基于LC-MS技术对Metarhizium anisopliae菌附着器形成的分析及其对Opisina arenosella幼虫防御代谢的影响 杨旭 吴灿霞 张海宁 王东旭 蔡华新 吴辉 童英华

《Insects》：Analysis of Appressorium Formation in Metarhizium anisopliae and Its Impact on the Defense Metabolism of Opisina arenosella Larvae Based on LC-MS Yang Xu, Canxia Wu, Haining Zhang, Dongxu Wang, Huaxin Cai, Hui Wu and Yinghua Tong

　　**简单摘要**
本研究探讨了昆虫病原真菌Metarhizium anisopliae形成的附着器（appressorium）如何增强其对Opisina arenosella幼虫的致病性。通过使用硫代葡萄糖（sulforaphane）抑制附着器的形成，发现附着器形成率越高，其毒力越强，杀灭幼虫的速度也越快。附着器形成后，在幼虫表皮上检测到了102种差异化合物（如L-山梨醇、L-天冬氨酸），主要包括苯类、氨基酸和杂环化合物。同时，免疫防御、抗真菌反应和毒素降解的代谢途径也被激活。这些发现表明附着器在改变表皮代谢和触发宿主防御反应中起着关键作用，为理解真菌与昆虫表皮之间的相互作用提供了基础。

**摘要**
附着器是Metarhizium anisopliae在侵入宿主过程中形成的特化感染结构。为了研究附着器形成与真菌致病性之间的关联及其对昆虫表皮代谢的影响，研究人员使用不同浓度的硫代葡萄糖来抑制该真菌的附着器形成。评估了附着器形成率与对Opisina arenosella幼虫致病性之间的关系，并利用液相色谱-质谱（LC-MS）技术分析了附着器形成阶段表皮化合物的变化，从而阐明了昆虫表皮对附着器形成的化学响应。结果表明，Metarhizium anisopliae的附着器形成率与其致病性呈显著正相关（p ≤ 0.05）。随着附着器形成率的增加，其对O. arenosella幼虫的致病性增强，杀灭速度加快。LC-MS代谢组学分析显示，附着器形成后，鉴定出102种O. arenosella幼虫特有的表皮化合物，主要包括苯类及其衍生物、氨基酸和杂环化合物。此外，与免疫防御（酪氨酸代谢）、抗真菌防御（组氨酸代谢）和毒素降解（黄酮类化合物降解）相关的代谢途径也被激活。这些结果表明，附着器在Metarhizium anisopliae的宿主感染过程中起着重要作用，显著改变了表皮代谢，并激活了宿主的防御和解毒相关代谢途径。本研究为进一步研究真菌与昆虫表皮之间的相互作用提供了理论基础。

**1. 引言**
Metarhizium是一种应用广泛的病原真菌，能够寄生在8个目、42个科的200多种昆虫上，同时也能感染螨虫和线虫[1]。研究表明，它对多种害虫具有显著的防治效果，例如Locusta migratoria manilensis Meyen[2]、Opisina arenosella Walker[3]、Hyphantria cunea Drury[4]和Brontispa longissima Gestro[5]。Metarhizium anisopliae成功感染宿主是一个复杂的过程，其中附着器的形成是一个关键步骤——真菌的分生孢子与宿主表皮发生化学相互作用，从而实现侵入。在昆虫病原真菌与其宿主之间的相互作用中，附着器起着核心作用[6]。附着器通过酶促降解和穿透钉（penetration pegs）施加的机械压力帮助真菌突破昆虫表皮[7]。附着器的形成对于Metarhizium anisopliae穿透昆虫表皮并在宿主体内定殖至关重要[8]。