磁铁矿纳米盘作为增强涡旋效应的MRI造影剂：医学成像领域的一种新方法?

《Nanoscale Advances》：Magnetite nanodiscs as vortex-enhanced MRI contrast agents: a novel approach in medical imaging?

　　埃利夫·科查尔（Elif Ko?ar）|朱塞佩·费拉乌托（Giuseppe Ferrauto）|赛义德·比拉尔·尼扎米（Syed Bilal Nizami）|维森特·杜兰·托罗（Vicente Durán Toro）|乌扎伊尔·阿里（Uzair Ali）|洛伦佐·西诺雷利（Lorenzo Signorelli）|特蕾莎·贾纳塔西奥（Teresa Giannattasio）|马可·米卡利（Marco Micali）|弗朗齐斯卡·瓦尔纳（Franziska Wasner）|雷内·斯坦（René Stein）|赖纳·蒂泽（Rainer Tietze）|玛丽安娜·索伦蒂诺（Marianna Sorrentino）|亚历西亚·科拉多（Alessia Corrado）|基亚拉·帕皮（Chiara Papi）|安杰洛·斯卡尔奇利亚（Angelo Scarciglia）|恩扎·迪·格雷戈里奥（Enza Di Gregorio）|尼古拉·托斯基（Nicola Toschi）|达妮耶拉·格雷古雷克（Danijela Gregurec）|阿莱格拉·孔蒂（Allegra Conti）

埃尔朗根-纽伦堡大学化学与药学系
Henkestr. 91
91052 埃尔朗根
德国
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磁性纳米盘（Magnetic Nanodiscs，MNDs）是一类具有各向异性磁性的纳米颗粒，具有内在的涡旋磁化特性，这使得它们在生物医学成像和治疗中具有多种功能应用潜力。在这里，我们展示了它们作为双重模式磁共振（MR）对比剂的潜力——这一独特特性得益于其在超低磁场（<70 μT）下的高纵向弛豫率（r1 ≈ 40 mM?1 s?1）以及在超高磁场（>7 T）下的强横向弛豫率（r2 > 150 mM?1 s?1）。这种场依赖性的弛豫率分布使MNDs成为适用于新兴低场MRI平台和高分辨率临床系统的多功能T1/T2对比剂。体外和体内评估证实了它们在解剖结构中的清晰定位以及优先在肝脏中的积累，这表明由于表面介导的免疫逃避机制，它们在体内的循环时间较长。这些特性使MNDs成为下一代治疗性诊断材料的理想候选者，因为它们具有可调的磁响应、高对比效率，并且能够同时实现成像和神经刺激。

1. 引言
磁共振成像（MRI）因其无离子辐射的特性，在临床成像应用和临床前研究中已地位重要数十年。其原理基于水分子中氢核的激发和弛豫，其中组织依赖性的纵向（T1）和横向（T2）弛豫时间差异构成了成像对比的基础。通过使用T1和T2对比剂（CA），这种对比效果可以得到显著增强，这些对比剂通常通过静脉注射给药。这些对比剂会在特定组织中积累，从而在T1加权（T1w）扫描中产生更亮的图像，或在T2加权（T2w）扫描中产生更暗的图像，从而指示对比剂的生物分布情况。

2. 磁性纳米盘的合成与特性
磁性纳米盘（MNDs）最初被开发为用于远程神经调控的纳米级执行器，其涡旋磁化特性使其能够实现无线磁机械刺激机械敏感离子通道。这一功能性特征使它们区别于球形氧化铁纳米颗粒，并定位为天然的多模态材料。因此，能够通过MRI可视化并量化其分布成为关键要求，尤其是在涉及局部神经刺激和监测生物反应的未来应用中。为了实现这一目标，首先对MNDs进行了全面的表征，包括从合成和磁性质到弛豫测定、体外成像和体内生物分布的研究，突显了其作为下一代生物医学成像和治疗性对比剂的潜力。

3. 实验程序
3.1 材料
所有使用的化学品均为分析级，并按原样使用。醋酸钠、三辛基胺、聚马来酸酐-1-十八烯（PMAO）、低凝胶度琼脂、磷酸盐缓冲盐（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）粉末、二甲基亚砜（DMSO）和十二烷基硫酸钠（SDS）购自Sigma Aldrich。氯化铁（III）六水合物、己烷、氯仿和Tris-醋酸酯-EDTA（TAE）缓冲液（10×）购自Carl Roth。油酸、磷酸盐缓冲盐水（PBS）（1×）、GlutaMax?、胎牛血清（FBS）、Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）和乙醇购自Fisher Scientific。超纯（UP）水采用Milli-Q UV水净化系统（Millipore）制备。

