，在所建立的检测格式下，抗原-抗体相互作用迅速达到平衡。这与其他基于镧系的LFIA系统一致，这些系统通常在10–20分钟内显示出稳定的信号形成[31]。将T线抗体浓度优化至0.4毫克/毫升，确保了强结合亲和力，同时避免了空间干扰或非特异性吸附。适当的抗体密度对于维持信噪比和防止弱阳性掩盖至关重要——这是传统GICA方法中常见的挑战[30]。

本研究的一个关键进展是建立了病毒载量和荧光强度之间的定量关系。对于非线性标准曲线观察到的高拟合度（R^2 = 0.9861）表明，在2^2–2^12的稀释范围内，T/C荧光值与病毒浓度有很强的相关性。这与先前的研究结果一致，即基于镧系的免疫层析法支持荧光强度和抗原载量之间的稳健定量关系[20, 31]。在极高病毒浓度（2^1稀释）下观察到的钩效应反映了免疫测定中先前报告的抗原过剩现象，即T线信号在高抗原水平下饱和或下降[32]。这强调了控制样本稀释的必要性——特别是对于组织匀浆或高滴度疫苗材料，以保持定量准确性。重要的是，系统的有效检测范围与现场样本和商业疫苗中遇到的病毒载量相符，突显了其在诊断和疫苗质量监测中的实用性。使用阴性样本来建立客观阈值（T/C = 0.0152）解决了基于胶体金的检测方法的主要局限性，即主观视觉解释[16]。定量阈值减少了操作者的偏差，并确保了实验室间的一致解释。这类基于阈值的系统推荐用于高通量监测和农场内的快速决策。

在分析性能方面，FM-ICTS显示出比传统方法更高的敏感性。该检测方法成功地在高达1:5120的稀释度下检测到IBDV抗原，最低可检测的病毒载量为4.01 TCID50，远高于许多报道的ELISA和RT-PCR方法[14, 27]的检测能力。这种高灵敏度归因于微球的高荧光强度，允许在比胶体金检测更低浓度下识别物质[17, 30]。早期检测对于限制群体免疫抑制和相关的继发感染至关重要。

与CAV、ALV、AIV和MDV的交叉反应不存在，证实了所用抗VP2单克隆抗体的高特异性。这与VP2的独特结构和抗原决定因素一致[7, 8]。本研究中建立的特殊临界阈值（T/C > 0.0152）进一步消除了GICA中肉眼观察的主观性[22]，提供了一个标准化的结果解释指标。特异性是现场诊断的绝对要求，特别是考虑到家禽群体中共感染的普遍性。IBDV经常与其他免疫抑制或致癌病毒（如CAV、ALV和MDV）一起存在[32, 33]。FM-ICTS未与这些常见禽类病原体发生交叉反应，证实了该检测依赖于高度特异性的抗体-抗原识别机制。

检测的低变异系数（平均4.88%）展示了出色的检测内精密度，并符合横向流动诊断的可重复性标准[34]。FM-ICTS和国家标准RT-PCR结果之间的高一致性（95%）突显了该系统在现场诊断中的可靠性。重要的是，FM-ICTS成功识别了vvIBDV、clIBDV和nVarIBDV株，支持其对多种基因型的广泛反应性。鉴于不断出现具有增强致病性和免疫逃逸潜力的新型重组株[11, 12]，能够快速检测多种基因型的检测方法尤其有价值。此外，定量病毒载量的能力提供了传统定性试纸所不具备的额外优势，支持疾病分期、疫苗效果评估和病毒脱落模式的监测。

该试纸易于使用、快速且高效。整个检测过程（包括样本制备）不超过30分钟，允许在现场对样本进行筛查。所需设备的估计成本约为300美元，每条试纸的成本不到1美元，提供了显著的成本优势。由于当前条件和研究范围的局限性，该方法仍有改进的空间。本研究中开发的荧光微球免疫测定系统目前需要在标准校准曲线的相关性方面进一步改进。此外，通常需要高质量的样本，并且必须严格控制荧光微球的存储条件。此外，还需要系统地调查和优化某些核心反应参数。上述领域将作为我们研究小组的关键优先事项和核心研究课题，我们将在未来的研究中继续改进它们。

总之，在这项研究中，我们开发了一种通过将镧系荧光微球与LFIA技术集成来快速定量检测IBDV的方法。FM-ICTS表现出强大的性能，显示出高灵敏度、特异性和重复性。这为临床环境中IBDV的快速筛查和诊断提供了宝贵的技术支持。该方法还显示出在监测IBDV疫苗质量等应用方面的潜力。此外，由于该系统使用基于单克隆抗体的荧光微球，只需更换具体的单克隆抗体，就可以适应检测其他病毒，强调了其广泛的实用性。