基于RPA-CRISPR/Cas12a系统开发一种用于检测嗜水气单胞菌的快速可视化检测平台

《Aquaculture》：Development of a rapid and visual detection platform for Aeromonas salmonicida based on the RPA-CRISPR/Cas12a system

　　

Fusheng Tan | Ran Zhao | Jing Wang | Di Wang | Shaowu Li

中国科学院黑龙江水产科学研究院黑龙江水域动物疾病与免疫技术重点实验室，哈尔滨 150070，中国

摘要

Aeromonas salmonicida是一种致病性革兰氏阴性细菌，是鲑科鱼类疖病的病原体，对全球水产养殖业造成了巨大的经济损失。因此，快速准确地鉴定水生细菌病原体是制定和实施针对性强、有效的疾病控制措施的基础。我们开发了一种针对A. salmonicida的fstA基因保守区域的快速检测平台。该平台结合了重组酶聚合酶扩增（RPA）技术、CRISPR/Cas12a系统以及侧向流动条（LFS）读数技术，实现了结果的可视化解读。这种方法显著缩短了检测时间，同时减少了对专业技术人员和专用设备的依赖。性能评估显示其具有优异的特异性和灵敏度：RPA-CRISPR/Cas12a荧光类型的灵敏度为每反应1×10⁰个拷贝，而RPA-CRISPR/Cas12a-LFS类型的灵敏度为每反应1×10²个拷贝。在特定测试中，使用其他8种常见的水产养殖病原菌作为对照，结果表明该方法仅对A. salmonicida产生特异性反应，未与其他水生病原菌发生交叉反应。此外，该检测方法在加标实验样本和临床鱼类样本中均表现出良好的效果，证明了其在实际应用中的潜力。总之，本研究开发的基于RPA和CRISPR/Cas12a的检测平台在促进A. salmonicida的早期诊断和现场快速检测方面具有显著的实用价值。

引言

A. salmonicida是一种属于Aeromonas属的非运动性革兰氏阴性细菌（Reith et al., 2008）；它最初于1894年从患病的Salvelinus fontinalis中分离出来（Bernoth, 1997）。随后，这种细菌还从Oncorhynchus mykiss（Kirkan et al., 2003）、Psetta maxima（Lago et al., 2012）、Platichthys stellatus（Woo et al., 2025）、Siniperca chuatsi（Lin et al., 2020）和Cyprinus carpio（Pradhan et al., 2023）等鱼类中分离出来。研究表明，A. salmonicida包含多个亚种，如A. salmonicida subsp. salmonicida、A. salmonicida subsp. masoucida、A. salmonicida subsp. achromogenes、A. salmonicida subsp. smith和A. salmonicida subsp. pectinolytica（Boone and Castenholz, 2001）。在A. salmonicida的五个亚种中，A. salmonicida subsp. salmonicida和A. salmonicida subsp. masoucida因其强烈的致病性和高流行率而备受关注（Dallaire-Dufresne et al., 2014; Kim et al., 2024; Woo et al., 2025）。被A. salmonicida

章节片段

细菌菌株和质粒构建

本研究中使用的所有细菌菌株均列于表1中。A. salmonicida中的fstA基因具有相对保守的序列，因此被选为检测目标。我们首先扩增了fstA基因序列（GenBank登录号：X87995.1），然后将扩增片段连接到pUC19质粒（Thermo Fisher Scientific，美国）上。随后，将含有该片段的质粒导入表达能力强的E. coli DH5α细胞（TransGen Biotech，北京，中国）中

使用CRISPR/Cas12a检测A. salmonicida

为了实现A. salmonicida的快速诊断，我们建立了一种基于CRISPR/Cas12a的检测方法，该方法使用Cas12a蛋白、靶向特定的crRNA和荧光报告探针（FAM-N7-BHQ1）。我们选择fstA基因作为检测目标，因为该基因在A. salmonicida中具有高度保守性和特异性（Beaz-Hidalgo et al., 2013; Keeling et al., 2013）。通过比较15个不同A. salmonicida菌株的基因组序列，我们选择了5种crRNA

讨论

在鱼类养殖过程中，A. salmonicida是一种常见的细菌病原体（Bernoth, 1997），它引起的疾病在全球水产养殖业中广泛存在（Dallaire-Dufresne et al., 2014）。这种疾病通常伴随着高发病率和死亡率。早期检测和及时诊断对于预防和控制疫情至关重要（Imbeault et al., 2006）。PCR及相关基于核酸的方法仍是实验室检测和鉴定的主要手段（Siqueira Jr

结论

在这项研究中，我们发明了一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的A. salmonicida检测方法。该方法使用高度特异性的fstA基因作为检测目标，检测结果可以通过LED 470 nm光或LFS读取。整个检测过程大约需要一小时完成，且无需复杂的实验设备或专业人员。与其他检测方法相比，该方法具有较高的特异性、灵敏度和较短的检测时间

CRediT作者贡献声明

Fusheng Tan：方法学设计、概念构思、初稿撰写。Ran Zhao：验证、软件开发、数据分析整理。Jing Wang：结果可视化、资源获取、调查分析。Di Wang：项目监督、项目管理、撰写及审稿编辑。Shaowu Li：项目监督、资金申请、撰写及审稿编辑。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本研究报告的任何已知利益冲突或个人关系。

致谢

感谢黑龙江省自然科学基金（ZD2025C010）和中央公益性科研机构基础研究基金，CAF（2023TD45）的支持。