3.2 磁性纳米盘的合成与PMAO涂层
磁性纳米盘的合成遵循Gregurec等人的方法。首先将0.8克醋酸钠溶解在10毫升无水乙醇和1毫升超纯水中，然后加入0.273克FeCl3·6H2O。混合物在特氟龙内衬的高压反应器中加热至180°C并保持18小时，冷却至室温后用超纯水和乙醇清洗。空气干燥后的赤铁矿纳米盘在360°C、5% H2/95% Ar气氛中用三辛基胺/油酸还原为磁铁矿，之后用己烷和甲苯纯化。为了将纳米盘转移到水相中，它们被涂覆上聚马来酸酐-1-十八烯（PMAO，分子量30,000）。将10毫克/毫升的PMAO溶液与100微克干燥的纳米盘混合并在甲苯中超声处理一小时。溶剂在150°C下用油浴蒸发，随后将涂覆后的纳米盘在80°C的稀释TAE缓冲液中超声处理三小时，多次用超纯水清洗，并存放在4°C下。

3.3 磁性纳米盘的结构与磁性质表征
赤铁矿和磁铁矿纳米盘的透射电子显微镜（TEM）观察使用Zeiss EM 912显微镜完成。两种形式的粉末X射线衍射图谱使用Bruker D8 Advance仪器在Cu Kα辐射（λ = 1.5406 ?）下、20°至80°的范围内获得。室温下的滞后曲线使用超导量子干涉装置（MPMS 3, Quantum Design）生成，用于量化磁化饱和度和矫顽力。涂覆磁铁矿纳米盘的ζ电位和粒径分布使用Zetasizer Nano ZS装置（Malvern Panalytical）在pH 6.8的超纯水中（25°C）进行动态光散射（DLS）测量。

3.4 铁含量的测定
通过弛豫测定（Stelar SpinaMaster FFC2000，Stelar，意大利帕维亚）和ICP-MS（Element-2；Thermo-Finnigan，意大利罗达诺）测定纳米盘中的铁含量，结果以mol L?1表示。对于弛豫测定样品的制备，将纳米颗粒样品按1:20（体积比）稀释在水中，然后与浓HNO3（67%）以1:9（体积比）混合，在密封玻璃瓶中加热至160°C以完全溶解材料。矿物化后，使用Stelar Spinmaster弛豫仪（Stelar，意大利帕维亚）进行1H弛豫测定，采用反演恢复（IR）脉冲序列测量纵向弛豫率（R1 = 1/T1，其中T1是水的纵向弛豫时间）。铁含量根据硝酸中不同浓度FeCl3矿物化的标准曲线计算得出，使用以下公式：
R1 = Rdia + [Fe] × r1p，其中Rdia表示硝酸的抗磁贡献，设定为0.52 s，r1p是浓度归一化的铁弛豫率，为1.29 mM?1 s?1。

3.5 NMR弛豫性的表征
在进行NMR弛豫特性测定之前，将MNDs在室温下超声处理30分钟。将100 μM浓度的MNDs加入到37°C的低凝胶度琼脂中，最终浓度为2%（w/vol）。样品包含一根装有琼脂糖凝胶的管子。测得琼脂糖的T2明显长于最低浓度MNDs的T2。为了考虑琼脂糖的体积贡献，从样品的R2值中减去琼脂糖管的R2值。这种校正确保报告的R2值准确反映了MNDs的弛豫性，而不受琼脂糖背景的影响。在B0 = 0.5 T和25°C下使用Stelar Spinmaster弛豫仪测量弛豫率R1和R2（= 1/T2）。纵向弛豫（T1）使用反演恢复（IR）序列测量，其中180°脉冲反转纵向磁化，随后在一系列反演时间（TI）内恢复，并用90°脉冲读出。在恢复期间，磁化沿主场演变，因此只有自旋-晶格弛豫对信号有贡献。横向弛豫（T2）使用Carr–Purcell–Meiboom–Gill（CPMG）序列测量，该序列通过最小化纵向弛豫效应来隔离自旋-自旋弛豫。在CPMG实验中，90°脉冲将纵向磁化倾斜到横向平面，随后是一系列180°的重聚焦脉冲，从而产生自旋回波。回波幅度的衰减仅反映了T2过程，因为纵向恢复发生在更长的时间尺度上。通过对回波衰减进行单指数拟合可以准确估计T2。关于用于确定不同磁场强度下T1和T2值的信号拟合程序的更多详细信息，请参见补充信息（SI）。纳米颗粒的完整松弛度分析是通过1H核磁共振弛豫分散（NMRD）曲线来实现的，这些曲线描绘了在变化磁场中的纵向弛豫率。这些曲线是在快速场循环Spinmaster relaxometer FFC2000 NMR（Stelar S.n.c.，意大利梅德）上捕获的，磁场强度范围从24 μT到0.47 T（相当于0.0102–20 MHz的质子拉莫频率）。更高频率的数据（20至60 MHz）是使用Stelar Spinmaster（Stelar，意大利帕维亚）光谱仪与Stelar VTC-91温度控制器组合收集的。变场松弛度实验在25°C下进行，温度稳定性在±0.5°C以内。额外的数据是使用7.1 T扫描仪（Bruker Avance Neo 300 MHz磁共振成像）和14 T Bruker 600 MHz高分辨率NMR光谱仪获得的。300和600 MHz的MRI测量在25°C下进行，处于温度控制条件下。有关NMR弛豫性表征的更多信息，请参见补充信息2.6。