Lü等人发现，附着器的形成是真菌致病性的关键因素[6]。附着器富含线粒体、高尔基体、内质网和核糖体，由于其高代谢活性，这些细胞器能够合成并分泌大量降解酶，如蛋白酶、脂肪酶和几丁质酶[9]。这些酶在施加机械压力和溶解宿主表皮方面起着关键作用，从而促进感染[10,11]。在附着器尖端，穿透钉生长并分泌表皮降解酶，导致宿主表皮蜡层逐渐溶解，形成蜂窝状孔洞并破坏表皮，使昆虫表皮分解为营养物质，为真菌的侵入创造有利条件[12]。尽管附着器在感染中的关键作用已被证实，但其形成机制及其与昆虫表皮化合物的相互作用仍需进一步研究。本研究通过调节硫代葡萄糖浓度来抑制附着器的形成，探讨了Metarhizium anisopliae的分生孢子形成与其对O. arenosella致病性之间的关联，并利用液相色谱-质谱（LC-MS）技术测量了分生孢子形成前后幼虫表皮化合物的变化，为Metarhizium anisopliae对宿主昆虫的致病机制提供了理论支持。

**2. 材料与方法**
2.1. 培养基
- **YEMDT液体培养基**：酵母提取物1克和水1000毫升，经过高压灭菌（0.103 Mpa，121 °C，20分钟），冷却后加入海藻糖（纯度99.50%，Glpbio，Montclair，CA，美国），最终浓度为1 mg/mL。
- **PPDA固体培养基**：去皮土豆200克、葡萄糖20克、蛋白胨10克、琼脂20克和水1000毫升，同样经过高压灭菌（0.103 Mpa，121 °C，20分钟）。

2.2. 昆虫宿主
从福建省厦门市翔安区（26.969 °N，118.972 °E）收集Opisina arenosella Walker幼虫。幼虫在控制气候室中饲养，温度为26 ± 1 °C，相对湿度为80%，并以新鲜的华盛顿棕榈叶（Washingtonia filifera）为食。

2.3. 真菌菌株及孢子悬浮液的制备
使用的真菌菌株为Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokīn MaHA-01[3]。经过三轮传代培养后，将其接种在PPDA斜面上并在恒定温度下培养以产生孢子。然后用无菌水收集孢子，以150 rpm的速度涡旋20分钟，制备浓度为1.0 × 10^8孢子/mL的孢子悬浮液以供后续使用。

2.4. 附着器形成率的调控
参考Wang等人的方法，使用硫代葡萄糖（纯度98.00%，Glpbio，Montclair，CA，美国）来抑制Metarhizium anisopliae的附着器形成率[13]。使用YEMDT液体培养基配制含有不同浓度硫代葡萄糖的混合液（0.00 mg/mL、0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.05 mg/mL和0.08 mg/mL）。用这些混合液制备浓度为5 × 10^7孢子/mL的孢子悬浮液，在26 ± 1 °C、150 r/min的恒温摇床（ZQTY-50ES，上海，中国）中培养。在12小时、24小时、36小时、48小时和72小时时，分别取100 μL样品进行光学显微镜（E100，Nikon，Kumagaya City，日本）观察。每次观察五个随机视野，每个视野计数100个以上的分生孢子，以确定萌发的孢子和形成附着器的孢子数量。每种硫代葡萄糖浓度为一个处理组，每个处理组重复五次。统计分析Metarhizium anisopliae分生孢子的萌发率和分生孢子形成率。

2.5. 不同附着器形成率下Metarhizium anisopliae对Opisina arenosella幼虫的致病性测定
