从罗马尼亚的蜜蜂（Apis mellifera）中分离出的一种具有显著遗传差异的黑蜂王细胞病毒的完整基因组序列已通过编程技术获得

《Microbiology Resource Announcements》：Coding-complete genome sequence of a divergent black queen cell virus strain identified from honeybees (Apis mellifera) in Romania

　　

摘要

我们报告了一种新型黑色蜂王细胞病毒株（BQCV-Ro）的8,451个核苷酸的完整基因组序列。该病毒株是通过回顾性分析来自欧洲的Apis mellifera样本的宏基因组病毒组数据鉴定出来的。基因组组装得到了广泛的读取映射支持，具有100%的水平覆盖率和约338,171×的平均测序深度，并且与BQCV Yeongdeok分离株具有94.3%的同一性。

声明

黑色蜂王细胞病毒（BQCV）属于Triatovirus属（Dicistroviridae科），是Apis mellifera的主要病毒病原体（1）。虽然在成年蜜蜂中通常无症状，但在高病毒载量下会导致蜂王幼虫死亡，其特征是蜂王细胞壁变黑（2）。在这里，我们描述了一种通过重新分析最初在欧盟资助的B-GOOD项目框架内收集的蜜蜂宏基因组数据集而鉴定出的新型BQCV病毒株（BQCV-Ro）（3）。

该样本来源于位于纬度46.7598、经度23.574的一个看似健康的罗马尼亚蜜蜂蜂箱，采集时间为2020年7月17日。解剖了10只工蜂的肠道，并将它们的直肠内容物混合后，按照NetoVIR协议处理以富集DNA和RNA病毒颗粒（4）。样本首先在3000转/分钟的转速下使用2.8毫米氧化锆珠子（Precellys）进行匀浆处理1分钟，然后在17,000 × g的离心力下离心3分钟，通过0.8 μm的PES过滤器过滤，并用核酸酶处理以去除宿主和环境的核酸。使用QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN）提取RNA和DNA（不包含载体RNA）。提取物经过逆转录和随机扩增（WTA2，Merck）处理后，使用Nextera XT试剂盒（Illumina）构建Illumina sequencing文库，最终在NovaSeq 6000（Illumina）平台上进行测序，采用150 bp的配对末端读长。原始的配对末端读长通过Trimmomatic v.0.39进行质量过滤和接头切除（5）。通过将读长与Apis mellifera参考基因组（GCF_003254395.2）对齐（使用Bowtie2 v.2.5.16），计算去除了宿主来源的序列。剩余读长的de novo组装使用metaSPAdes v3.15.3完成。使用DIAMOND v2.0.9和NCBI非冗余（nr）数据库（2023年3月17日下载）对获得的contigs进行分类，并通过BLASTn搜索NCBI核苷酸（nt）数据库（2023年3月17日下载）进行补充。除非另有说明，所有软件工具均使用默认参数。BQCV-Ro病毒株是在罗马尼亚的一个蜜蜂群落中夏季鉴定出来的，其基因组包含8,451个核苷酸，GC含量为40.2%，与科成员典型的34–45%范围一致（7）。读取映射显示100%的水平覆盖率和约38,171×的平均深度。使用NCBI ORFfinder（标准遗传密码；最小长度300 nt）de novo预测开放阅读框（ORFs），鉴定出两个主要ORF，它们之间由316 nt的基因间区域分隔。针对NCBI nr数据库的BLASTp分析显示，ORF1（4,887 nt）与黑色蜂王细胞病毒的非结构多蛋白编码区（访问号WIL00273.1）具有98.4%的氨基酸同一性（100%覆盖率），而ORF2（2,454 nt）与结构多蛋白编码区（访问号ABS82440.1）具有98.7%的同一性（100%覆盖率）。对完整序列的BLASTn分析显示，与来自韩国的BQCV Yeongdeok株（GenBank访问号OR496416.1）具有94.3%的核苷酸同一性（100%查询覆盖率）。这一序列的鉴定扩展了东欧Apis病原体的已知遗传图谱，并强调了挖掘现有宏基因组数据集以识别循环病毒株的有效性。