《Materials Today》：Lipid tail heterogeneity enables organ-selective mRNA delivery for in vivo CRISPR-Cas9 gene editing
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廖静|曾玲|张子皙|唐樱森|Joseph Harmon|刘福国|任宇鹏|沈倩|廖航平|姜梦|范辉|曹新秀|叶中秋|陈瑾瑾中国广东省恶性肿瘤表观遗传学与基因调控重点实验室，中山大学孙逸仙纪念医院医学研究中心，广州 510120摘要将 mRNA 精确递送到肝外组织仍然是基于 mRNA
廖静|曾玲|张子皙|唐樱森|Joseph Harmon|刘福国|任宇鹏|沈倩|廖航平|姜梦|范辉|曹新秀|叶中秋|陈瑾瑾
中国广东省恶性肿瘤表观遗传学与基因调控重点实验室，中山大学孙逸仙纪念医院医学研究中心，广州 510120
摘要
将 mRNA 精确递送到肝外组织仍然是基于 mRNA 的治疗方法临床转化中的一个重要难题。传统的器官定向脂质纳米颗粒（LNPs）工程技术主要集中在可电离脂质头部基团或连接子的化学修饰上。然而，这种狭隘的关注范围常常限制了可实现的靶向多样性的范围，并未充分利用脂质骨架的潜在结构优势。在这里，我们介绍了异质尾部（HETAIL）LNPs 平台，该平台通过合理设计脂质尾部的多样性来突破这些限制。通过系统地调节脂质尾部的饱和度、长度和分支结构，我们成功构建了一个能够高效选择性地将 mRNA 递送到包括肝脏、肺、脾脏、淋巴结和骨髓在内的多种组织的 LNPs 库。机制研究表明，尾部异质性通过微调脂质的 pKa 值并在全身给药时调控不同的蛋白质冠层形成来决定器官选择性。此外，分子动力学模拟显示，尾部多样性从根本上改变了膜微观结构和热力学能量，从而影响了细胞摄取行为。最终，HETAIL LNPs 在体内实现了器官选择性的 CRISPR/Cas9 基因编辑，显示了该平台的巨大治疗潜力。
引言
借助 mRNA 疫苗在 COVID-19 大流行期间的成功，mRNA 治疗方法已迅速扩展到包括细胞因子疗法、蛋白质替代疗法和基因编辑在内的多种应用 [1]、[2]、[3]、[4]。与通常以低剂量施用于肌肉组织的 mRNA 疫苗不同，蛋白质替代疗法和基因编辑需要将 mRNA 精确递送到特定器官或细胞类型，并增强其表达以达到治疗效果 [5]、[6]、[7]、[8]。LNPs 是目前最常用的 mRNA 递送载体 [9]、[10]、[11]、[12]。尽管 LNPs 已在临床批准的 RNA 治疗中证明了安全性和有效性，但实现肝脏以外的器官特异性 mRNA 递送仍然是一个重大挑战 [13]、[14]、[15]、[16]。
传统的开发器官定向 LNPs 的化学方法主要优化可电离脂质的头部基团和连接器，这导致的 LNPs 库仅能针对一两个特定器官（图 1A）[17]、[18]、[19]。在这项研究中，我们建立了一种一锅法、一步法的三组分反应体系，作为高效合成异质尾部（HETAIL）脂质的模块化平台 [20]、[21]、[22]。该体系在温和条件下使用胺类、硫内酯和丙烯酸酯，可快速生成结构多样的脂质库，适用于高通量筛选（图 1B）。脂质尾部组合的多样性显著增强了结构变异性，使得能够快速筛选出能够选择性且高效地将 mRNA 递送到肝脏、肺、脾脏以及淋巴结（LN）和骨髓（BM）的脂质。
机制研究表明，LNPs 的 pKa 值和蛋白质冠层会根据脂质尾部的结构异质性而显著变化 [23]、[24]、[25]。重要的是，HETAIL 脂质能够在目标器官中对治疗相关的细胞类型实现有效的 mRNA 转染，突显了其在精准 mRNA 治疗中的转化潜力。最终，利用这些脂质，我们在报告基因小鼠模型中实现了器官选择性的体内 CRISPR/Cas9 基因编辑。这项研究既提供了一种构建多样化可电离脂质的简便方法，也提出了一种通过脂质尾部多样性实现器官特异性 mRNA 递送和基因编辑的新方法。
片段
HETAIL 脂质的模块化合成与动力学表征
为了阐明该反应的动力学行为，我们通过 1H NMR 随时间监测了变化过程。图 1C 显示，在室温下混合后，代表丙烯酸酯基团的 a、b 和 c 峰值迅速下降。此外，d 峰值的化学位移表明硫内酯发生了环Opens。e 处的质子峰证实了酯键的形成，验证了目标产物的成功合成。
As
结论
成功合成并高通量筛选出具有异质尾部结构的脂质库是器官选择性 mRNA 递送领域的一个重要进步。通过系统地调节尾部分支、饱和度和长度不对称性，我们合理设计的 HETAIL 脂质能够在包括肝脏、肺、脾脏、淋巴结和骨髓在内的多种靶组织中实现高效且特异性的 mRNA 递送。机制研究揭示了……
尾部的合成
将 DL-Homocysteine 硫内酯盐酸盐（1.0 克）和月桂酰氯（1.6 克）溶解在二氯甲烷（DCM，5.0 毫升）中，然后在 75°C 下反应 6 小时。使用二氯甲烷/甲醇（20:1，v/v）作为展开溶剂，通过薄层色谱（TLC）监测反应进程。反应完成后，通过真空蒸馏去除溶剂。接着，通过柱层析系统用 DCM 作为洗脱剂纯化化合物 B1，获得了白色固体。
CRediT 作者贡献声明
廖静：可视化、验证、数据管理。曾玲：验证、软件开发、数据管理。张子皙：软件开发、方法学研究、数据管理。唐樱森：验证、软件开发、数据管理。Joseph Harmon：验证、数据管理。刘福国：项目管理和数据管理。任宇鹏：可视化、数据管理。沈倩：软件开发、数据分析。廖航平：方法学研究、实验设计。姜梦：软件开发、数据管理。范辉：实验设计、数据分析。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究工作的利益冲突或个人关系。
致谢
国家自然科学基金（项目编号：52473328）、广东省高层次青年人才项目（项目编号：2023HYSPT0703）、广东省科技计划项目（项目编号：2023B1212060013）、广州市科技局（项目编号：2024A04J6561）以及中山临床科学家计划（项目编号：1320900066）。