发现不同浓度的硫代葡萄糖显著抑制了附着器的形成后，使用混合溶液制备浓度为5 × 10^7孢子/mL的孢子悬浮液。采用浸渍法将O. arenosella的三龄幼虫头部朝下浸入孢子悬浮液中。15秒后取出，放在滤纸上自然风干，然后转移到一次性塑料盒（25 cm × 10 cm × 10 cm）中。将这些盒子放入人工气候室中，温度为26 ± 1 °C，相对湿度为80 ± 1%，并以新鲜的华盛顿棕榈叶为食。每种硫代葡萄糖浓度为一个处理组，每个处理组重复五次，每个处理组包含20只以上幼虫。将幼虫浸入无菌水中作为对照（CK）。此外，还使用浓度为0.08 mg/mL的硫代葡萄糖溶液在YEMDT液体培养基中进行毒性验证。24小时后观察并记录幼虫死亡率。当幼虫对刷触无反应并出现僵直死亡时，视为被有效杀死。将死亡幼虫放入26 ± 1 °C的恒温培养箱中观察Metarhizium anisopliae在幼虫体上的生长情况。接种48小时后，检查每个浓度组的五只幼虫的分生孢子形成情况。使用无菌手术剪刀去除头部和尾部，沿背腹缝合线切开，提取5 mm2的腹部组织。用无菌刀片轻轻刮除表皮内侧的多余组织和脂肪，将表皮向上展开在无菌显微镜载玻片上。然后加入10 μL溶液A（含有10% KOH和10%甘油的水溶液）和10 μL溶液B（0.001% Calcofluor White M2R染色溶液）。染色1分钟后，用超纯水冲洗3秒，然后在荧光显微镜下观察附着器。

2.6. Metarhizium anisopliae分生孢子形成期间O. arenosella幼虫表皮化合物和代谢物的测定
2.6.1. 幼虫上孢子附着动态的测定及采样时间
采用浸渍法接种：将Metarhizium anisopliae的四龄幼虫头部朝下浸入浓度为1.0 × 10^8孢子/mL的O. arenosella分生孢子悬浮液中15秒，然后取出并放在滤纸上风干。饲养程序与2.5节相同。接种后8小时，每2小时随机选择5只幼虫观察O. arenosella的孢子萌发和孢子载体形成情况。观察方法与2.5节相同。

2.6.2. 幼虫表皮化合物和代谢的测定
接种浓度和方法与2.6.1节相同。在附着器形成前后，随机选择大小相似的十只四龄O. arenosella幼虫，将其放入冰浴中直至昏迷，然后浸入0.1% Triton X-100水溶液（Solarbio，北京，中国）中，轻轻涡旋冲洗10–20秒；接着浸入色谱纯度为hexane（Sigma-Aldrich，Darmstadt，德国）中冲洗20–30秒，去除表面真菌脂质，用超纯水快速冲洗，再用无菌滤纸吸干表面水分。之后在超净工作台上用空气干燥[15]。用无菌手术剪刀去除头部和尾部，切除腹部背板的中间部分（5 mm2），去除脂肪组织和气管[16]。将样品放入2 mL无菌冻存管中，迅速冷冻在液氮中1分钟，研磨后储存以备后续分析。每个附着器形成前后的组各准备五个生物学重复样本，每个处理组共50只幼虫。将幼虫浸入无菌水中相同时间作为对照。

O. arenosella的表皮化合物使用Thermo Fisher Scientific Vanquish UHPLC系统（Thermo Fisher Scientific，Dreieich，德国）和Orbitrap Exploris 120质谱仪（Thermo Fisher Scientific，德国）进行分析。色谱分离采用Waters ACQUITY UPLC BEH Amide柱（1.8 μm，2.1 × 100 mm），以研究Metarhizium anisopliae形成前后O. arenosella表皮化合物的变化。具体操作如下：将100 mg研磨后的样品转移到EP管中；加入500 μL 80%甲醇（LC-MS Garde，CNW Technologies，Düsseldorf，德国）水溶液，涡旋后置于冰上孵育5分钟，然后在4 °C、15,000 × g下离心20分钟（使用D3024R离心机，Scilogex，Rocky Hill，CT，美国）。收集上清液并用LC-MS级水稀释至甲醇含量为53%，再在相同条件下离心20分钟。收集上清液用于LC-MS分析。此外，将各样品等体积混合制备质量控制（QC）样本[17]。