**2.6 体内研究**
本研究使用了8至10周大的雄性BALB/c小鼠，体重约为24 ± 3克（Charles River Laboratories，意大利卡尔科）。小鼠在标准条件下饲养，可以自由获取标准啮齿动物食物和水，并经历12小时的光/暗周期。所有实验程序均遵循阿姆斯特丹动物保护协议，并遵守国家和国际法律及政策（D.L.vo 116/92、D.L.vo 26/2014及其后续补充规定、2010/63/EU、EEC理事会指令86/609、OJL 358、1987年12月、美国国家研究委员会1996年的《实验室动物照顾和使用指南》）。实验方案获得了意大利卫生部的批准（授权编号888/2021-PR）。为了提取大脑，根据伦理指南通过颈椎脱位处决小鼠，并立即对它们的大脑进行体外MRI处理（见第2.7节）。

**2.7 模体和体外大脑的MR采集**
T2加权的MRI在定制的琼脂糖模型和体外小鼠大脑中进行。模型包含8个装有MND的管子，MND浓度从2.5到100 μM不等，水作为对照。7 T下的T2加权MR成像是在含有不同浓度MND悬浮液的定制琼脂糖模型上进行的，以评估横向弛豫性（r2）。进行了单指数T2拟合的多层多回波（TE = 3–600 ms，TR = 5000 ms）实验，以及改变重聚焦脉冲数量（RF = 24、32、64）的额外实验；详情请参见补充信息。为了表征MNDs在大脑组织中的弛豫性和对比度特性，并建立其潜在存在的参考信号曲线，我们将MNDs注射到体外小鼠大脑中。成像是在7 T下使用多自旋回波序列（24–64个重聚焦脉冲）进行的。在立体定向注射10 μL MNDs（[Fe] = 200 μM = 1.04 mM）后获取图像。T2图谱是通过将MSME数据（40个回波时间（TE），10–400 ms；(x,y,z)分辨率 = (80, 100, 500) μm）的信号衰减拟合到单指数和双指数模型生成的：单指数：S(TE) = S0e?TE/T2；双指数：S(TE) = A1e?TE/T2,1 + A2e?TE/T2,2。拟合使用MATLAB的Isqcurvefit（Levenberg–Marquardt）软件进行。模型选择采用AIC和BIC来平衡拟合优度和模型复杂性：AIC = n ln(RSS) + 2kBIC = n ln(RSS) + k ln(n)，其中n是回波数量，k是参数数量，RSS是残差平方和。双指数模型解释了磁颗粒附近（快速T2）和远处（慢速T2）的异质性弛豫，当ΔAIC或ΔBIC > 10时被认为更优。生成了二进制体素级图谱以可视化表现出双组分弛豫的区域。

**2.8 生物相容性（MTT和红细胞溶血测定）**
为了评估未来体内应用的潜力，我们使用标准MTT测定法评估了PMAO包覆MNDs的体外生物相容性，以确定它们对细胞活力和增殖的影响。HEK293细胞在96孔板中以0.01 × 106细胞/孔的接种密度培养，在含有10% FBS和2 mM GlutaMAX?的DMEM中。第二天，细胞用不同浓度的PMAO包覆MNDs处理：50 μg mL?1、100 μg mL?1、150 μg mL?1和200 μg mL?1，分别对应[Fe]浓度为0.05%、0.1%、0.15%和0.2%（w/vol）。然后细胞与MTT试剂孵育，产生的甲酚蓝晶体溶解在DMSO中，并使用Molecular Devices的SpectraMax M2光谱仪在590 nm处测量吸光度。从14–16周大的雄性BALB/c小鼠的尾静脉收集的红细胞（RBCs）进行了溶血测定，使用预装有肝素的27号注射器。血液在新鲜PBS中稀释并以2300 rpm离心8分钟以沉淀细胞。红细胞洗涤后重新离心，然后在室温下暴露于0.2 mM或0.5 mM浓度的MNDs中30分钟。孵育后，样品离心，收集上清液并在413 nm处使用6715 UV/Vis光谱仪（JEOL）分光光度法测量释放的血红蛋白。用新鲜PBS孵育的红细胞作为对照。使用渗透休克作用的裂解红细胞作为完全释放血红蛋白的参考。

