利用HPLC-DAD联用陷阱离子迁移谱和高分辨率串联质谱技术对葡萄藤中的芪类化合物及其光降解产物进行表征

《RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY》：Characterization of Grape Cane Stilbenoids and Their Photo-Degradation Products by HPLC-DAD Coupled With Trapped Ion Mobility Spectrometry and High-Resolution Tandem Mass Spectrometry

　　**摘要**

**研究背景**
葡萄提取物中的生物活性(E)-芪类化合物容易在光照作用下转化为相应的(Z)-异构体及进一步的降解产物，这通常会导致其生物活性的丧失。鉴于自然界中芪类化合物的多样性，我们试图研究除已广泛研究的白藜芦醇之外的其他芪类化合物的降解过程。

**方法**
九种纯度大于99%的单一芪类化合物以及一种富含芪类化合物的葡萄藤提取物被人工阳光照射，其光降解产物通过液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）、电喷雾离子化（ESI）、陷阱离子迁移谱（TIMS）和四极杆飞行时间高分辨率串联质谱（QTOF-HR-MS/MS）技术进行了分析。

**结果**
在光照处理的标准溶液和葡萄藤提取物中，共鉴定出45种不同的转化产物。首次报告了葡萄藤芪类化合物（154.8–286.4 ?2）及其降解产物（116.5–289.3 ?2）的碰撞截面值。TIMS技术能够分离出那些通过色谱法难以区分的异构体和同位素光降解产物，例如某些三羟基菲并二酮类化合物。

**结论**
这些结果展示了结合液相色谱、TIMS和HR-MS/MS技术分析这类化合物的潜力，有助于更深入地了解葡萄藤芪类化合物的光降解途径，超越了目前对白藜芦醇的研究范围。

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**1 引言**
芪类化合物是一类具有多种生物活性的酚类物质，包括抗氧化和抗菌特性。它们被广泛认为是植物抗性物质，在植物抵御环境和生物胁迫的过程中起着关键作用[1]。因此，它们在植物材料（如葡萄藤）中积累，成为制药、化妆品和作物保护行业基于植物开发的潜在目标[2, 3]。作为最著名的芪类化合物，白藜芦醇被认为是60多种天然衍生物的前体，这些衍生物通过糖基化（如piceid）、羟基化（如piceatannol）以及二聚化（如?-viniferin）和寡聚化（如hopeaphenol）等修饰产生，具有不同的生物活性[4]。此外，芪类化合物还存在(E)-和(Z)-异构体形式，其中(E)-异构体通常具有更高的生物活性[5]。已知(E)-和(Z)-异构体在可见光或紫外线照射下会发生转化，随后可能经历其他较少被描述的降解途径。在这方面，(E)-白藜芦醇是研究最深入的芪类化合物，已知其最初会转化为(Z)-白藜芦醇。还有其他非芪类化合物的光降解产物也被报道，如3,4′,5-三羟基二苯乙炔、2,4,6-菲三醇、2-(4-羟基苯基)-5,6-苯并呋喃二酮和类似醛类的转化产物[6-8]。然而，关于其他芪类化合物的光诱导转化信息仍然有限。准确鉴定和量化芪类化合物对于理解其结构多样性和相应的生物活性具有重要意义。迄今为止，分析技术主要依赖于高效液相色谱（HPLC）与质谱（MS）的结合[2]。但由于参考标准的有限，鉴定异构体化合物仍具有挑战性。最近发展的改进型离子迁移谱（IMS）技术对于分析复杂的（异构体）植物成分混合物（如芪类化合物及其降解产物）具有很大价值[9]。IMS技术能够分离异构体化合物，从而提高基于离子迁移值进行鉴定的可靠性。一种称为陷阱IMS（TIMS）的新兴IMS方法利用隧道机制捕获带电离子，并根据其迁移值进行分离[10]。本研究有两个主要目标：首先，在模型溶液中研究九种不同单一且纯度高的芪类化合物在人工阳光照射下的转化情况；其次，评估陷阱离子迁移谱的实用性，并为这些芪类化合物及其光降解产物提供碰撞截面（CCS）值，为缺乏纯参考化合物的化合物提供更可靠的鉴定参数。此外，该研究还探讨了TIMS技术在根据离子迁移值区分异构体芪类化合物方面的可行性。

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**2 材料与方法**

**2.1 化学试剂**
所有(E)-白藜芦醇、(E)-piceatannol、(E)-piceid、(E)-?-viniferin、4-羟基苯甲醛、3,4-和3,5-二羟基苯甲醛以及3,4-和3,5-二羟基苯甲酸的纯度大于99%的参考标准品均购自Extrasynthèse（法国Genay）。(Z)-白藜芦醇购自Biomol（德国汉堡）。根据Macke等人的方法[11]从葡萄藤中分离出的ampelopsin A、hopeaphenol以及r-和r2-viniferin由德国布伦瑞克工业大学食品化学研究所Peter Winterhalter教授的研究小组提供。此外，还使用了乙腈（Merck，德国达姆施塔特）、LC–MS级甲酸（ScienTest-BioKEMIX，德国Leese）和超纯水（Elga Purelab，德国Celle）。(Z)异构体是通过将上述(E)异构体暴露于SOL500太阳模拟系统（Hoenle，德国Gilching）产生的辐射下制备的[12]。10 mM甲酸钠校准溶液的配制方法为：12.5 mL水、12.5 mL异丙醇、50 μL甲酸（LC–MS级，>99%）和250 μL 1 M氢氧化钠水溶液混合。

**2.2 葡萄藤提取物的制备**
葡萄藤提取物的制备方法参照Besrukow等人的研究[13]：将V. vinifera L. Pinot Noir品种的葡萄藤样品切碎、干燥并研磨至约1 mm大小。在室温下，使用80%体积比的水乙醇（固液比1:5，w/v）进行4小时提取，过程中避免光照。乙醇蒸发至总固体浓度约为15%后（Heidolph Hei-VAP Industrial，德国Schwabach），使用Büchi B-290喷雾干燥仪（Flawil，瑞士）进行干燥，干燥条件为进风温度150°C、出风温度80–82°C、进料流速52 mL/min、空气流速5500 L/h。所得粉末在5°C下避光保存以备后续使用。

**2.3 芽类化合物的人工阳光照射**
将芪类化合物标准品分别溶解在5 mL水和乙腈（85/15，v/v）的混合液中，配制成0.1 mM溶液。葡萄藤提取物的制备方法参照Besrukow等人的研究[12]：将250 mg上述葡萄藤提取物粉末分散在25 mL水和乙腈混合液中。粉末提取物中的芪类化合物浓度分别为(E)-白藜芦醇1.62 mM、(E)-piceatannol 0.45 mM、(E)-ampelopsin A 0.04 mM、(E)-?-viniferin 0.04 mM和r-viniferin 0.05 mM。这10种溶液（9种标准品和1种葡萄藤提取物溶液）分别通过0.2 μm玻璃纤维膜（Chromafil Xtra，Macherney-Nager，德国Dueren）过滤后装入棕色和透明玻璃小瓶中并密封。棕色玻璃小瓶用于立即进行HPLC分析（见下文），而透明玻璃小瓶则暴露于SOL500太阳模拟系统（Hoenle，德国Gilching）产生的约14,000 lx照度下2小时。该系统配备风扇机制，保持光照期间环境温度恒定在24°C–25°C。样品与光源之间的距离设置为1 m。光照处理后，透明玻璃小瓶中的样品与未光照处理的棕色玻璃小瓶中的样品一起进行分析。