LC分析在正离子和负离子模式下进行，柱温为40 °C，流速为0.2 mL/min。正离子模式下，流动相A为0.1%甲酸（LC-MS Garde，CNW Technologies，Düsseldorf，德国），流动相B为甲醇；负离子模式下，流动相A为5 mM醋酸铵（LC-MS Garde，SIGMA-ALDRICH，St. Louis，MO，美国，pH 9.0），流动相B为甲醇。梯度洗脱程序如下：0–1.5分钟，2% B；1.5–3.0分钟，85% B；3.0–10.0分钟，100% B；10.0–10.1分钟，2% B；10.1–11.0分钟，2% B。质谱条件为：扫描范围m/z 100–1500，采用电喷雾离子化（ESI）源。参数设置为喷雾电压3.5 kV、鞘气流量35 psi、辅助气体流量10 L/min、离子传输管温度320 °C、射频透镜级别60以及辅助气体加热器温度350 °C。数据在正离子和负离子模式下均被采集[18]。2.7 数据统计分析数据使用Excel 2016进行组织，并通过SPSS 27.0软件进行统计分析。首先应用Probit回归分析剂量-死亡率数据以拟合毒力回归方程，得出半数致死时间（LT50）、半数致死浓度（LC50）和相关系数R。Duncan的多重范围检验用于多重比较。关于M. anisopliae分生孢子在O. arenosella尸体上的萌发数据在Excel中处理，并使用Origin 2024绘制散点图。原始LC-MS数据使用Compound Discoverer 3.3获取，并经过包括峰提取和对齐在内的数据处理。代谢物鉴定使用mzCloud、mzVault和Masslist数据库进行质谱峰识别。鉴定出的代谢物使用KEGG、HMDB和IPIDMaps数据库进行注释。对于多变量统计分析，代谢组学数据使用metaX软件（v1.6.0）进行处理，以进行PCA和OPLS-DA分析，得出每个代谢物的VIP值。单变量分析基于t检验计算p值和倍数变化（FC）值。差异表达的代谢物根据VIP > 1、p < 0.05和FC ≥ 2或FC ≤ 0.5的标准进行筛选。使用R包ggplot2（v3.5.1）生成火山图，结合VIP、log2(FC)和?log10(P)来识别目标代谢物。差异代谢物的皮尔逊相关系数使用R函数计算，显著性在p < 0.05时进行测试。然后使用corrplot包可视化相关图。接着，使用ggplot2生成气泡图。代谢途径使用KEGG数据库进行分析，通过x/n > y/n和p < 0.05确定富集情况。3. 结果 3.1 不同浓度硫代葡萄糖苷对Metarhizium anisopliae萌发率的抑制作用图1显示了Metarhizium anisopliae在液体发酵培养基中分生孢子萌发后的菌丝管和吸器形态。不同浓度硫代葡萄糖苷下M. anisopliae分生孢子萌发率和吸器形成率的统计分析结果见补充表S1。如补充表S1所示，随着硫代葡萄糖苷浓度的增加，分生孢子萌发率和吸器形成率均下降。对于分生孢子萌发率，0 mg/mL处理组的萌发率在所有时间点均显著高于其他处理组（p ≤ 0.05）。在36小时时，萌发率达到（92.40 ± 1.34）%，显著高于其他处理组（p ≤ 0.05），之后萌发率趋于稳定。在72小时时，所有处理组的分生孢子萌发率均超过80.00%。关于吸器，0 mg/mL处理组的形成率在所有时间点均显著高于其他处理组（p ≤ 0.05）。