**2.9 体内生物分布**
动物实验按照批准的协议编号888/2021-PR进行。将MNDs通过静脉注射给10周大的野生型balb/c雄性小鼠（体重23 ± 3克，N = 3只）。每只小鼠接受100 μL的静脉剂量，相当于每只小鼠90 μg Fe（4 mg Fe kg?1），MND悬浮液制备浓度为1 mg Fe mL?1（90 μL MND悬浮液 + 10 μL 10× PBS以调节溶液的渗透压）。使用7特斯拉扫描仪（Bruker Avance 300光谱仪配备微线圈）进行MRI扫描，采用快速采集带重聚焦回波（RARE）序列，参数如下（TR = 4000 ms，TE = 5.5 s，FOV = 1 cm × 1 cm，切片厚度 = 1 mm，RARE因子 = 32，矩阵大小128 × 128）。在多个时间点获取图像：注射前（基线）以及注射后5分钟、1小时、4小时和24小时。通过分析不同时间点的信号变化[(post ? pre)/pre) × 100]来评估不同器官中纳米颗粒的生物分布和时间动态。

**2.10 ICP-MS**
在完成MRI生物分布实验（24小时后），处决动物并取出器官（肝脏、肾脏、脾脏和肌肉），称重并进行ICP-MS分析。每个组织样本用1 mL浓硝酸（HNO3，70%）处理。组织完全溶解后，使用微波加热（MicroSYNTH Microwave Labstation，配备光纤温度控制和HPR-1000/6M六位高压反应器，意大利贝加莫）进一步消化。消化后，使用超纯水将每个样本的体积调整至2 mL。然后通过0.45 μm滤膜过滤溶液，并使用Thermo Scientific ELEMENT 2 ICP-MS（Finnigan，意大利罗德阿诺）进行Fe3+定量分析。使用从四种铁吸收标准溶液（Sigma-Aldrich）生成的校准曲线（范围0.005–0.1 mg mL?1）进行定量。每个样本中保留的总Fe3+质量相对于肿瘤组织的重量计算（以每克组织中的mg Fe3+表示），减去来自未处理对照动物的空白值（每组N = 3）。每个器官中的铁浓度相对于未处理对照动物的相应器官进行了标准化。这种方法允许比较器官特异性铁积累与健康小鼠的基线水平。

**3. 结果与讨论**
**3.1 磁性纳米盘的合成、表征和体外生物相容性**
MNDs通过两步方法合成：首先通过水热合成具有六角形非磁性晶格的赤铁矿模板，然后通过氢辅助还原为磁铁矿相，正如我们之前报道的。透射电子显微镜（TEM）确认还原后保持六角形盘状形态（图1A和B），平均直径约为127 nm。详细的尺寸直方图见补充信息（图S1）。X射线衍射（XRD）分析证实了从非磁性赤铁矿到磁铁矿的结构转变（图1C），测量的晶格常数（a = 8.32 ?）和层间距（d = 2.51 ?）与磁铁矿的逆尖晶石结构一致。磁表征显示出一个滞后曲线（图1D），高饱和磁化（Ms）约为80 emu g?1，矫顽力（Hc）为36 kA m?1，与我们之前报道的MNDs特性相符。由于高Ms，即使在无外场的情况下也能实现最小净磁化，防止聚集并提高胶体稳定性，这对生物医学应用至关重要。为了确保水分散性和生物相容性，MNDs用聚（马来酸酐-1-辛烯）（PMAO）进行了功能化。所得的尺寸分布（图1E，S3）显示平均流体动力学直径为201 ± 1 nm。透射电子显微镜（TEM）显示涂层前的核心尺寸为127 ± 17 nm，小于DLS测得的值。这种差异归因于水合聚合物层的存在以及溶液中MNDs的轻微聚集，这两者都导致水溶液中颗粒直径增加。这些效应也扩大了尺寸分布，解释了涂层后观察到的更宽的SD。DLS测量的多分散指数（PDI）为0.17。通常，PDI值在0.1到0.25之间表示窄分布，而PDI大于0.5表示宽分布。文献中已经报道了用作MRI造影剂的基于铁的小纳米颗粒的相似PDI值。这些结果与我们关于涂层MNDs长期稳定性的发现一致。Zeta电位显示表面电荷为?40.7 ± 0.8 mV（图1F），证实了PMAO水解产物的负电荷羧基的成功涂层。MNDs的磁体积磁化率为1.14× 10?3 a.u.，与涡旋态MNDs的理论预期一致。