**2.4 HPLC-DAD-ESI(?)-TIMS-QTOF-HR-MS/MS分析**
芪类化合物的分析使用Bruker Elute UHPLC系统（Bruker Daltonics，德国不来梅）进行，配备Hypersil Gold RP-18柱（内径150 mm × 2.1 mm，粒径3 μm，Thermo Fisher Scientific，德国Dreieich）。流动相由0.1%（v/v）甲酸水溶液（A）和乙腈（B）组成，流速为0.3 mL/min。在40°C下进行21分钟的线性洗脱梯度：0分钟（15% B）、10分钟（50% B）、11分钟（50% B）、12分钟（100% B）、16分钟（100% B）、17分钟（15% B）和21分钟（15% B）。柱温为40°C，进样体积为3 μL。紫外/可见光吸收光谱采用二极管阵列检测器（DAD）在200–600 nm范围内记录。检测波长为280、306和320 nm。HPLC系统与陷阱离子迁移谱仪（TIMS）和四极杆飞行时间高分辨率串联质谱仪（QTOF-HR-MS/MS，timsTOF Pro 2，Bruker Daltonics）连接，电喷雾离子化（ESI）源工作在负离子模式下。毛细管电压为3200 V，雾化器温度为200°C，雾化气体和干燥气体分别为氮气，压力为2.5 bar和6 mL/min。HR-MS和HR-MS/MS谱的测量范围为m/z 20–1300。碰撞诱导解离（CID）的碰撞能量分别为20 eV和50 eV。TIMS使用的氮气由膜基发生器产生，出口压力为7 bar。离子迁移率测量范围为0.45–1.45 Vs/cm2，斜坡时间为100.0 ms。离子电荷控制（ICC）设置为2百万计数。每次分析前，使用Agilent ESI-L低浓度调谐混合物和10 mM甲酸钠校准溶液进行TIMS（线性，搜索范围：0.01 1/K0，强度阈值：3000计数）和MS（高精度校准[HPC]（搜索范围：m/z 0.05，强度阈值：5000计数）的初始校准。每次分析开始时，注入20 μL调谐混合物和甲酸钠校准物的混合液（3:1，v/v）进行内部校准。HPLC系统使用Bruker Compass HyStar版本6.0.30.0操作，MS系统由Bruker otofControl版本6.0.115管理。为了评估CCS测量的重复性，所有使用的芪类化合物及其六种选定的降解产物（均有参考标准品）均进行了三次重复实验（n = 3）。

**2.5 数据处理**
数据使用Bruker DataAnalysis 6.1软件进行处理。通过分离MS1光谱中脱质子分子的提取离子迁移图（EIMs）（[M–H]?），并使用Savitzky Golay算法进行平滑处理（平滑宽度为0.01 [V*s/cm2）来创建离子迁移图[15]。基于主要m/z值（单电荷离子种类）计算CCS值。使用R软件（RStudio版本2026.01.1）中的双样本t检验评估异构体化合物均值之间的统计显著差异（p < 0.05，n = 3）。

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**3 结果与讨论**
芪类化合物的鉴定基于其保留时间（tR）、洗脱顺序、紫外吸收光谱、负电荷脱质子分子[M–H]?的m/z值以及ESI(?)-HR-MS/MS质谱碎片图，同时与九种纯参考标准和文献中的数据进行比较[1]。此外，还研究了离子迁移率和CCS值以提供进一步的鉴别参数。表1列出了九种纯参考标准品，包括单体、二聚体和四聚体芪类化合物，以及它们在强人工光照下2小时后的降解产物。HPLC-DAD-ESI(-)-TIMS-QTOF-HR-MS/MS数据展示了九种芪类化合物（母体化合物，用粗体表示）及其可能的光降解产物，这些数据是通过照射标准溶液获得的。

3.1 单体芪类的降解

3.1.1 (E)-白藜芦醇
(E)-白藜芦醇的化学离子化（CID）产生了以下特征碎片离子：m/z 185.0608 ([M–H–C2H2O]?)、m/z 143.0506 ([M–H–C2H2O–C2H2O]?) 和 m/z 115.0551 ([M–H–C2H2O–C2H2O–CO]?)，这与之前报道的芪类单体的碎片化模式一致[16]。其中消除的C2H2O单元可能代表酮烯（H2C=C=O，计算分子量42.0106 amu）。值得注意的是，m/z 41.0041的碎片离子可能来源于酮烯或其互变异构体乙炔醇（C2HO?，计算分子量m/z 41.0033），这种碎片在大多数芪类的HR-MS/MS谱中都有检测到，并且也是3,5-二羟基苯甲酸的基峰（参见支持信息）。在人工阳光照射下，白藜芦醇发生了多种降解反应，产生了多种不同的产物，证实了之前提出的多种转化途径（参见图1）。首先，m/z 453.1344的质谱峰（表1，#A7）表明存在一种二聚体芪类化合物。通过将其保留时间（tR）和碰撞截面（CCS）与真实标准品进行比较，初步判断该化合物为(E)-?-葡萄素。文献中已有报道指出(E)-白藜芦醇在光照下会发生二聚化[19]。此外，(E)-白藜芦醇的碰撞截面（CCS）值（157.5 ?2，变异系数0.08%）明显小于其二聚体（206.5 ?2）。其次，根据紫外和质谱数据，在照射样品中初步鉴定出二羟基菲醌（表1，#A6，m/z 239.0352），其特征碎片离子与Rodríguez-Cabo等人的研究结果一致[7]，他们指出(E)-白藜芦醇经历了包括异构化、环化、羟基化和氧化等多种反应，生成了多种菲类和醌类衍生物。第三，羟基苯乙基丁二酸（表1，#A2，[M–H]?，m/z 233.0460，对应C12H9O5?）通过其分子式和特征性的HR-MS/MS碎片离子m/z 189.0561和145.0665（分别为[M–H–44]?和[M–H–44–44]?）被初步鉴定，这些碎片离子可能是由两个羧基的脱羧作用产生的。其紫外吸收最大值如预期位于280 nm。同样的方法也被用于初步鉴定羟基苯乙基丁二酸（表1，#A3，[M–H]?，m/z 231.0302）。Dore等人[20]曾提出，酚和间苯二酚可以通过环开裂机制降解为马来酸和富马酸，这一观点也得到了其他研究小组[21, 22]的证实。鉴于(E)-白藜芦醇包含一个通过乙烯基桥与羟基苯基部分连接的间苯二酚结构，这种降解机制也可能适用于此处，从而产生羟基苯乙基丁二酸（#A2），后者可能进一步氧化为其三键衍生物羟基苯乙基丁二酸（#A3），并表现出类似的碎片化模式。很可能，化合物#A2的脱水会生成羟基苯乙基丁二酸酐（表1，#A8，[M–H]?，m/z 213.0195），这一结论是基于其假定的分子式（C12H5O4?）和关键碎片离子[M–H–44]?和[M–H–44–28]?得出的，这些碎片离子分别对应CO2和CO的丢失。据我们所知，这些化合物尚未被报道为白藜芦醇的光降解产物。然而，这里初步提出的结构需要在后续研究中得到验证。早先，Rodríguez-Cabo等人[7]强调了白藜芦醇通过羟基化、氧化和裂解途径降解为“类似醛的转化产物”。在辐照后的(E)-白藜芦醇样品中，我们明确检测到了4-羟基苯甲醛（表1，#A1，[M–H]?，m/z 121.0296），这是通过将其紫外光谱和质量谱与真实参考化合物进行比较后确定的（参见支持信息）。值得注意的是，在m/z 92.0272处检测到的偶数编号产物离子可能类似于脱氢苯氧基自由基阴离子（C6H4O•–），这是由于一氧化碳（CO）的消除后氢（H•）的丢失所致，这在ESI条件下是p-羟基苯甲醛的特征[23, 24]。出乎意料的是，在我们的研究中没有检测到(Z)-白藜芦醇，这与之前的光异构化研究[6, 8, 25, 26]的结果相反。我们认为，本研究中使用的人工太阳系发出的高能量可能导致(Z)-白藜芦醇发生了更广泛的异构化和随后的降解。虽然类似的研究使用了特定的辐照波长（例如365 nm[6]，UV-B8），但本研究中使用的人工阳光的复杂组成可能加剧了(E)-白藜芦醇的降解。在这方面，研究表明，与单独使用可见光相比，E)-白藜芦醇在紫外线和可见光的联合照射下降解更为有效[27]。值得注意的是，在我们的研究中，辐照后的葡萄藤提取物中发现了(Z)-白藜芦醇（详见下文）。此外，三键白藜芦醇衍生物（例如白藜芦醇酮，即3,4′,5-三羟基二苯乙炔）在我们的辐照后的(E)-白藜芦醇样品中并未被检测到，尽管Montsko等人[6]之前曾报道过该化合物是白藜芦醇的光降解产物。