在72小时时，各处理组之间的吸器形成率显示出显著的剂量-反应梯度（p ≤ 0.05），其中0 mg/mL处理组的形成率为（66.60 ± 1.67）%，显著高于其他四组。随着硫代葡萄糖苷浓度的增加，吸器形成率显著下降（p ≤ 0.05）。这些结果表明，特定浓度的硫代葡萄糖苷可以显著抑制（p ≤ 0.05）M. anisopliae吸器的形成。3.2 不同吸器形成率的Metarhizium anisopliae对Opisina arenosella幼虫的致病性图2显示了Metarhizium anisopliae分生孢子和吸器在幼虫体内的荧光染色显微图像。在不同浓度的硫代葡萄糖苷抑制吸器形成率后，对M. anisopliae对O. arenosella幼虫的致病性进行了统计分析，结果见补充表S2。从补充表S2可以看出，当M. anisopliae的吸器形成率较高（硫代葡萄糖苷浓度为0 mg/mL）时，5天和7天的累积校正死亡率显著高于其他处理组（p ≤ 0.05）。7天时的累积校正死亡率为82.76%，半数致死时间（LT50）为4.82天。当吸器形成率较低（硫代葡萄糖苷浓度为0.08 mg/mL）时，椰子网虫幼虫的死亡率最低，7天时的累积校正死亡率为25.29%，显著低于其他处理组（p ≤ 0.05），半数致死时间为8.74天。在YEMDT和硫代葡萄糖苷混合溶液处理下，O. arenosella幼虫的死亡率与对照组（CK）无显著差异，表明该混合溶液对O. arenosella幼虫无毒。因此，可以得出结论：M. anisopliae的吸器形成率与其对昆虫的致病性呈正相关。吸器形成率越高，其致病性越强。3.3 昆虫体表上吸器形成的动态及采样时间分析对感染了M. anisopliae的O. arenosella幼虫体表上分生孢子的萌发和吸器形成进行了统计分析。结果见图3。从图中可以看出，接种后10小时，分生孢子开始萌发，萌发率为3.60%。随着时间的推移，38小时时萌发率显著增加到90.40%，然后趋于稳定。20小时时，萌发的分生孢子开始形成吸器。22至30小时期间，吸器形成过程显著加速。48小时时，吸器形成率达到65.40%，然后趋于稳定。从结果可以得出，吸器形成前的采样时间为接种后18小时，而吸器形成后的采样时间为接种后48小时。3.4 Metarhizium anisopliae的吸器形成对Opisina arenosella幼虫角质层代谢物的影响分析 3.4.1 正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）结果OPLS-DA结果显示处理组之间存在显著的代谢差异。具体而言，比较吸器形成前组与时间匹配的对照组的OPLS-DA模型表现出优异的性能参数（R2X = 0.495，R2Y = 0.991，Q2Y = 0.848）。两组沿t1主成分（31.30%）明显分离，表明实验处理对代谢物组成有强烈的调节作用（图4A）。相比之下，虽然比较吸器形成后组与时间匹配的对照组的OPLS-DA模型也具有较好的拟合度（R2X = 0.370，R2Y = 0.993，Q2Y = 0.657），但沿t1主成分的分离度相对较弱（图4B）。这表明这两组之间的代谢变化可能受到更复杂的生物调控网络的影响，或者代谢改变的幅度相对较小。总体而言，所有处理组与对照组相比都显示出不同的代谢谱。此外，在所有OPLS-DA模型中，R2Y值接近1，Q2Y值超过了0.5的临界阈值，支持了分析的可靠性和稳定性。图4. Opisina arenosella幼虫体表化合物在Metarhizium吸器形成前后的OPLS-DA得分图。（A）吸器形成前。（B）吸器形成后。注意：x轴显示预测组分的得分。该轴上的差异对应于组间的系统变异。y轴显示正交组分的得分，该轴上的分布反映了组内的变异。每个轴旁边的百分比表示该组分解释的数据集总方差的百分比。