**3.2 体外生物相容性评估**
标准MTT测定显示，MNDs在HEK293细胞中表现出浓度依赖性的细胞毒性，在浓度高达100 μg mL?1（0.4 μM Fe）时细胞存活率保持在75%以上，而在更高剂量下细胞存活率有所下降（图2B）。同时，所有测试浓度（0.2–0.5 mM）下的红细胞（RBC）溶血率低于5%，表明生物相容性问题较小（图2A）。这些结果证实PMAO包覆的MNDs具有低细胞毒性和高血液相容性，支持它们适用于静脉注射和体内MRI研究。统计评估使用了单因素方差分析（ANOVA）和Tukey均值比较方法。*p < 0.5 和 **p < 0.01。3.2. 通过NMR和磁共振成像对材料进行表征3.2.1. 纵向弛豫性为了评估PMAO涂层MNDs的纵向弛豫性（r1p）特性，我们记录了在从0.23 μT到1.41 T的广泛磁场范围内的全质子核磁共振弛豫分散（1H-NMRD）数据，并补充了7 T（MRI）和14 T（高分辨率NMR）的实验（图3A）。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图3. 横向弛豫性测量。(A) PMAO涂层MNDs在20到600 MHz范围内的纵向和横向弛豫性。(B) 在7特斯拉下，通过R2 MND浓度（对应于0到100 μM的铁浓度）的线性校准来确定检测限（LD）。(C) 在7 T下获取的幻影磁共振图像，以评估该磁场强度下PMAO涂层MNDs的浓度依赖性T2对比性能。NMRD曲线在非常低的磁场（低于70 μT，对应于频率低于0.03 MHz）处显示出明显的峰值，此时弛豫性达到约40 mM?1 s?1。这种在超低场下的高r1p是由于颗粒较大、表面积与体积的比率高、几何形状各向异性以及MND表面附近的水交换缓慢所致。这一解释进一步得到了TEM和SEM成像的支持（图S2），这些图像显示MNDs聚集成了数百纳米的团簇。这种聚集预计会减缓旋转相关时间（τR），通过促进外层水的弛豫机制来增强低场下的T1弛豫性。在中等频率（100–400 kHz）时，r1p值降至15–20 mM?1 s?1；而在临床MRI范围（1–7 T，40–300 MHz）内，r1p值进一步降低，证实了T1对比性能的场依赖性。这些发现支持了MNDs和T1对比剂在低场MRI中的应用，包括便携式或新兴的低场MRI技术。观察到的NMRD曲线也与之前关于高效热疗各向异性磁结构的报告一致。3.2.2. 与GBCAs的弛豫性比较由于GBCAs在常规磁场强度（1.5–3 T）下的T1弛豫性值约为3–5 mM?1 s?1，因此它们常用于临床MRI。然而，在极低磁场（低于mT范围）下，GBCAs的r1弛豫性显著增加，有时甚至接近或超过10 mM?1 s?1，这取决于分子性质和环境因素。在这种极低场条件下，较长的旋转相关时间和较慢的分子翻转效率通过提高内核质子的交换效率增强了对比剂的效能。值得注意的是，MNDs在低于70 μT的磁场下显示出约40 mM?1 s?1的峰值纵向弛豫性（r1），这超过了几种常用GBCAs在类似条件下的弛豫性值。这突显了它们作为新兴极低场MRI应用中T1对比剂的潜在适用性。表2总结了在不同磁场强度下测量的不同Gadolinium基对比剂（GB-CAs）的r1值。所有数值均在室温下获得。对于具有多种分子大小的制剂，包括了报告的最高弛豫性值，因为r1值通常随分子量的增加而增加。表2. 不同磁场强度下Gadolinium基对比剂的MRI弛豫性。r1值以（mM?1 s?1）表示。GB化合物 r1 (ULF)a 生物相容性 参考文献Gd-DTPA12Y 50和51Gd-DOTA12.5Y 50和52Gd-1,7-DOTAGA212Y 51和53Gd-HTTAHA14n/a 50 Gd-DTPA-BC12.5Y 54 Gd(AAZTA-C2-COOH)14n/a 55 Gd(AAZTA-C4-COOH)16n/a 56 aULF – 极低场（<0.1 T）。如表2所示，一些列出的化合物不具备生物相容性或缺乏足够的生物相容性数据，而我们的MNDs已经展示了良好的生物相容性，支持其在体内应用的潜力。3.2.3. 横向弛豫性PMAO涂层MNDs的横向弛豫性（r2p）在0.5 mT到14 T的磁场范围内进行了评估（图3B）。r2p值随频率和磁场增加而增加，在7 T时达到150 s?1 mM?1，在14 T时达到180 s?1 mM?1。这些MNDs可能通过改变水的扩散和提高局部磁化率来影响场依赖性的弛豫行为，从而在高磁场下解释了观察到的高横向弛豫性。这种聚集诱导效应与先前的研究结果一致，表明纳米颗粒聚集可以通过产生更强的局部磁场不均匀性来放大横向弛豫。为了可视化对比效率，我们使用7 T MRI系统对含有不同浓度（2.5–100 μM）MNDs的琼脂糖基幻影进行了成像。图3D显示了在7特斯拉下使用不同T2加权级别获取的代表性T2加权MRI图像，其中RARE因子（RF）角度分别为：(a) RF = 24°, (b) RF = 32°, 和 (c) RF = 64°。幻影由含有不同浓度MNDs（100, 75, 50, 25, 10, 5, 和 2.5 μM）的管子以及水对照组组成。随着RF值的增加，由于回波序列持续时间延长，T2对比度变得更加明显，这突出了横向弛豫的差异。在较高MND浓度下，由于磁化率引起的退相干效果更为显著。观察到明显的浓度依赖性信号下降，即使在低至10 μM的浓度下也能观察到明显的对比度。图像清楚地表明T2信号衰减取决于MND浓度和T2加权程度，强化了它们作为超高场有效T2对比剂的作用。特别是在较低MND浓度下（例如管子#5，[MND] = 0.025 mM），观察到明显的负对比度。通过R2 MND浓度的线性校准（y = 145x + 7），我们根据标准3-sigma准则计算了检测限（LOD）。LOD定义为：使用仅含水的（0 mM）对照信号的标准差（σblank = 0.5 s?1）计算得出。图3C显示了从含有不同铁浓度的幻影的T2图中得出的R2与浓度曲线。T2图是使用在7特斯拉下获取的MSME序列生成的，带有可变回波时间，并包含在SI中（有关MRI获取的更多详细信息，请参见图S4和SI）。利用这些值和每个管子中的MND浓度，确定在7特斯拉下的弛豫性为147 mM?1 s?1。为了突出不同RF下拍摄的图像中的纳米颗粒浓度差异，还展示了相应的图像。图3D中的代表性T2加权MR图像（RARE序列）说明了信号变暗与MND的存在和浓度之间的关系。弛豫性曲线表明MNDs作为极低场MR采集中的T1剂是有用的，而它们在超高磁场条件下的表现也使其适合作为T2对比剂。为了表征MNDs作为MRI对比剂的性质，我们评估了不同磁场强度下的横向与纵向弛豫性之比（r2/r1）。这个比率广泛用于分类对比剂：低r2/r1值（通常< 5）表明以T1为主的行为，高值（例如，> 10）反映以T2为主的对比，而中间值可能表明具有双模对比的潜力。如图S5所示，在我们的数据集中，r2/r1比率在调查的磁场强度（10–600 MHz）范围内大约在25到650之间变化，所有频率下的r2都显著大于r1。基于这些高r2/r1值，MNDs表现出强烈的横向弛豫性，主要表现为T2对比剂。没有哪个磁场范围显示出足够低的r2/r1值来表明显著的T1主导或真正的双模行为。3.2.4. 与其他铁氧化物纳米结构的弛豫性比较为了将MNDs的双模弛豫性特征放在上下文中，我们将它们的场依赖性r1和r2弛豫性与其它铁氧化物纳米结构（包括球形SPIONs、纳米立方体和纳米簇）报告的弛豫性进行了比较（表3）。虽然许多铁氧化物系统都表现出一定程度的场依赖性弛豫性，但MNDs在极低场（r1 = 40 mM?1 s?1）和高场（r2 > 150 mM?1 s?1）下的组合是显著的。尽管MNDs并不是专门为优化MRI对比而合成的，但它们的涡旋状态和各向异性几何结构赋予了它们在球形铁氧化物颗粒中未观察到的弛豫行为，包括在低场下的增强r1和高场下的强r2响应。这种性质特征与经典基于SPION的剂不同，为这种纳米结构提供了一种新的弛豫特征。球形和立方体铁氧化物纳米颗粒通常在高场下表现出强T2弛豫性，但在极低场下缺乏可比的T1性能。在研究的系统中（表2），片状几何结构确实有助于增加铁氧化物纳米颗粒的纵向和横向弛豫特性，正如Zhou等人所证明的。与这些发现一致，在<0.1 T下观察到的MNDs的优异r1表明其机制超出了简单的场依赖性，可能与它们的较大尺寸、涡旋磁化和各向异性盘状几何结构有关。表3. 不同磁场强度下铁氧化物纳米结构的MRI弛豫性。所有r1和r2值均以（mM?1 s?1）表示。纳米颗粒尺寸 r1 (ULF)a r1 [mM?1 s?1]/IFb r1 [mM?1 s?1]/HFc r2 [mM?1 s?1]/ULFa r2 [mM?1 s?1]/IFb r2 [mM?1 s?1]/HFc参考文献.SPIONs（球形）10 nmn/an/an/a25/0.47 T50/7 T 8 纳米立方体20 nm和100 nm组合n/a4–5/1.41 T5/1.41 Tn/a680/1.41 Tn/a 63 纳米簇（SPIONs）5–10 nm的聚集体n/an/a6–8/3–10 Tn/a30–70/5–10 T 42 MNDs（本研究）127 nm涡旋纳米盘40/<70 μT10/0.5–1.5 T3/3 Tn/a30/3 T150/7 T本研究纳米片3–9 nmn/a11–40/0.5 Tn/an/a70–300/0.5 Tn/a 64 SPIONs（ferumoxytol）17–30 nm36.8/64 mT19/3 Tn/a10–87/0.6–3 Tn/a 65 aULF – 极低场（<0.1 T）。bIF – 中等场（0.5–1.5 T，临床MRI）。cHF – 高场（>3 T（包括7 T或14 T））。尽管MNDs并非设计为传统的基于铁氧化物的对比剂，但它们仍然表现出弛豫性质，尽管其主要功能是用于神经调节。MND的尺寸和形态经过精心优化以最小化毒性，而其组成（磁铁矿）和物理特性（约100 nm的流体动力学直径）自然解释了观察到的双弛豫性。在极低磁场下，较大的磁矩和较慢的旋转动力学增强了纵向弛豫（r1），而在较高场下，聚集和磁矩增加了局部磁化率，从而产生主导的横向弛豫（r2）。因此，低场下的显著r1和高场下的r2源于磁铁矿的固有性质以及颗粒大小和聚集效应的结合，而不是通过刻意调整弛豫性获得的。这些发现支持了MNDs不仅仅是场调谐的铁氧化物颗粒，而是具有独特结构和磁特性的观点，使其能够实现双模MRI对比。3.3. 使用MNDs的体外MR成像图4总结了MNDs的体外MR特性。图4A显示了不同回波时间的代表性脑部切面的T2加权磁共振图像。作为MRI对比剂的有效性的证明，MNDs在图像中表现为局部低信号区域（暗点）。注射部位在左上角标为红色，而对侧的脑区标为蓝色作为对照，与周围组织相比信号没有显著变化。图4B展示了从注射部位和对侧区域的代表性体素中提取的信号衰减曲线。这些衰减使用双指数模型进行拟合，结果分别用蓝色和红色曲线表示对侧和注射部位。在注射区域观察到明显的更快横向衰减，这与MNDs的局部积累有关，这种积累强烈影响了质子的横向弛豫。图4C显示了相应的参数化T2图，分别突出了与MNDs靠近的水质子相关的快速弛豫组分和代表体液水的慢速组分。这些图证实了MNDs的空间定位和弛豫影响。最后，图4D显示了二进制图，其中Akaike和贝叶斯信息准则（AIC/BIC）值均超过了10的阈值，表明双指数模型在注射部位提供了更好的拟合（用白色标出）。这支持了存在两种不同类型水质子的观点，这与MNDs引起的异质微环境一致。这些结果突显了双指数松弛模型在解释用MNDs标记的组织的T2加权MR信号时的实用性，这些组织表现出超高的横向弛豫性。信号成分的分离使得能够更精确地描述纳米粒子与组织的相互作用，并为评估先进的MRI造影剂提供了一个稳健的框架。MNDs的给药剂量为2.4 mg Fe kg?1，这比临床上使用的SPIONs（如ferumoxytol）的剂量（通常为3–7.5 mg Fe kg?1）要低一些。这表明MNDs在临床环境中的实用性，其优点在于能够在低场条件下有效增强T1信号，而SPIONs则不具备这一特性。下载：下载高分辨率图像（2MB）下载：下载全尺寸图像。图4. MNDs在脑组织中的体外磁共振表征。(A) 在7特斯拉磁场下获取的T2加权MR图像显示，在注射部位（注入了10 μL MNDs，该部位用红色标出）有低信号强度，表明MNDs的积累。对照区域（蓝色）没有显示出信号变化。(B) 来自注射部位和对照区域的代表性体素的信号衰减曲线，使用双指数模型进行拟合。由于局部MNDs诱导的磁化率效应，注射部位的横向弛豫速度更快。(C) 从双指数拟合得到的参数T2图，区分了快速弛豫成分（靠近MNDs）和较慢的基体成分。(D) 二元AIC/BIC图显示了双指数模型显著优于单指数模型的体素（AIC/BIC > 10），证实了存在两种不同的质子群体。这些结果强调了在用超高弛豫性MNDs标记的组织中使用双指数建模的相关性，从而增强了MNDs与组织相互作用的检测和解释能力。

