利用肌酸脱亚胺酶和肌酸氧化酶与nCuCd纳米酶耦合的方法，通过安培法检测肌肽和肌酐

《Microchemical Journal》：Amperometric detection of sarcosine and creatinine using creatinine deiminase and sarcosine oxidase coupled with nCuCd nanozyme

　　娜塔莉娅·斯塔舒克 | 安德烈·扎卡尔斯基 | 达莉亚·拉罗夫斯卡-扎里奇 | 奥尔哈·德姆基夫 | 奥克萨娜·扎卡尔斯卡 | 西尔维斯特·加温科夫斯基 | 马尔钦·霍尔丁斯基 | 奥列赫·斯穆托克 | 沃伊切赫·诺加拉 | 米哈伊洛·贡查尔
波兰科学院物理化学研究所，卡斯普尔扎卡44/52号，01-224华沙，波兰

**摘要**
生物流体中的肌酐（Crn）和肌肽（Sar）是临床诊断以及评估机体代谢和生理状态的重要生物标志物。迄今为止，尚未有报道关于能够同时检测H?O?和N-甲基海丹亭（NMH）的酶促安培生物传感器，这两种物质分别是肌肽氧化酶和肌酐脱亚胺酶催化的肌肽和肌酐转化过程中产生的分析产物。本文提出了一种基于nCuCd纳米酶的双模式分析策略，该纳米酶具有双重功能：既能模拟过氧化物酶的活性，又能通过与N-甲基海丹亭的特异性相互作用来响应NMH。所开发的生物传感器表现出良好的灵敏度（肌酐为152 A·M?1·m?2，肌肽为3426 A·M?1·m?2），宽线性范围，满意的储存稳定性以及对目标分析物的高选择性。通过真实尿液和血清样本验证了该生物传感器在检测肌酐和肌肽方面的有效性。此外，这种双模式生物电极还被用作酶促燃料电池（EFC）中的生物阳极，实现了自供电传感平台的概念验证。制备的EFC在3.5 mM肌酐浓度下可达到0.643 V的最大开路电压，在1 μM肌肽浓度下达到0.802 V的电压。总体而言，所有开发的生物分析系统在真实尿液样本中均表现良好，展示了其在医学诊断应用中的潜力。

**引言**
生物流体中的肌酐（Crn）和肌肽（Sar）是临床诊断以及评估机体代谢和生理状态的重要生物标志物[1]、[2]。肌肽是甘氨酸-丝氨酸-单碳代谢途径中的中间产物，由甘氨酸N-甲基转移酶生成，并通过肌肽氧化酶（SOx）降解。肌肽稳态的改变与甲基化能力的紊乱及病理过程（包括癌症进展）有关，尤其是在前列腺癌中，尿液中的肌肽水平被提出作为疾病侵袭性的潜在标志物[3]。肌酐非酶促地由肌肉组织中的肌酸和磷酸肌酸生成，广泛用作肾小球滤过率（GFR）的实用替代标志物，因为在稳态下，其血液水平会随着肾滤过率的下降而升高；然而，由于肾小管分泌和非GFR决定因素（如肌肉质量、饮食、年龄和某些药物）的影响，肌酐并非理想的滤过率标志物，因此需要使用基于肌酐的公式来估算GFR[4]。由于肌肽和肌酐都通过尿液排出，同时检测它们对于基于尿液的生物分析非常有用，尤其是当肌肽值以肌酐为基准进行标准化时。然而，本研究重点在于分析平台的开发，而非肌肽/肌酐比值的临床评估。因此，目前的工作并未尝试验证任何特定临床队列中的肌肽/肌酐比值；下面讨论的例子仅作为背景，以突出在同一样本中测量这两种代谢物的分析意义[5]、[6]。特别是，在尿液中使用肌肽与肌酐比值（Sar/Crn）具有明确的分析和临床依据，因为尿样由于水分状态和利尿作用可能存在显著稀释。因此，尿液生物标志物通常以肌酐为基准进行标准化，以减少稀释相关变异性并提高个体间可比性。肌酐标准化，即相对于同一样本中测量的尿液肌酐来表达分析物浓度，是尿液生物标志物研究中广泛采用的方法[7]。在肿瘤学领域，肌肽主要在前列腺癌（PCa）中进行研究。早期的代谢组学研究表明，肌肽在PCa进展过程中增加，并且可以在尿液中检测到，这激发了大量的后续研究[8]。多项临床研究专门评估了尿液中的肌肽/肌酐比值，并提出了其在PCa中的潜在诊断/预后价值（包括与Gleason评分和转移阶段的相关性[9]）。然而，肌肽仍是一个有争议的生物标志物，因为其他研究发现其性能有限或不一致；因此，肌肽/肌酐比值应被视为需要特定队列验证的补充指标，而非独立的癌症检测方法。目前，支持肌肽/肌酐比值作为双重尿液生物标志物的最强证据与前列腺癌相关；将其扩展到其他癌症尚未在临床上得到证实，需要专门的验证研究[10]。多项临床研究探讨了以肌酐为基准标准化的尿液肌肽在区分前列腺癌与良性前列腺疾病以及监测疾病进展或治疗反应方面的诊断价值。同时测量这两种代谢物有助于校正尿液输出中的稀释效应和个体间差异，提高基于肌肽的检测结果的稳健性。因此，能够在单次操作中同时定量这两种代谢物的分析策略对于研究和常规诊断都非常重要。迄今为止，已经开发了多种方法来检测肌酐和肌肽，包括光谱学和电化学方法[11]、[12]、[13]、[14]。尽管光学方法（比色法、发光法、荧光法、表面等离子体共振法、表面增强拉曼散射法等）简单快捷，但它们容易受到生物样本中共存有机化合物的干扰[6]、[15]、[16]、[17]。其他用于肌酐和肌肽分析的方法基于色谱技术（HPLC或LC–MS/MS）、荧光测定法以及酶促比色法。基于色谱的方法具有优异的灵敏度和选择性，但依赖于昂贵的仪器、耗时的样品制备和专业的操作人员，这限制了它们在高通量筛选和即时检测中的应用。传统的比色法虽然简单，但通常需要对每种分析物进行单独反应，容易受到干扰，可能无法达到早期疾病诊断所需的检测限。为了提高分析技术的选择性，已经开发了基于酶的方法，包括光学和电化学生物传感器[18]、[19]。