模型预测性能使用Q2衡量：当Q2 > 0.5时，模型被认为是统计上有效的。3.4.2 差异代谢物分析差异代谢物分析显示，与时间匹配的对照组相比，在吸器形成前检测到410种差异角质层代谢物。下调的代谢物数量（349种）远多于上调的代谢物（61种），表明Metarhizium anisopliae主要在吸器形成前对宿主角质层代谢网络产生抑制作用。上调的代表性代谢物包括pheophorbide a、urobilin和4-氯-2-硝基苯甲醇。相反，下调的代表性代谢物包括27-羟基胆固醇、1-甲基黄嘌呤和valeryl-4-羟基缬沙坦。这些变化主要与咖啡因代谢和卟啉代谢途径相关（图5A）。与时间匹配的对照组相比，在吸器形成后检测到151种差异代谢物，包括91种上调和60种下调的代谢物。显著上调的角质层代谢物包括次级代谢物epigallocatechin gallate、spermidine和glycyl-L-phenylalanine，而显著下调的代谢物包括fumonisin B2、manghaslin和GDP-L-fucose（图5B）。图5. Opisina arenosella幼虫体表化合物在Metarhizium吸器形成前后的火山图。（A）吸器形成前。（B）吸器形成后。注意：火山图中，每个点代表一个代谢物。显著上调的代谢物用红色表示，显著下调的代谢物用蓝色表示。每个符号的大小与其变量重要性（VIP）得分成正比。x轴表示log2转换后的倍数变化，较大的绝对值表示实验组之间的丰度差异较大。y轴显示?log10（p值），较高的值对应于差异表达的统计显著性较高。3.4.3 Metarhizium anisopliae在幼虫体表形成前后差异化合物的文氏图使用文氏图比较了M. anisopliae在O. arenosella幼虫体表形成前后的差异角质层化合物（图6）。如图6所示，在吸器形成前检测到410种差异角质层化合物，而在吸器形成后检测到151种差异角质层化合物。其中，361种差异角质层化合物仅存在于吸器形成前阶段，102种仅存在于吸器形成后阶段（详见补充表S3），另有49种差异角质层化合物同时存在于两个阶段。图6. Metarhizium吸器形成前后幼虫体表差异化合物的文氏图。注意：M18表示吸器形成前的接种组（18小时）；CK18表示吸器形成前的对照组（18小时）；M48表示吸器形成后的接种组（48小时）；CK48表示吸器形成后的对照组（48小时）。3.4.4 吸器形成后Opisina arenosella幼虫体表独特差异角质层化合物的类别对吸器形成后Opisina arenosella幼虫体表独特差异角质层化合物的类别进行了统计分析，结果见图7。如图7所示，O. arenosella幼虫体表中有73种代谢物显著上调，包括L-山梨醇、sparfloxacin、N-乙酰-D-葡萄糖胺、L-天冬氨酸和2,6-二羟基苯甲酸。这些上调的化合物主要属于苯类及其衍生物、氨基酸及其衍生物和杂环化合物，其中苯类及其衍生物占24.7%。图7. Metarhizium吸器形成后Opisina arenosella幼虫体表独特化合物的类型。注意：（A）显著上调的化合物。（B）显著下调的化合物。此外，29种角质层化合物显著下调，包括林可霉素、D-古洛诺-1,4-内酯、luteolin和manghaslin以及4,5-二羟基邻苯二甲酸。这些下调的化合物主要是脂肪酸、苯类及其衍生物和黄酮类化合物，其中脂肪酸占20.7%。3.4.5 Metarhizium anisopliae感染期间O. arenosella幼虫体表化合物的KEGG富集分析KEGG通路富集分析显示处理组之间的代谢途径调节存在显著差异。与时间匹配的对照组相比，在吸器形成前注释了152条代谢途径，其中25条途径显示出显著差异（p ≤ 0.05），9条途径显示出高度显著差异（p ≤ 0.01）。