3.4. 体内生物分布
在注射后多个时间点（5分钟、1小时、4小时和24小时）获取的T2加权MR图像显示了造影剂的动态和器官特异性分布。如图5A所示，随着时间的推移，在肝脏中观察到了强烈的且持续的信号下降（表明造影剂得到增强），这与MNDs在网状内皮系统中的积累一致。底部面板展示了MRI造影剂随时间的定量分析。肝脏显示出最高的造影剂增强效果，在4时达到约45%，并在24小时时保持相似水平。相比之下，肾脏的增强程度适中（约15%），在1至4小时之间达到峰值后略有下降。脾脏显示出轻微的短暂增加，而肌肉组织几乎无变化，表明非网状内皮组织中的MNDs积累非常少。图5B中的插图图突显了前5小时内造影剂摄取的早期动力学，证实肝脏相对于其他器官的摄取更快且更明显。这些结果表明肝脏组织对造影剂有优先摄取作用，这可能是由于吞噬活性和肝脏清除机制的作用。通过ICP-MS定量铁含量（在减去内源性铁含量后得到确认，见图5D）证实了肝脏的生物分布。对肝脏、肾脏、脾脏和肌肉的分析显示，肝脏中的铁含量显著较高，约为每克组织5.4 μg Fe3+。相比之下，其他器官的铁含量明显较低，分别为肾脏1.12 μg Fe3+、肌肉0.072 μg Fe3+和脾脏0.021 μg Fe3+。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像。图5. MND注射后MRI造影剂的体内增强和器官生物分布随时间的变化。(A) 在注射后5分钟、1小时、4小时和24小时，在7特斯拉磁场下获取的小鼠腹部T2加权MRI图像。肝脏中可见明显的信号低强度，表明MNDs的积累。对肝脏、肾脏、脾脏和肌肉进行了ROI分析。(B) 各器官的MRI造影剂增强百分比（%）随时间的定量分析。肝脏显示出最高且最持久的造影剂增强，大约在5小时达到峰值并持续到24小时。(C) 插图突出显示了0–6小时内的早期造影剂变化，其中肝脏的摄取速度最快，其次是肾脏和脾脏。肌肉在整个过程中几乎没有任何增强。(D) 在静脉注射MNDs后24小时，使用ICP-MS对器官中的铁含量进行定量。数值已标准化为野生型动物相应器官中的铁浓度。