3.1.2 (Z)-白藜芦醇
与辐照后的(E)-白藜芦醇样品类似，也在辐照后的(Z)-白藜芦醇样品（表1，#B0，CCS 154.8 ?2，CV 0.01%）中发现了4-羟基苯甲醛（表1，#B2，[M–H]?，m/z 121.0296）。有趣的是，还检测到了其他“类似醛的转化产物”[6]，即3,4-二羟基苯甲醛和3,5-二羟基苯甲醛（表1，#B1，[M–H]?，m/z 137.0243，均为C7H5O3?，CCS 118.2 ?2）。3,4-二羟基苯甲醛和3,5-二羟基苯甲醛的存在通过真实标准品得到了确认，这两种物质无法通过HPLC-DAD和TIMS分离，但它们的质量碎片化模式略有不同（参见支持信息）。通过真实标准品的CID实验发现，3,4-二羟基苯甲醛的CID产生了一个特征性的偶数编号碎片离子m/z 108.0215（C6H4O2•–，计算m/z 108.0217），这可能是由于醛基团的CHO•丢失所致（参见上文讨论的4-羟基苯甲醛的质量碎片化）。相比之下，3,5-二羟基苯甲醛的CID产生了一个特征性碎片离子m/z 93.0365（C5HO2?，计算m/z 92.9971或C6H5O?，计算m/z 93.0346），这可能是由于C2H4O（计算m/z 44.0262 amu）的丢失或脱羧（CO2的丢失，计算m/z 43.9898 amu）后的重排所致。由于这两种碎片离子都在化合物B1的HR-MS/MS谱中被检测到，我们得出结论：3,4-二羟基苯甲醛和3,5-二羟基苯甲醛都应存在于样品中。此外，辐照后的(Z)-白藜芦醇样品还含有其羟基化衍生物(E)-piceatannol（表1，#B3，[M–H]?，m/z 243.0665，CCS 159.6 ?2），这是通过参考化合物和质量碎片化特征确定的，与文献中描述的(E)-piceatannol的生成过程一致[7]。有趣的是，还检测到了一个与(E)-piceatannol（表1，#B3）具有相同质量的化合物，可能代表(Z)-piceatannol（表1，#B6，CCS 156.9 ?2）。在这方面，E/Z-piceatannol相比E/Z-白藜芦醇多出的羟基部分可能解释了在辐照后的(Z)-白藜芦醇样品中观察到二羟基苯甲醛的原因。在辐照(E)-白藜芦醇时，只发现了单羟基化的4-羟基苯甲醛（见上文）。同样的解释也可能适用于三羟基菲并二酮（表1，#B4和B5，[M–H]?，m/z 255.0301至255.0303，CCS 147.1 ?2，但保留时间不同）的出现，这可能是由于辐照了(Z)-异构体而不是(E)-异构体，可能是由于E/Z-piceatannol的环化作用所致。

3.1.3 (E)-piceatannol
(E)-piceatannol（表1 #C0，[M–H]?，C14H11O4?，m/z 243.0661，CCS 159.5 ?2，CV 0.05%）遵循上述单体茚酚类化合物的质量碎片化模式，分别经历了一次和两次C2H2O的消除，随后伴随着CO的丢失以及脱质子化的酮烯/乙炔的生成。此外，还检测到一个特征性的产物离子m/z 225.0565（[M–H–H2O]?），这可能表明存在3′,4′-二羟基化的piceatannol（在4′-羟基化白藜芦醇的CID过程中并未生成）。与暴露于阳光的白藜芦醇样品类似，(E)-piceatannol的光照射揭示了四种不同的光降解途径。首先，初步鉴定出(Z)-piceatannol（表1，#C7，[M–H]?，m/z 243.0667，CCS 156.9 ?2），可能是通过直接异构化形成的。这一鉴定得到了m/z值和HR-MS/MS碎片化模式的匹配支持，这些特征与(E)-异构体的一致。此外，piceatannol的(Z)-异构体和(E)-异构体之间的CCS值差异（2.7 ?2）与之前观察到的白藜芦醇的E/Z异构化过程中的CCS位移（2.8 ?2）相符。我们强调，单体茚酚类化合物的(E/Z)异构体的信号峰在移动图中的CCS值有显著差异，尽管它们在基线处没有分离（见图S2）。峰值的形状和位置具有高度的可重复性，变异系数低（CV 0.01%–0.75%），这证实了观察到的CCS差异是区分几何异构体的可靠标准，即使峰基在移动图中部分重叠。这些发现清楚地表明，移动图与色谱图有所不同，在色谱图中水平轴通常是保留时间轴。在移动图中，水平轴表示迁移率（1/K0，见图S2）。其次，三种脱质子化分子的[M–H]?，m/z 485.1239至485.1246（表1，#C8/11/13，CCS 207.6，211.1，和211.0 ?2，均为C28H21O8?），被归因于(E)-piceatannol的二聚化。这些假定的二聚体可能进一步经历了两种不同的转化：(i) 氧化，生成氧化的二聚体（可能是类似菲的化合物，如下文描述的(E)-?-viniferin的降解产物，[M–H]?，m/z 483.1085和483.1087，表1 #C12/14，CCS 228.2和223.8 ?2，C28H19O8?）；(ii) 双键的裂解，生成3,4-二羟基苯甲醛（表1，#C2，[M–H]?，m/z 137.0245，通过真实标准品确认）及其假定的对应物α-醛（表1，#C9，[M–H]?，C21H15O7?，m/z 379.0827）。这些裂解转化与(E)-resveratrol的转化过程类似，在(E)-ε-viniferin的部分中有详细阐述。第三，初步的环化过程产生了类似菲的化合物。Rodríguez-Cabo等人[7]也观察到E/Z-白藜芦醇的环化产生了类似的产物，即四羟基菲（表1，#C4）和三羟基菲并二酮（#C5），[M–H]?，m/z分别为241.0506和255.0299。这两种化合物都显示了[M–H–28]?和[M–H–28–44]?碎片离子，分别对应CO和CO2的连续丢失。我们研究中初步观察到的四羟基菲（#C4）的碎片化模式与Rodríguez-Cabo等人的描述一致。CID分析脱质子化分子[M–H]?，m/z 255.0304（C14H7O5?）时，产生了m/z 227.0362（[M–H–28]?）和183.0557（[M–H–28–44]?）的产物离子，这些离子分别对应CO和CO2的丢失。所有测量的m/z值比白藜芦醇的高16 Da，这是由于piceatannol中多了一个羟基。因此，化合物#C5被初步鉴定为三羟基菲并二酮。化合物#C6含有额外的氧原子（[M–H]?，m/z 271.0248，对应C14H7O6?），在HR-MS/MS谱中显示了类似的碎片化模式，产物离子分别为m/z 243.0303（[M–H–28]?）和227.0372（[M–H–44]?），这与Rodríguez-Cabo等人之前报道的白藜芦醇转化产物四羟基菲并二酮（转化产物TP36）一致。最后，通过真实的外部标准品确认了3,4-二羟基苯甲醛（表1，#C2，[M–H]?，m/z 137.0245）的存在。一种未指定的二羟基苯甲酸（表1，#C1，[M–H]?，m/z 153.0193，对应C7H5O4?）也根据其短保留时间与3,5-和3,4-二羟基苯甲酸的真实参考标准品（tR = 2.5 min）相匹配而被初步鉴定。值得注意的是，使用上述HPLC方法无法分辨这些参考标准品，它们的CCS值分别为124.0和121.3。HR-MS/MS谱显示了羧基可能的脱羧产生的共同产物离子，m/z分别为109.0295（[M–H–CO2]?，C6H5O2?），对应脱质子化的二羟基苯（很可能是间苯二酚和儿茶酚）。此外，还检测到了其他共同产物离子，m/z分别为65.0033（C4HO?）和41.0034（C2HO?，对应脱质子化的酮烯/乙炔）。然而，在HR-MS/MS实验中，3,5-二羟基苯甲酸显示出特征性的碎片离子m/z 67.0188（C4H3O?，计算m/z 67.0189），而3,4-二羟基苯甲酸的CID产生了m/z 108.0214（C6H4O2•–，计算m/z 108.0217，参见3,4-二羟基苯甲醛的CID）和91.0187（C6H3O?，计算m/z 91.0189）的碎片离子。这三个碎片离子之前已被提出用于区分间苯二酚和儿茶酚[28]。由于所有上述产物离子都在#C1的HR-MS/MS谱中被检测到，我们可以得出结论：3,5-和3,4-二羟基苯甲酸都存在于样品中。这表明(E)-piceatannol经历了光诱导的直接裂解，随后通过环开裂生成了相应的酸，这与白藜芦醇的转化过程类似。这些化合物的结构比从白藜芦醇及其二聚体/四聚体衍生的化合物多一个氧原子（即4-羟基苯甲醛），可能来源于piceatannol或其二聚体的裂解。