差异显著且差异代谢物数量较多的途径包括Tropane、哌啶和吡啶生物碱生物合成、苯丙素生物合成和黄酮生物合成（图8A）。这些结果表明，宿主通过增强这些防御性次级代谢途径的活性，快速合成具有抗真菌、抗氧化和信号传导功能的生物碱、黄酮类和苯丙素，从而系统性地抵抗M. anisopliae的感染和扩散。图8. Metarhizium anisopliae在Opisina arenosella幼虫体表形成前后角质层化合物的气泡图。（A）吸器形成前。（B）吸器形成后。与形成附着器后的时间匹配对照组相比，共注释了101条代谢途径，其中15条途径显示出显著差异（p ≤ 0.05）。主要受影响的途径包括酪氨酸代谢、组氨酸代谢和黄酮类化合物的降解（图8B）。这表明，在M. anisopliae形成附着器后，宿主激活了这些关键代谢途径，以增强免疫防御、抗真菌反应和毒素降解机制，从而系统性地抵抗附着器介导的感染。4. 讨论在M. anisopliae的感染过程中，附着器起着至关重要的作用。附着器富含线粒体、高尔基体、内质网和核糖体，这些细胞器使真菌能够对宿主表皮施加集中的机械力和酶活性，从而有效穿透宿主组织并为后续感染奠定基础[19]。萝卜硫素是一种天然异硫氰酸酯化合物，主要存在于十字花科蔬菜中，如西兰花、卷心菜和花椰菜。研究表明，萝卜硫素可以通过多种机制发挥抗菌作用，包括抑制细菌毒力因子、减少生物膜形成和降低细菌的氧化应激耐受性[20]。萝卜硫素不仅可以显著抑制白色念珠菌的生长，还可以抑制其生物膜形成和菌丝发育[21]。此外，萝卜硫素还可以抑制球孢白僵菌分生孢子的萌发和附着器的形成，显著降低球孢白僵菌对Solenopsis invicta的致病性[22]。在本研究中，发现萝卜硫素浓度能够显著抑制M. anisopliae的附着器形成率。而且，附着器形成率与真菌致病性呈正相关：较高的附着器形成率导致更强的毒力和更短的致死时间。Meng报告称，删除核糖核酸酶1使得M. anisopliae难以从外部环境中获取足够的营养进行生长和发育，从而延迟了附着器的形成。在营养受限条件下，M. anisopliae无法吸收足够的营养来满足附着器形成的需求；因此，附着器的形成被推迟，导致致病性显著降低[23]。Duan等人将M. anisopliae MPL1基因中的磷酸化位点苏氨酸残基突变为丙氨酸和异亮氨酸，这降低了附着器形成率，进而降低了杀虫活性[24]。Meng还发现，删除M. robertsii Ste12样转录因子（MrSt12）会消除附着器的形成并完全消除致病性[25]。Meng证明附着器的形成对于Magnaporthe oryzae侵入水稻是必需的；删除Mo WHI2和Mo PSR1后，附着器功能异常，穿透钉的形成比例显著减少，侵入性菌丝扩展速度减慢[26]。He等人使用三环唑改变了Exserohilum turcicum在附着器发育和成熟过程中的膨压，发现宿主感染效率也显著降低[27]。总体而言，这些发现表明调节附着器的形成和功能可以有效地影响病原真菌的感染能力，为农业病害的控制提供了新的思路和策略。我们的结果显示，在形成附着器后，几条代谢途径显著富集，包括组氨酸代谢、酪氨酸代谢和黄酮类化合物的降解。具体来说：(1)酪氨酸代谢与免疫防御机制密切相关。先前的研究表明，Lymantria dispar幼虫在病毒感染后酪氨酸代谢发生了显著变化，这与能量代谢和神经系统相关基因的上调有关[28]。这表明酪氨酸代谢参与了感染后昆虫的行为调节。(2)在昆虫免疫系统中，组氨酸代谢通过多种机制参与抗真菌防御。组氨酸衍生的代谢物（如组胺）在免疫反应中充当信号分子，并能激活昆虫的免疫防御机制[29]。这些代谢物也可能作为信号诱导抗真菌肽基因的表达，从而增强抗真菌能力[30]。