尽管这项研究仅在一小群动物（N = 3）上进行，但MNDs静脉注射后的生物分布高度可重复，主要取决于粒子的物理化学性质，如大小、表面涂层、电荷和流体动力学直径。这些参数严重影响药代动力学和细胞摄取，导致在标准化条件下，MNDs主要在网状内皮系统（肝脏、脾脏）中一致积累。因此，尽管样本量有限，观察到的分布模式预计具有代表性。然而，需要进一步的研究来验证这些观察结果，加强发现的统计有效性，并评估系统的输送和长期稳定性，这些都是成功临床转化和进一步开发这一平台的关键步骤。从方法学的角度来看，本研究使用快速T2w成像监测了小鼠模型中MNDs的纵向分布。虽然T2w图像本身不是定量的，但这种方法允许我们在最短时间内跟踪造影剂的变化，这在文献中常用于动态评估造影剂。我们的结果表明，尽管MNDs的T2弛豫性很高，但在肝脏中的积累量较低，导致信号变化不大，这与ICP-MS的测量结果一致。尽管这种方法能够实现有效的纵向监测，但由于其定性特点，使用T2w成像存在局限性。为了克服这一点，未来的研究将采用完全定量的T2成像来评估粒子的器官特异性摄取。这将提供更精确的粒子分布和动力学评估，补充这里报道的发现。