3.1.4 (E)-Piceid（白藜芦醇3-O-β-D-葡萄糖苷）
对糖基化的(E)-白藜芦醇衍生物(E)-piceid（表1，#D0，[M–H]?，m/z 389.1242，C20H21O8?）进行CID分析后，去除了葡萄糖基团（C6H10O5，计算m/z 162.0528 amu），得到了脱质子的苷元([M–H–162]?），同时也在白藜芦醇的HR-MS/MS谱中发现了相应的碎片离子。辐照后，我们初步鉴定出了一种二羟基菲并二酮（表1，#D10，[M–H]?，m/z 239.0352）和一种假定的羟基苯乙基丁二酸酐（表1，#D11，[M–H]?，m/z 213.0195），其生成机制与(E)-白藜芦醇的降解产物一致，这里还包括了(E)-piceid糖基团的水解消除。同样，4-羟基苯甲醛（表1，#D6）的检测结果也与辐照后的(E)-白藜芦醇样品的结果一致。此外，我们还检测到了羟基苯甲酸和/或二羟基苯甲醛的糖苷（表1 #D5/7，[M–H]?，m/z分别为299.0775至299.0776，CCS 171.7和169.2 ?2），这是根据特征性的己糖基团[M–H–162]?的丢失确定的，导致苷元分别为m/z 137.0246和137.0243（均为C7H5O3?，计算m/z 137.0244）。在这里，m/z 93.0346和93.0350的碎片离子更支持将其鉴定为糖基化的二羟基苯甲醛，这与上述非糖基化类似物的情况一致。然而，#D5/7的准确鉴定仍存在一些不确定性，我们无法明确区分二羟基苯甲醛-O-葡萄糖苷和羟基苯甲酸-O-葡萄糖苷，也无法将其分别归因于化合物#D5或#D7。尽管如此，这些化合物可能代表了Rodríguez-Cabo等人[7]之前提到的“类似醛的转化产物”的糖基化衍生物。这也适用于显示两种丰富迁移率的二羟基苯甲酸-O-葡萄糖苷（表1，#D3/4，[M–H]?，m/z分别为315.0726，CCS 167.6和175.2 ?2）。CID分析产生的基峰碎片离子分别为m/z 153.0197和153.0183（[M–H–162]?），对应脱质子化的二羟基苯甲酸（C7H5O4?，计算m/z 153.0193）。这项任务的真实性通过产品离子在m/z 109.0296（C6H5O2?，计算m/z 109.0295）得到证实，这些离子可能与脱质子化的1,3-二羟基苯酚（间苯二酚）相似，这是由于羧基的脱羧作用所致。此外，在m/z 67.0194至67.0198（C4H3O?，计算m/z 67.0189）处也检测到了这些离子，它们同样出现在真实3,5-二羟基苯甲酸标准品的HR-MS/MS谱图中（参见支持信息）。据我们所知，Gonzales等人[29]是迄今为止唯一报告从漂移管IMS测量到芪类化合物（特别是白藜芦醇-3-O-葡萄糖苷（piceid）迁移率的人。这一数值与我们测量的迁移率（182.1 ?2）之间的差异可能归因于使用了不同类型的IMS仪器。Gonzales等人[29]使用的漂移管IMS使离子通过静止气体，而TIMS则将离子固定在移动的气体柱中[30]，这可能导致了上述差异。进一步系统的研究，包括直接对比这些仪器，对于精确阐明这些差异是必要的。

3.2 二聚体芪类的降解

3.2.1 (E)-Ampelopsin A
二聚体芪类(E)-ampelopsin A（表1，#E0，[M–H]?，m/z 469.1296）显示出特征性的HR-MS/MS碎片离子，分别为m/z 451.1136（[M–H–H2O]?）和363.0853（[M–H–106]?），这些离子来源于水的中性损失和一个C7H6O（计算m/z 106.0418 amu）基团，这与之前报道的二聚体芪类(E)-?-viniferin的CID过程一致[16]。在辐照下，#E0显示出所有测试芪类中可检测到的光降解产物数量最少。具体来说，除了母体化合物#E4外，辐照样品还产生了4-羟基苯甲酸和4-羟基苯醛（表1，#E1/2）。值得注意的是，4-羟基苯甲酸仅在二聚体和四聚体芪类被照射后出现。对真实4-羟基苯甲酸标准品的[M–H]?进行CID后，在m/z 137.0244处产生了奇数碎片离子，如m/z 109.0303（[M–H–CO]?）、93.0322（[M–H–CO2]?）、91.0192和41.0041，以及偶数碎片离子m/z 108.0255和92.0263（参见支持信息）。这些化合物可能来源于单体芪类的羟基化和裂解，如上所述。观察到的(E)-ampelopsin A的光降解产物数量有限，这可能与它的平面结构有关[31]，这种结构可能增加了其稳定性，从而降低了其光降解的敏感性。因此，(E)-ampelopsin A的结构特征可能在其相对较低的降解率中起作用，这需要进一步研究结构因素如何影响芪类的稳定性。

3.2.2 (E)-?-Viniferin
(E)-?-viniferin（表1，#F0，[M–H]?，m/z 453.1344）在人工阳光下的光降解表明了三种不同的降解途径。第一种途径涉及二聚体分解为单体单元，即E/Z-白藜芦醇，随后进一步发生光降解。这一途径的证据包括检测到了类似菲的化合物，如二羟基菲酮（表1，#F7）和三羟基菲酮（表1，#F8/9）。这些化合物也被鉴定为(E)-和(Z)-白藜芦醇的光降解产物，表明从裂解产生的单体通过已知的机制进行了降解。有趣的是，在m/z 255.0300处观察到的假定三羟基菲酮显示出与辐照单体中的类似产物不同的保留时间（tR）和碎片模式，这暗示了形成了具有不同羟基位置的异构体，正如Rodriguez-Cabo等人[7]所提出的。此外，在m/z 255.0300处监测到的两个不同迁移率（148.9和153.5 ?2）表明可能存在两种共洗脱的三羟基菲酮异构体。此外，还检测到了一种假定的五羟基菲酮（表1，#F5，m/z 257.0460），其碎片模式与这类化合物一致。检测到的裂解产物，如羟基苯乙炔二酸酐（表1，#F10）和醛类，如4-羟基苯醛（#F1）、4-羟基苯醛（#F3）和4-羟基苯甲酸（#F2），进一步支持了这一途径，因为这些产物与单体芪类的已知降解模式相符。第二种途径涉及二聚体在乙烯桥处的直接裂解，形成了与单体前体无关的独特产物（参见图1）。一种可能的来自这种机制的显著化合物是“α-醛”（表1，#F6，m/z 363.0874），据推测是由双键处的裂解产生的。其相应的“α-酸”（表1，#F4，m/z 379.0825）在m/z 335.0929处显示出典型的[M–H–44]?碎片模式，在m/z 273.0414处显示出[M–H–106]?碎片模式，分别代表了CO2和C7H6O基团的丢失。将这些化合物命名为α-醛和α'-醛是基于双键处两个sp2杂化碳的相对部分电荷，带有更电负取代基的碳被指定为α，而带有较少电负取代基的碳被指定为α'。在(E)-?-viniferin的情况下，裂解产生了4-羟基苯醛（表1，#F3），在这里代表α'-醛，以及在m/z 363.0874处产生的对应α-醛（表1，#F6）。有趣的是，这种直接裂解途径与单体白藜芦醇的光降解途径相似，进一步证实了单体和二聚体芪类之间的共同降解机制。第三种途径表明了氧化光环化作用，产生了?-viniferin的菲衍生物，正如Pébarthé-Courrouilh等人[17]所报道的。?-viniferin菲的进一步氧化产生了在辐照样品中暂时指定的?-viniferin二羟基菲酮（表1，#F11）。后者的[M–H]?在m/z 481.0930处显示出碎片离子，分别为m/z 453.0985（[M–H–28]?）、437.1057（[M–H–44]?）、409.1103（[M–H–28–44]?）和331.0590（[M–H–44–106]?），这些碎片模式与三羟基菲酮（表1，#B4和#B5）的碎片模式一致，同时伴随着CO和CO2的丢失。

表2. 葡萄藤提取物中酚类化合物的HPLC-DAD-ESI(?)-TIMS-QTOF-HR-MS/MS分析结果，分别显示了辐照前（a）和辐照后（b）的情况。

化合物 保留时间（分钟） 最大吸收波长（nm） 实验质量 [M–H]?（m/z） 计算质量 [M–H]?（m/z） 误差（ppm） 总分子式 ESI(?)-HR-MS/MS（m/z，基峰强度%） TIMSCCSN2（?2） 迁移率 1/K0（Vs/cm2）