**生物传感器系统**
生物传感器系统在临床和工业实验室中检测目标分析物时具有许多优势。通常，用于检测肌酐和肌肽的酶基生物传感器依赖于测量酶促级联反应中消耗的反应物或产生的产物[20]、[21]、[22]。多酶生物传感器的主要局限性在于其操作和储存稳定性较低、固定化过程复杂以及成本较高。近年来，许多研究致力于开发无需使用酶的肌酐和肌肽敏感传感器。这种方法基于功能性材料，包括金属-有机聚合物和不同组成的纳米颗粒，这些材料可作为酶的模拟物[23]、[24]、[25]。用于检测肌酐和肌肽的方法包括电化学[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、比色法[26]、[27]、荧光法[28]、[29]和拉曼光谱[30]、[31]。然而，尽管非酶方法具有高灵敏度，但对目标分析物的选择性不足。因此，尽管酶基生物传感器存在一些缺点，但与非酶方法相比，它们仍然更具选择性和可靠性[20]、[29]。

**结论**
新型安培生物传感器通过结合nCuCd纳米酶（nCuCd-MOF）与CDI和SOx酶，开发出了用于检测肌酐（Crn）和肌肽（Sar）的新方法。nCuCd-MOF是通过2-甲基咪唑配体将Cu(II)和Cd(II)离子连接而成的双金属咪唑框架。所制备材料的形态通过SEM观察到（图1a–c），显示出由相互生长的纳米片/板状纳米片组成的粗糙多孔三维结构。这种开放、分层的MOF结构...

**结论**
本文开发了新型安培生物传感器，用于检测生物流体中的肌酐（Crn）和肌肽（Sar），该传感器结合了nCuCd纳米酶（nCuCd-MOF）与CDI和SOx酶。nCuCd-MOF使用2-甲基咪唑合成，并沉积在玻璃碳电极上，评估了其对过氧化氢和N-甲基海丹亭（NMH）的氧化还原行为和响应性。由此产生的nCuCd-MOF/GCE界面展现了双重功能：一方面作为对H?O?具有高灵敏度的电化学传感器；另一方面作为电化学传感器用于其他应用。作者贡献声明如下：Nataliya Stasyuk负责撰写、审阅与编辑、初稿撰写、数据验证、项目监督、方法论设计、实验研究以及数据分析；Andriy Zakalskiy参与初稿撰写、数据验证、实验研究及概念化工作；Daria Larowska-Zarych负责初稿撰写、项目管理和方法论设计；Olha Demkiv参与初稿撰写及数据验证；Oksana Zakalska负责伦理审批。所有涉及人类血清和尿液样本的实验程序均获得了乌克兰国家科学院细胞生物学研究所生物伦理专家委员会的批准（协议编号2026–3.3）。本研究遵循乌克兰及国际伦理标准以及《赫尔辛基宣言》（2013年修订版）进行，并已获得所有参与者的知情同意。

未引用的参考文献[38]

利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢
本研究得到了波兰国家科学中心（NCN，项目编号2022/46/E/ST4/00457）、乌克兰教育和科学部（项目编号0125U001054、0125U002005和0125U002033）、波兰-乌克兰联合流动项目（2025–2027年，基于波兰科学院与乌克兰国家科学院之间的科学合作协议）、乌克兰国家研究基金会（项目编号2021.01/0010）以及乌克兰国家科学院的支持。