4. 结论
磁纳米盘（MNDs）表现出双模式弛豫性，作为MRI造影剂具有巨大潜力。它们在超低场（<0.1 T）下的高r1弛豫性和3 T以上明显的r2增强效应使其适用于T1和T2成像应用。体外分析证实了与异质磁环境一致的双指数T2松弛特性，而体内成像显示主要的肝脏摄取以及延迟的肾脏和脾脏分布。与传统铁氧化物系统不同，MNDs结合了双模式弛豫性和涡流介导的激活能力，使其在结合MRI可见性和功能激活的诊疗应用中具有独特优势。因此，本研究为将来将MNDs作为多模式、可激活探针在神经技术和生物医学成像中的使用奠定了必要的弛豫学基础。

作者贡献：
DG、GF、NT、AC：概念化、正式分析、方法论、监督和写作。
EK和EDG：数据采集、分析和写作。
SBN、VDT、LS、UA、TG、FW、RS、RT、CP、AC、MS和AC：数据采集、分析和手稿编辑。
所有作者都批准了手稿的最终版本。

利益冲突：
无利益冲突需要声明。

缩写：
CTRL：对照
DLS：动态光散射
DMEM：Dulbecco改良 eagle培养基
DMSO：二甲基亚砜
EMA：欧洲药品管理局
FBS：胎牛血清
FDA：美国食品药品监督管理局
UGBCA：钆基造影剂
Hb：血红蛋白
ICP-MS：电感耦合等离子体质谱
IR：反转恢复，一种MRI脉冲序列
LoD：检测限
MNDs：磁铁矿纳米盘
MNPs：磁铁矿纳米颗粒
MRI：磁共振成像
MSM：多层多回波，一种磁共振成像扫描技术
MTT：甲基噻唑基二苯四唑溴化物，用于细胞活力测定
NMR：核磁共振
NSF：肾源性系统纤维化
PBS：磷酸盐缓冲盐水
PMAO：聚（马来酸酐-alt-1-十八烯）
RARER：快速采集与松弛增强，一种MRI扫描技术
RBC：红细胞
SAR：特定吸收率
SDS：十二烷基硫酸钠
SPIONs：超顺磁性铁氧化物纳米颗粒
ST%：饱和转移百分比，用于CEST成像
T1和T2：纵向和横向弛豫时间
TEM：透射电子显微镜
UP：超高纯度

数据可用性：
支持本文的所有实验数据，包括磁测量数据、弛豫测量数据集、成像文件和分析代码，均可向相应作者索取。所有数据符合英国皇家化学会的数据共享政策。数据访问没有限制。补充信息（SI）包括NMR弛豫测量的详细描述、用于幻影和体外研究的MRI采集协议、数据分析程序以及额外的表征数据和图表。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d5na01089f。