1 Procyanidin二聚体，b 2.7 278 577.1346 577.1351 1.0 C30H25O12? 425.0866 (50), 407.0781 (27), 289.0724 (100), 125.0244 (40) 222.0 1.082

2 p-香豆酸己糖苷，b 2.8 未测定 325.0927 325.0929 0.5 C15H17O8? 163.0404 (82), 119.0501 (100) 163.8 0.785

3 3,4- & 3,5-二羟基苯醛，b 3.0 260 137.0244 137.0244 ?0.1 C7H5O3? 108.0208 (12), 93.0350 (10), 41.0033 (12) 118.4 0.539

4 4-羟基苯醛，b 3.9 284 121.0298 121.0295 ?2.4 C7H5O2? 92.0269 (32), 41.0439 (5) 116.6 0.525

5 山柰酚-3-O-六糖苷，b 4.0 未测定 477.0669 477.0675 1.1 C21H17O13? 301.0355 (100), 178.9985 (8), 151.0032 (24), 121.0292 (5) 203.5 0.988

6 (E)-piceid，a 4.1 未测定 389.1242 389.1242 0.0 C20H21O8? 227.0721 (100), 185.0610 (5), 143.0506 (10) 182.2 0.879

7 (E)-ampelopsin A，a，b 4.5 281 469.1291 469.1293 0.3 C28H21O7? 451.1255 (50), 375.0880 (50), 363.0910 (71) 203.0 0.985

- 甲酸加合物

1 Procyanidin二聚体，b 2.7 278 577.1346 577.1351 1.0 C30H25O12? 425.0866 (50), 407.0781 (27), 289.0724 (100), 125.0244 (40) 222.0 1.082

2 p-香豆酸己糖苷，b 2.8 未测定 325.0927 325.0929 0.5 C15H17O8? 163.0404 (82), 119.0501 (100) 163.8 0.785

3 3,4- & 3,5-二羟基苯醛，b 3.0 260 137.0244 137.0244 ?0.1 C7H5O3? 108.0208 (12), 93.0350 (10), 41.0033 (12) 118.4 0.539

4 4-羟基苯醛，b 3.9 284 121.0298 121.0295 ?2.4 C7H5O2? 92.0269 (32), 41.0439 (5) 116.6 0.525

5 山柰酚-3-O-六糖苷，b 4.0 未测定 477.0669 477.0675 1.1 C21H17O13? 301.0355 (100), 178.9985 (8), 151.0032 (24), 121.0292 (5) 203.5 0.988

6 (E)-piceid，a 4.1 未测定 389.1242 389.1242 0.0 C20H21O8? 227.0721 (100), 185.0610 (5), 143.0506 (10) 182.2 0.879

7 (E)-ampelopsin A，a，b 4.5 281 469.1291 469.1293 0.3 C28H21O7? 451.1255 (50), 375.0880 (50), 363.0910 (71) 203.0 0.985

- 甲酸加合物 515.1347 515.1348 ?0.1 C29H23O9? 469.1279 (100), 451.1200 (29) 213.4 1.038

8 (E)-piceatannol，a 4.7 未测定 243.0664 243.0663 0.3 C14H11O4? 225.0551 (4), 185.0610 (5), 143.0506 (10) 159.5 0.754

9 芦荟酚二聚体，b 5.2 280 453.1342 453.1344 0.2 C28H21O6? 359.0947 (100), 93.0343 (25) 未测定 未测定

- 甲酸加合物 499.1401 499.1398 ?0.4 C29H23O8? 453.1332 (100), 359.0920 (61), 93.0348 (17) 218.9 1.061

10 (E)-白藜芦醇，a，b 5.8 305, 320 227.0715 227.0714 ?0.5 C14H11O3? 185.0603 (16), 143.0502 (14), 115.0557 (8), 41.0042 (8) 157.7 0.743

11 芦荟酚二聚体 6.3 280 453.1342 453.1344 0.4 C28H21O6? 359.0946 (52), 93.0343 (13) 未测定 未测定

- 甲酸加合物 499.1393 499.1398 1.0 C29H23O8? 453.1342 (100), 359.0920 (55), 93.0348 (10) 223.6 1.087

12 (Z)-芦荟酚二聚体 6.3 279 453.1342 453.1344 0.4 C28H21O6? 359.0982 (100), 105.0330 (100), 93.0328 (97) 未测定 未测定

- 甲酸加合物 499.1393 499.1398 1.0 C29H23O8? 453.1342 (100) 213.3 1.034

13 Hopeaphenol，a，b 6.5 281 905.2595 905.2604 0.9 C56H41O12? — 286.0 1.407

14 Isohopeaphenol，b 6.8 281 905.2595 905.2604 0.9 C56H41O12? — 286.9 1.411

15 (Z)-白藜芦醇，b 7.0 284 227.0714 227.0714 ?0.1 C14H11O3? 185.0613 (20), 143.0504 (20), 115.0553 (7), 41.0042 (8) 155.4 0.732

16 三羟基菲 7.1 260 225.0554 225.0557 1.4 C14H9O3? 183.0452 (4), 181.0660 (10), 157.0658 (2), 41.0043 (3) 146.6 0.690

17 (Z)-?-viniferin，b 7.3 282 453.1342 453.1344 0.4 C28H21O6? 347.0937 (3), 253.0527 (2), 41.0040 (2) 206.4 1.000

- 甲酸加合物 499.1403 499.1398 ?0.9 C29H23O8? 453.1348 (100) 218.4 1.061

18 (E)-?-viniferin，a，b 7.5 322 453.1342 453.1344 0.4 C28H21O6? 347.0937 (6) 206.3 1.000

- 甲酸加合物 499.1399 499.1398 ?0.2 C29H23O8? 453.1340 (100) 218.9 1.064

19 芦荟酚三聚体，b 7.7 284, 320 679.1973 679.1974 0.1 C42H31O9? 未测定 未测定

- 甲酸加合物 725.2022 725.2028 0.9 C43H33O11? 679.1964 (100) 250.9 1.228

20 (E)-r2-viniferin，a 7.9 282, 324 905.2599 905.2604 0.5 C56H41O12? 未测定 未测定

21 ?-viniferin菲 8.0 271 451.1186 451.1187 0.3 C28H19O6? 225.0568 (2), 224.0475 (3), 93.0343 (1) 217.1c 1.052c

22 芦荟酚二聚体 8.1 320 453.1333 453.1344 2.3 C28H19O6? 未测定 未测定

- 甲酸加合物 499.1389 499.1398 ?1.8 C29H23O8? 453.1331 (100) 215.5 1.047

23 (E)-r-viniferin，a 9.1 323 905.2603 905.2604 ?0.4 C56H41O12? — 未测定

缩写：CCS，碰撞截面；nd，未测定；tR，保留时间；λmax，UV/Vis吸收最大值。

a 在辐照前的葡萄藤提取物中发现。

b 在辐照后的葡萄藤提取物中发现。

c CCS和迁移率暂时分配。

§ 通过外部标准确认。值得注意的是，包括(Z)-?-viniferin在内的二聚体芪类在我们的辐照样品中未被检测到，这与Francioso等人[32]和Kosovic等人[25]的早期发现不同，他们报告了(Z)-?-viniferin通过光异构化或二聚化形成。这种差异可能源于我们的人工光源的能量输出较高，它在2小时内就完全分解了芪类，而Kosovic等人的研究中的降解过程持续了20天。此外，在他们的实验中，(Z)-?-viniferin的产生可能主要来自(E)-白藜芦醇的二聚化，而不是直接异构化。这一可能性与我们观察到的芪类从白藜芦醇形成的二聚体一致。这些发现强调了(E)-?-viniferin降解的复杂性，并突显了进一步系统研究以揭示相关详细机制的必要性。

3.3 四聚体芪类的降解

3.3.1 Hopeaphenol
在辐照后的hopeaphenol（表1，#G0，[M–H]?，m/z 905.2610）样品中发现的光降解产物包括4-羟基苯甲酸和4-羟基苯醛（表1，#G1/2）以及4-羟基苯醛（表1，#G3），还有母体化合物本身。此外，还检测到了(E)-ampelopsin A（表1，#G4，CCS 203.0 ?2），通过使用真实标准品确认其在辐照样品中的存在，并且在未处理的样品中也以较低且通常少量的形式存在，这表明hopeaphenol标准品的污染或纯化不足。可以推测，样品中发现的苯醛或苯甲酸相关降解产物可能是由于hopeaphenol或观察到的(E)-ampelopsin A的光降解所致，特别是在之前对(E)-ampelopsin A的辐照实验中也观察到了这些产物。芪类家族特有的分子式（[M–H]?为C28H19O6?，即比例如ampelopsin A多一个H2O）使我们推测“未知化合物4”（#G6）可能代表类似于viniferifuran（即amurensin H）的结构[33]。据我们所知，这种化合物尚未被报道为hopeaphenol的光降解产物，但据报道它天然存在于Vitis amurensis Rupr.、Vitis thunbergii Siebold & Zucc.和V. vinifera的茎中[34-36]。因此，我们的假设需要通过额外的鉴定步骤来进一步验证，包括使用目前尚不可用的viniferifuran的真实标准品。