此外，组氨酸代谢物咪唑乙酸在鳞翅目昆虫（如家蚕）中表现出广谱抗菌活性。其生物合成途径中的关键酶组氨酸脱羧酶在血淋巴感染后表达增加了3-5倍[31]。对黑腹果蝇的研究进一步表明，缺乏组氨酸激酶的个体清除革兰氏阴性细菌的能力降低了40%以上[31]。(3)黄酮类化合物的降解途径对昆虫的生命活动至关重要，因为许多黄酮类化合物具有杀虫或拒食作用[32]。例如，棉花中的黄酮类化合物如芸香苷、槲皮素和异槲皮素可以抑制Helicoverpa armigera的生长和化蛹。这些化合物通过改变取食行为和减少植物消耗来抑制昆虫的生长和发育[33]。黄酮类化合物还可以抑制昆虫消化酶的活性，从而降低食物利用效率。例如，单宁化合物可以与蛋白质结合形成稳定的交联复合物，抑制消化酶活性并减少昆虫的营养吸收[34]。昆虫具有代谢和降解黄酮类化合物的代谢酶。例如，肠道细菌Flavonifractor plautii中的黄酮还原酶可以启动黄酮和黄酮醇的降解。此外，某些乳球菌和肠球菌菌株对黄酮类化合物的特定C-和O-糖苷表现出糖基化活性，导致结构改变，从而降低毒性[35]。此外，一些昆虫可以通过上调体内解毒酶的表达来增强黄酮类化合物的代谢和解毒能力[36]。我们的结果显示，在M. anisopliae感染之前和之后，O. arenosella幼虫的角质层化合物与对照组有显著差异。在M. anisopliae感染形成附着器后，鉴定出102种独特的差异角质层化合物，主要包括苯类及其衍生物、氨基酸及其衍生物和杂环化合物。其中几种化合物值得进一步讨论：(1)斯帕氟沙星具有一定的抗真菌活性。Au-aff等人报告称，斯帕氟沙星可以抑制白色念珠菌和黑曲霉的生长[37]。(2)2,6-二羟基苯甲酸，也称为龙胆酸，是一种具有多种生物活性的化合物。其分子式为C7H6O4，结构中含有两个酚羟基和一个羧基，赋予其显著的抗氧化特性和潜在的抗菌活性。尽管关于其抗真菌效果的研究仍然有限，但相关类似物的证据表明，例如Hu等人报告称，藜麦种子中的活性成分2,5-二羟基苯甲酸具有一定的抗真菌特性[38]。(3)磺胺多辛竞争性地抑制二氢蝶酸合成酶，阻止对氨基苯甲酸与蝶啶焦磷酸缩合形成二氢蝶酸。这会抑制叶酸的生物合成，由于叶酸缺乏，细菌和真菌无法合成DNA，最终导致死亡[39,40]。在M. anisopliae感染宿主昆虫的过程中，与宿主角质层的化学相互作用非常复杂。角质层化合物可以在感染期间为M. anisopliae提供营养，同时发挥化学防御作用或作为诱导真菌反应的化学信号。在本研究中，我们初步研究了M. anisopliae形成附着器期间O. arenosella幼虫角质层化合物的变化；然而，这些化合物在附着器形成过程中的功能作用和潜在机制仍有待进一步验证。5. 结论本研究发现：(1)昆虫体壁不是一个被动屏障，而是可以通过代谢组重编程动态响应Metarhizium anisopliae的感染。(2)Metarhizium anisopliae与宿主昆虫角质层之间的相互作用不仅涉及机械和酶促水解过程，还包括复杂的化学信号和代谢紊乱。本研究建立了真菌-昆虫体壁相互作用的新框架，为阐明Metarhizium anisopliae的致病机制及其生物控制应用提供了新的理论基础。需要进一步的研究来揭示调节附着器发育和真菌致病性的体壁代谢物的分子途径。补充材料以下支持信息可在https://www.mdpi.com/article/10.3390/insects17050476/s1下载：表S1：Metarhizium anisopliae的孢子萌发率和附着器形成率；表S2：Metarhizium anisopliae的不同附着器形成率及其对Opisina arenosella的致病性；表S3：Metarhizium附着器形成后Opisina arenosella幼虫体壁特有的化合物。