Nanoflow UHPLC-MS3技术用于在单根1厘米长的的人发片段中灵敏地检测皮质醇

《Microchemical Journal》：Nanoflow UHPLC-MS3 for sensitive detection of cortisol in a single-strand 1-cm human hair segment

　　

张志伟|徐正芳|吴欣怡|陈远志|庄曼妮|廖宝琪

台湾国立成功大学医学院职业与环境健康系，台南

摘要

毛发皮质醇是一种经过充分验证的生物标志物，可以通过分段毛发分析来进行回顾性的压力评估。由于人类毛发的生长速度大约为每月0.6–1.4厘米，因此迫切需要能够可靠地量化单个1厘米段内皮质醇含量的方法。在这里，我们开发了一种适用于此应用的纳米流式超高效液相色谱-串联质谱（nanoflow UHPLC-MS³）工作流程。单根1厘米长的毛发片段（约0.05毫克）先用异丙醇处理并超声提取（45分钟），随后在水浴中孵育（55°C，16小时），然后过滤、浓缩，并用200微升甲醇复溶。该系统使用基于分流的技术与负离子模式的线性离子阱相连，并采用MS³采集模式以最大化选择性和信号质量。与微孔UHPLC-MS³相比，纳米流式UHPLC-MS³产生了更强的峰面积响应和更低的检测限，纯溶液中的检测限可达0.79飞克，毛发提取物中的检测限可达0.08皮克。日内和日间精密度分别为3.33–6.13%和13.44–15.17%，相对误差在-9.97%到3.68%之间。将该方法应用于六名孕妇的近端毛发片段后，经过归一化处理后，可检测到的皮质醇水平为8.99–113.78皮克/毫克。总体而言，纳米流式UHPLC-MS³为单根毛发中的皮质醇分析提供了一个较低的检测限平台，适用于毛发样本有限的场景，包括新生儿样本。

引言

毛发皮质醇分析在研究和临床实践中越来越受到关注，因为它是一种评估长期皮质醇积累的有效方法[1]。毛发是一种相对稳定的生物基质，易于收集、运输和储存[2]。由于头皮毛发的生长速度约为每月1厘米[3]，[4]，[5]，内源性代谢物和外源性化学物质可以在生长过程中被纳入毛干中，使得毛发成为回顾性评估慢性暴露的合适生物样本[6]，[7]，[8]，[9]。因此，对毛发皮质醇的分段分析可以提供一段时间内的皮质醇水平信息[4]。相比之下，血液、唾液和尿液中的皮质醇测量通常反映的是某一时间点或短期的生理状态，因此对长期皮质醇暴露的信息较为有限[10]。早期的毛发皮质醇测量主要依赖于免疫测定法，如酶联免疫吸附测定（ELISA）[11]，[12]，[13]和放射免疫测定（RIA）[14]，[15]，因为这些方法简单且灵敏度较高。然而，这些方法可能会与结构相似的内源性类固醇发生交叉反应，从而影响分析的特异性，并可能高估皮质醇浓度[16]，[17]。最近，基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的方法越来越多地应用于毛发皮质醇分析，因为它们在保持相当或更好灵敏度的同时提高了分析特异性[4]，[18]，[19]，[20]，[21]，[22]，[23]，[24]。然而，在质量受限条件下的分析性能仍有待进一步改进。

在毛发皮质醇研究中，分段分析非常重要，因为人类毛发的生长速度约为每月0.6–1.4厘米，这使得每个1厘米的毛发片段可以代表一个相对独立的时间窗口[25]，[26]。当目标是评估随时间变化的皮质醇暴露情况而非仅获得整个毛发样本的平均浓度时，这种时间分辨能力非常有价值。然而，分段处理会减少每个分析单元的质量，从而降低可检测到的皮质醇的绝对量。在样本有限的情况下，这种限制更加明显，例如新生儿或早产儿毛发的分析、毛发样本稀少或单根毛发测量时，每个1厘米片段可获得的毛发量可能非常少[27]，[28]。这些情况凸显了需要更灵敏的分析方法来测定分段定义、质量受限样本中的皮质醇含量。在这种情况下，纳米流式UHPLC-MS可能具有优势，因为低流速分离可以提高电喷雾电离效率并增强信号响应。先前的研究表明，纳米流式UHPLC-MS平台在小分子分析中比微孔UHPLC-MS具有更高的检测灵敏度[29]，[30]。此外，在这种条件下，分析选择性变得越来越重要。引入MS³碎裂技术可以通过额外的碎裂步骤进一步减少基质干扰，从而提高有效灵敏度[31]。Quinete等人还报告称，MS³提供了比MRM跃迁更高的灵敏度，并在毛发皮质醇分析中实现了低于0.4皮克/毫克的检测限[32]。综上所述，这些发现表明纳米流式UHPLC-MS³

在本研究中，使用了单根1厘米长的毛发片段作为低分析物负荷的严格分析模型，以评估在高质量受限条件下的方法性能。利用这一模型，开发并评估了一种纳米流式UHPLC-MS³工作流程，重点关注分析灵敏度、选择性和信号可靠性，以确定是否可以实现更低的检测限。这项概念验证研究可以为未来在样本受限条件下的毛发皮质醇分析提供方法论基础。

章节摘要

化学品

用于LC-MS分析的丙腈和甲醇（LC-MS级）购自J.T. Baker。用于LC-MS分析的甲酸（LC-MS级）购自Sigma。用于毛发提取的异丙醇（HPLC级）和甲醇（HPLC级）购自J.T. Baker。用于制造隧道玻璃珠柱的Kasil 1钾硅酸盐和甲酰胺分别购自PQ Corporation和Sigma-Aldrich。用于标准添加和内部校准的皮质醇和皮质醇-d4

纳米流式UHPLC-MS³策略的开发

纳米流式UHPLC平台由分流系统、捕获柱和分析柱组成，分析与线性离子阱质谱仪相连（图1）。分流系统通常用于将常规UHPLC泵的高流速（每分钟纳升）降低到纳米流式UHPLC平台中的每分钟纳升流速。此外，该纳米流式UHPLC系统还集成了一个样品捕获柱，用于

结论

在这项研究中，开发并评估了一种纳米流式UHPLC-MS³工作流程，用于在高质量受限条件下测定单根1厘米长的毛发片段中的皮质醇含量。通过使用单根1厘米长的毛发作为低分析物负荷的严格分析模型，本研究专门挑战了该平台的最低检测限性能。与微孔UHPLC-MS³相比，纳米流式平台在纯溶液和毛发样本中均产生了更强的峰面积响应，并实现了更低的检测限

张志伟：撰写 – 初始草稿、软件开发、资源准备、数据分析、数据管理。徐正芳：撰写 – 初始草稿。吴欣怡：撰写 – 初始草稿、数据可视化、验证。陈远志：撰写 – 审稿与编辑。庄曼妮：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究工作的利益冲突或个人关系。

致谢

本工作得到了台湾国家科学技术委员会的支持[资助编号：NSTC 112-2113-M-006-002、NSTC 113-2113-M-006-006、NSTC 114-2113-M-006-002]。作者衷心感谢台湾国家大学关键技术联盟、台湾国家大学仪器中心、台湾中央研究院代谢组学核心设施以及农业生物技术研究中的质谱核心技术设施提供的质谱分析支持。