3.3.2 (E)-r2-Viniferin
(E)-r2-viniferin（即vitisin A）的辐照显示出与单体和二聚体芪类相似的降解模式。首先，4-羟基苯甲酸和4-羟基苯醛及其相应的酸（表1，#H1–4）的存在证实了所有测试样品中观察到的“裂解”途径，形成了“类似醛的转化产物”。与辐照后的单体和二聚体芪类样品的观察结果不同，(E)-r2-viniferin在人工阳光照射下产生了一种新的化合物（#H9），其[M–H]?与母体化合物（表1，#H0/H10）相同，m/z为905.2602（C56H41O12?）。这种化合物暂时被鉴定为(Z)-r2-viniferin。假定的异构体通过保留时间、λmax和碰撞截面（CCS）值的差异来区分。具体来说，(E)异构体的λmax为323 nm，CCS为285.1 ?2（表1，#H0），而假定的(Z)异构体的CCS略高，为289.3 ?2（表1，#H9），同时保留时间较短，λmax为282 nm，这也与其他(Z)异构体一致。此外，“α-醛”（表1 #H7，[M–H]?，m/z 363.0878，C21H15O6?）如在辐照后的(E)-?-葡萄素样品中已经描述的那样（参见#F7），也可能表明四聚体在双键处发生了直接断裂（参见图1）。这一断裂的对应物——α'-醛（表1，#H8，[M–H]?，m/z 573.1558，C35H25O8?）以及相应的α-酸和α'-酸（表1，#H5/H6，[M–H]?，m/z 379.0826和589.1505，分别为C21H15O7?和C35H25O9?）的存在，也可以进一步证实这一点。这些化合物的保留时间（tR）比相应的醛类化合物短，并且具有典型的脱羧断裂模式，表明失去了44 Da的质量，这一点在(E)-?-葡萄素的部分中有描述。更有趣的是，还检测到一种新的化合物，其[M–H]?质量为m/z 573.1550（表1，#H11，CCS 234.8 ?2），表明形成了另一种“类似α'-醛”的化合物，其分子式与#H8相同，但具有不同的保留时间和迁移率以及断裂模式。尽管其断裂模式不典型，且缺乏相关的文献和标准品，我们仍可以推测这种化合物可能是葡萄素类物质。这些α-醛和α'-醛的存在支持了我们的假设，即之前为白藜芦醇描述的“断裂途径”也适用于芪类二聚体和四聚体（参见图1）。

3.3.3 (E)-r-葡萄素
在辐照(E)-r-葡萄素后，检测到了上述两种醛类化合物，即3,5-二羟基苯甲醛和4-羟基苯甲醛，以及它们相应的酸类化合物（表1，#I1–4）。需要强调的是，我们分离出的(E)-r-葡萄素样品中含有一种杂质(E)-白藜芦醇（表1，#I7），这种杂质也存在于未经处理的溶液中。因此，上述醛类和酸类化合物的存在，以及(Z)-白藜芦醇的存在（表1，#I8），可能并不直接与(E)-r-葡萄素的降解有关，因为它们可能是由(E)-白藜芦醇的降解和异构化产生的。然而，化合物#I5、#I6、#I9和#I10（即上述的α-醛和α'-醛及其相应的酸类）的出现，与未含有上述白藜芦醇杂质的辐照后(E)-r2-葡萄素样品的检测结果一致。r-葡萄素的光降解产物#I9，即由(E)-r-葡萄素辐照产生的α'-酸，根据其质谱图与辐照后(E)-r2-葡萄素产生的α'-酸非常相似，但在保留时间（7.2分钟对比5.4分钟）和CCS（237.3 ?2对比236.5 ?2）上有所不同。因此，我们认为这两种降解产物并不相同，需要进一步研究以明确其身份。

3.4 葡萄藤提取物成分的降解
在葡萄藤提取物中检测到了所有研究的芪类化合物。表2列出了提取物在(a)光照射前和(b)光照射后的芪类及其他酚类化合物。图2显示了葡萄藤提取物的HPLC-DAD色谱图（C），以及相应的离子迁移率热图，其中保留时间（tR）与离子迁移率的倒数（1/K0）进行了对比，颜色强度表示照射前（B）和照射后（A）的离子迁移率强度。在未经处理的葡萄藤提取物中，通过比较它们的tR以及UV吸收和质谱数据（包括CCS值）与使用真实参考化合物获得的数据，确认了本研究中研究的九种芪类化合物的存在。与所有标准溶液中的观察结果一致，葡萄藤提取物的光照射主要产生了[M–H]?质量为137.0244和121.0295的化合物（表2，#3和#4），据推测分别是4-羟基苯甲醛和3,4-/3,5-二羟基苯甲醛，这一点通过参考化合物得到了验证。化合物#16的分子离子[M–H]?质量为m/z 225.0554（C14H9O3?，计算m/z 225.0557，CCS 146.6 ?2），其碎片离子包括m/z 183.0452（C12H7O2?，[M–H–42]?）、181.0660（C13H9O?，[M–H–44]?）、157.0658（C11H9O?，[M–H–68]?）和41.0043（C2HO?），即脱质子化的酮烯/乙炔。除了所有含有间苯二酚基团的化合物都出现的酮烯消除外，CID还导致了二氧化碳（CO2，计算m/z 43.9898 amu）和碳亚氧化物（C3O2，计算m/z 67.9898 amu）的消除。值得注意的是，脱羧作用需要间苯二酚基团的酮式异构体开环，随后生成内酯作为中间体，这一点在之前的文献[38, 39]中有报道。通过中性损失碳亚氧化物（O=C=C=C=O）产生的不常见碎片离子，在白藜芦醇的CID过程中也有报道[38]，在黄酮类化合物[40]中也有类似现象，这是由于间苯二酚环的断裂所致。化合物#16可能代表了一种三羟基菲类化合物，这表明“环化”途径可能适用于提取物中芪类化合物的降解（参见图1）。

3.4 葡萄藤提取物成分的降解
在葡萄藤提取物中检测到了所有研究的芪类化合物。表2列出了提取物在光照射前(a)和光照射后(b)存在的芪类和其他酚类化合物。图2展示了葡萄藤提取物的HPLC-DAD色谱图(C)，以及相应的离子迁移率热图，其中保留时间(tR)与离子迁移率的倒数(1/K0)进行了对比，颜色强度表示照射前(B)和照射后(A)的离子迁移率强度。在未经处理的葡萄藤提取物中，通过比较tR、UV吸收和质谱数据（包括CCS值）与使用真实参考化合物获得的数据，确认了本研究中研究的九种芪类化合物的存在。与所有标准溶液中的观察结果一致，葡萄藤提取物的光照射主要产生了[M–H]?质量为137.0244和121.0295的化合物（表2，#3和#4），据推测分别是4-羟基苯甲醛和3,4-/3,5-二羟基苯甲醛。化合物#16的分子离子[M–H]?质量为m/z 225.0554（C14H9O3?，计算m/z 225.0557，CCS 146.6 ?2），其碎片离子包括m/z 183.0452（C12H7O2?，[M–H–42]?）、181.0660（C13H9O?，[M–H–44]?）、157.0658（C11H9O?，[M–H–68]?）和41.0043（C2HO?），即脱质子化的酮烯/乙炔。除了所有含有间苯二酚基团的化合物都出现的酮烯消除外，CID还导致了二氧化碳（CO2，计算m/z 43.9898 amu）和碳亚氧化物（C3O2，计算m/z 67.9898 amu）的消除。值得注意的是，脱羧作用需要间苯二酚基团的酮式异构体开环，随后生成内酯作为中间体，这一点在之前的文献[38, 39]中有报道。通过中性损失碳亚氧化物(O=C=C=C=O)产生的不常见碎片离子，在白藜芦醇[38]和黄酮[40]的CID过程中也有报道，这两种情况都是由于间苯二酚环的断裂所致。化合物#16可能代表一种三羟基菲类化合物，这表明“环化”途径可能适用于提取物中芪类化合物的降解（参见图1）。这一推断得到了UV吸收光谱的支持，其在260 nm处有一个主要峰值（以及在315 nm和361 nm处有次要峰值，这些在表2中未显示），这与通过NMR光谱明确鉴定为白藜芦醇降解产物的2,4,6-三羟基菲类化合物的特征相符。或者，#16可能被归类为3,4′,5-三羟基二苯乙炔，这是由于白藜芦醇中心双键的氧化所致；然而，这两种化合物可以通过它们的UV峰值清晰区分，这一点由Montsko等人[6]提出。值得注意的是，化合物#16在辐照后的芪类化合物标准溶液中未检测到。相反，在辐照后的葡萄藤提取物中未检测到相关的醌类化合物。它们的缺失并不一定意味着它们没有形成，因为通常反应性很强的醌类化合物可能已经与提取物中的亲核成分发生了反应。在辐照后的提取物中，大多数研究的标准芪类化合物仍然可以被检测到，除了(E)-piceid以及r-和r2-葡萄素，这可能是由于它们在未经处理的提取物中的含量较低。尽管(E)-白藜芦醇和(E)-?-葡萄素是提取物中最丰富的芪类化合物，但它们仅显示出了微弱的峰值，这表明它们容易受到辐照的影响。需要强调的是，我们在这项工作中的重点是芪类化合物的定性分析，而不是定量分析。尽管如此，在光照射后的葡萄藤提取物中发现了(Z)-白藜芦醇——这种化合物在上述任何辐照后的标准溶液中都不存在。这一观察结果与之前的文献[12, 32]一致。如上所述，(Z)-白藜芦醇可能容易被高能光和紫外线辐射光降解为上述的进一步产物，因此不会出现在单独的纯标准溶液的辐照产物中。然而，葡萄藤提取物具有棕色的基质，这可能对其光降解起到了一定的保护作用。Latva-M?enp??等人[41]之前已经提出过植物提取物对芪类化合物光诱导降解的稳定作用。葡萄藤提取物中观察到的(Z)-白藜芦醇的另一个解释可能是，提取物中(Z)-白藜芦醇的浓度显著较低（0.1 mM[12]，而标准溶液中的浓度为1.6 mM[12]），这可能促进了(Z)-白藜芦醇迅速光降解为进一步的降解产物。另一种可能的(Z)-异构体，可能是(Z)-?-葡萄素（表2，#17，CCS 206.4 ?2），在相应的(E)-异构体的辐照溶液中未检测到，但在辐照后的提取物中却存在。该化合物通过阐明其分子式（C28H21O6?，实验m/z 453.1342，计算m/z 453.1344）和特征碎片离子[M–H–106]?（m/z 347.0937）以及[M–H–106–94]?（m/z 253.0527）被初步鉴定出来，这些碎片离子代表了C7H6O和C6H6O的依次丢失。这种断裂行为在之前的文献[42]中有报道。此外，282 nm处的UV吸收峰值与其(E)-异构体的322 nm峰值明显不同，这也支持了(Z)-异构体的存在。可以设想(Z)-?-葡萄素在葡萄藤提取物中的生成途径包括：(a) (E)-白藜芦醇的二聚化，(b) (E)-?-葡萄素的异构化，以及(c) r2-葡萄素的逐渐降解。有趣的是，未经处理的提取物中也检测到了二聚体芪类化合物，例如(E)-?-葡萄素（[M–H]?，C28H21O6?，计算m/z 453.1344），但其tR和CCS值与标准溶液中的不同（表2，#12/22）。在辐照后的样品中检测到了几种二聚体芪类化合物，包括一种氧化产物（表2，#21），其分子式表明失去了两个氢原子。化合物#21可能代表一种ε-葡萄素菲类衍生物，这可能是通过(Z)-ε-葡萄素的氧化光环化产生的光转化产物[17]。这一推断得到了UV吸收光谱的支持，其在260 nm处有一个主要峰值（以及在353 nm和361 nm处有次要峰值，这些在表2中未显示），这与通过NMR光谱明确鉴定为白藜芦醇降解产物的2,4,6-三羟基菲类化合物的特征相符。或者，#16可能被归类为3,4′,5-三羟基二苯乙炔，这是由于白藜芦醇中心双键的氧化所致；然而，这两种化合物可以通过它们的UV峰值清晰区分，这一点由Montsko等人[6]提出。值得注意的是，化合物#16在辐照后的芪类化合物标准溶液中未检测到。相反，在辐照后的葡萄藤提取物中未检测到相关的醌类化合物。它们的缺失并不一定意味着它们没有形成，因为通常反应性很强的醌类化合物可能已经与提取物中的亲核成分发生了反应。在辐照后的提取物中，大多数研究的标准芪类化合物仍然可以被检测到，除了(E)-piceid以及r-和r2-葡萄素，这可能是由于它们在未经处理的提取物中的含量较低。尽管(E)-白藜芦醇和(E)-?-葡萄素是提取物中最丰富的芪类化合物，但它们仅显示出了微弱的峰值，这表明它们容易受到辐照的影响。在这里需要强调的是，我们在这项工作中的重点是芪类化合物的定性分析，而不是定量分析。尽管如此，在光照射后的葡萄藤提取物中发现了(Z)-白藜芦醇——这种化合物在上述任何辐照后的标准溶液中都不存在。这一观察结果与之前的文献[12, 32]一致。如上所述，(Z)-白藜芦醇可能容易被高能光和紫外线辐射光降解为上述的进一步产物，因此不会出现在单独的纯标准溶液的辐照产物中。然而，葡萄藤提取物具有棕色的基质，这可能对其光降解起到了一定的保护作用。Latva-M?enp??等人[41]之前已经提出过植物提取物对芪类化合物光诱导降解的稳定作用。葡萄藤提取物中观察到的(Z)-白藜芦醇的另一个解释可能是，提取物中(Z)-白藜芦醇的浓度显著较低（0.1 mM[12]，而标准溶液中的浓度为1.6 mM[12]），这可能促进了任何(Z)-白藜芦醇迅速光降解为进一步的降解产物。另一种可能的(Z)-异构体，可能是(Z)-?-葡萄素（表2，#17，CCS 206.4 ?2），在相应的(E)-异构体的辐照溶液中未检测到，但在辐照后的提取物中却存在。该化合物通过阐明其分子式（C28H21O6?，实验m/z 453.1342，计算m/z 453.1344）和特征碎片离子[M–H–106]?（m/z 347.0937）以及[M–H–106–94]?（m/z 253.0527）被初步鉴定出来，这些碎片离子代表了C7H6O和C6H6O的依次丢失。这种断裂行为在之前的文献[42]中有报道。此外，282 nm处的UV吸收峰值与其(E)-异构体的322 nm峰值明显不同，这也支持了(Z)-异构体的存在。可以设想(Z)-?-葡萄素在葡萄藤提取物中的生成途径包括：(a) (E)-白藜芦醇的二聚化，(b) (E)-?-葡萄素的异构化，以及(c) r2-葡萄素的逐渐降解。有趣的是，未经处理的提取物中也检测到了二聚体芪类化合物，例如(E)-?-葡萄素（[M–H]?，C28H21O6?，计算m/z 453.1344），但其tR和CCS值与标准溶液中的不同（表2，#12/22）。在辐照后的样品中检测到了几种二聚体芪类化合物，包括一种氧化产物（表2，#21），其分子式表明失去了两个氢原子。化合物#21可能代表一种ε-葡萄素菲类衍生物，这可能是通过(Z)-ε-葡萄素的氧化光环化产生的光转化产物[17]。这一推断得到了UV吸收光谱的支持，其在271 nm处有一个主要峰值（以及在353 nm和361 nm处有次要峰值，这些在表2中未显示），其光谱形状与2,4,6-三羟基菲类化合物的特征相符，后者通过NMR光谱明确鉴定为白藜芦醇的降解产物[32]。另外，基于一致的λmax和HR-MS/MS数据，一些二聚体可能被初步归类为已知的葡萄藤提取物成分，如pallidol和ω-葡萄素。然而，由于缺乏真实的参考标准品，目前无法确定其确切的结构[34, 43]。此外，在未经处理的和辐照后的葡萄藤提取物中还检测到了非芪类化合物，例如原花青素二聚体（表2，#1）、对香豆酸己糖（即对香豆酸-4-O-己糖或对香豆酰己糖，#2）和槲皮素-3-O-己糖苷（#5），这些化合物的可能存在已在之前的文献[34]中报道过，但在此仅报告了它们的CCS值和HR-MS/MS数据。

3.5 关于离子迁移率测量的考虑
本研究中测量的芪类化合物及其光降解产物的CCS值（表1，[M–H]?，m/z 121–905）的范围在116.5至286.4 ?2之间。通过三次注射真实标准品评估了TIMS测量的精度，得到的变异系数在0.01%至0.75%之间。这些值在表1和S1中报告。分子离子[M–H]?的质量与其CCS值之间的预期相关性在图3中显示，证实了分析物的离子迁移率与其质量明显相关（Rlin2 = 0.96）。估计的标准误差（SE = 9.13 ?2）反映了实验CCS值与回归线的平均偏差，表明除了分子质量之外，还有其他结构因素影响离子迁移率。同位素化合物的CCS值差异进一步支持了这一结论。虽然不同平台和实验室之间的IMS测量绝对精度通常在2%–3%的范围内[14, 44]，但此处实现的高仪器内精度允许可靠地分辨异构体芪类化合物。然而，考虑到校准精度和观察到的CCS变化，仅凭CCS值不足以明确区分E/Z异构体。它们提供了一个可重复的额外参数，当与保留行为、UV吸收和HR-MS/MS光谱结合使用时，可以显著提高结构鉴定的信心。图3显示了所有芪类化合物及其降解产物的分子离子[M–H]?的测量m/z与碰撞截面（CCS）值之间的关系，这些化合物根据提出的降解途径进行了标记，并给出了决定系数（R2）和估计的标准误差（SE）。首先，我们观察到非对映体，特别是E/Z异构体，尽管m/z相同，但CCS值存在差异。例如，(Z)-白藜芦醇（CCS 154.8 ?2，CV 0.01%）的迁移率低于(E)-白藜芦醇（CCS 157.5 ?2，CV 0.08%），在p < 0.05（n = 3）的水平上达到了统计显著性。图S1和S2中示例性地提供了(E)-和(Z)-白藜芦醇的代表性ESI(?)-HR-MS/MS光谱和EIMs。在(Z)-piceatannol（CCS 156.9 ?2）和(E)-piceatannol（CCS 159.5 ?2）之间也观察到了2.6 ?2的类似差异。这些发现与最近的研究结果一致，这些研究报道了(Z)-异构体的CCS值比(E)-异构体小，这些研究涉及各种酚类化合物，如羟基肉桂酸和携带它们的酰基部分的酰化花青素，强调了离子迁移率光谱在区分E/Z异构体方面的潜力[15, 45]。有趣的是，在我们的研究中，这种趋势主要体现在单体芪类化合物上。二聚体芪类非对映体的CCS值差异可以忽略不计，这通过几乎相同的(Z)-?-葡萄素（CCS 206.4 ?2）和明确鉴定的(E)-?-葡萄素（CCS 206.3 ?2）的值得到了证明。我们的CCS测定精度达到了±0.2 ?2，这与我们工作组最近的研究结果[15]一致。然而，对于四聚体芪类化合物，观察到了相反的趋势，(Z)-异构体的CCS值略高于其(E)-对应物。例如，(Z)-r2-葡萄素（#H9）的CCS为289.3 ?2，而其(E)-对应物（#H0/H10）的CCS为285.1至287.9 ?2。这种顺反异构体的IMS分离模式之前已经在某些咖啡酰奎宁酸的位置异构体中报道过[46]。尽管如此，我们始终观察到，在使用我们的仪器设置时，(E)-芪类化合物的分析通常在迁移谱中显示一个信号，而相应的(Z)-异构体还会显示第二个与(E)-异构体相匹配的信号（数据未显示在表1中）。(Z)-异构体存在两个信号表明它们可能比(E)-异构体更容易转化为(E)-形式。这种转化被认为发生在源中的电离过程期间或之后，或者在TIMS细胞内部。Schnitker等人（2024年）也描述了这种“源内”异构化现象，他们研究了含有(Z)-羟基肉桂酰基团的酰化花青素[15]。此外，我们还经常观察到其他信号，例如对应于甲酸（FA）加合物（[M–H+FA]?）或假定的二聚体离子（[2?M–H]?），这些信号形成于电离过程中或之后，以及在捕获循环期间。例如，即使在未辐照的样品中，(E)-白藜芦醇也显示出了其特征性的CCS值157.5??2，同时还存在一个206.3??2的额外信号（[2?M–H]?），后者也会释放出在相应提取离子迁移谱中检测到的[M–H]?，这表明可能存在类似?-葡萄素这样的芪类二聚体（数据未列在表1中）。这一效应在图2B中得到了说明（未经处理的葡萄藤提取物的热图），其中有一个迁移率为0.732 Vs/cm2的信号（#10，CCS?=?157.7??2），以及一个迁移率为1.000 Vs/cm2的第二个信号（CCS?=?206.4??2）。甲酸加合物尤其在二聚体芪类化合物中观察到。例如，未经处理的(E)-ε-葡萄素样品显示了两种不同的迁移率（表1，#F0）对于前体离子C28H21O6?（计算m/z 453.1344），其中一个归因于在源内形成的甲酸（CH2O2）加合物C29H23O8?（计算m/z 499.1398）。为了获得(E)-ε-葡萄素的正确迁移率值，将[M–H+FA]?加合物的提取离子迁移谱（EIM）与[M–H]?离子的迁移谱进行了叠加。比较显示，其中一个迁移率特征在两个谱线中都出现（219.6??），表明它来源于[M–H+FA]?加合物，而另一个（206.4??）仅存在于[M–H]?谱线中，从而代表了(E)-ε-葡萄素的真实迁移率，并能够区分实际的分析物及其加合物。在葡萄藤提取物中，[M–H]?离子及其相应的[M–H+FA]?加合物的迁移率特征重叠，进一步阻碍了对暂时鉴定的芪类二聚体的具体CCS值的精确分配（表2，#11和#12），因此报告的CCS值仅限于相应的甲酸加合物，因为只确定了一个迁移率。值得注意的是，本研究中使用水溶液中的甲酸作为流动相A以优化色谱分离。

4 结论

通过对单个真实的芪类化合物以及富含芪类的葡萄藤提取物进行HPLC-DAD-ESI(?)-TIMS-QTOF-HR-MS/MS分析，我们对这些化合物的结构特征和光降解途径有了新的认识。HR-MS/MS谱对于已知化合物的鉴定非常有用，并且还支持了对新型降解产物的初步结构注释。虽然TIMS仅部分支持了结构阐明，但它通过评估完整的离子迁移谱而不是单一的CCS值，特别有助于区分异构体结构，如(E)-和(Z)-芪类化合物。尽管CCS值在很大程度上反映了分子质量，但细微且可重复的差异表明，除了基于质量的趋势之外，还有进一步的结构解释潜力。除了离子迁移率的能力外，关于白藜芦醇光降解的现有知识对于识别更复杂芪类化合物的特征性分解产物也非常重要。特别是，羟基苯甲醛的一致形成在未来可能具有相关性，尤其是在涉及光照的应用中，例如在化妆品或生物农药配方中。为了进一步扩大分析范围，未来的研究还可以包括正离子模式，这可能会提供关于芪类衍生物电离行为和结构注释的补充见解。

作者贡献

Paul Besrukow：概念化、方法论、研究、验证、数据管理、项目管理、初稿撰写、审阅和编辑、正式分析、资源整理、可视化。

Friederike A. Schnitker：审阅和编辑、验证、正式分析、数据管理。

Ralf Schweiggert：监督、数据管理、概念化、审阅和编辑、资金获取、项目管理、资源整理。

Christof B. Steingass：概念化、方法论、研究、验证、数据管理、审阅和编辑、正式分析、可视化。

致谢

作者感谢葡萄育种部门以及普通和有机葡萄栽培部门的全体团队收集、储存和干燥葡萄藤的工作，同时也感谢Peter Winterhalter教授提供真实的ampelopsin A、hopeaphenol以及r-和r2-葡萄素标准品。开放获取资金由Projekt DEAL提供和组织。

资助

本工作得到了德国研究基金会（DFG，项目编号INST 370/1–1 FUGG）的支持。该项目还得到了德国联邦食品和农业部（BMEL）的部分资助，该资助基于德国联邦议会的一项决定，通过联邦农业和食品办公室（BLE）在“VITIFIT”联合项目（2818OE004）的框架下提供。利益冲突

作者声明没有利益冲突。