开发用于非洲百慕大草冬季耐寒性的竞争性等位基因特异性聚合酶链反应（PCR）标记及基因组预测方法

《Grass Research》：Development of kompetitive allele-specific polymerase chain reaction markers and genomic prediction for winter hardiness in African bermudagrass

　　耐寒型百慕大草的鉴定目前仅依赖于表型选择。尽管这种方法有效，但在能够可靠地选出优良基因型之前，需要经过多年的田间评估。育种计划需要更高效、更精确的选择方法。非洲百慕大草（Cynodon transvaalensis Burtt-Davy）在耐寒性方面存在变异，常用于开发草坪型种间杂交品种（C. dactylon × C. transvaalensis）。本研究的目标是开发与耐寒性数量性状位点（QTL）相关的竞争等位基因特异性聚合酶链反应（KASP）标记，并在非洲百慕大草中应用基因组预测技术来预测耐寒性。基于先前关于耐寒性的基因组信息，研究人员从三个已鉴定的QTL区域中开发并验证了七个与耐寒性相关的KASP标记。此外，通过使用传统的基因组最佳线性无偏预测方法和基于机器学习的随机森林选择模型，分别获得了0.52的耐寒性死亡率预测准确性、0.50的春季返青率预测准确性以及0.40的春季返青覆盖率预测准确性。这是首次在非洲百慕大草中报道基于聚合酶链反应（PCR）的紧密关联性状的分子标记开发和基因组选择研究，为提高耐寒性选择的准确性和效率奠定了基础。

**引言**
非洲百慕大草（Cynodon transvaalensis Burtt-Davy）是一种二倍体（2n = 2x = 18）暖季型草本植物，原产于南非的小范围地区[1]。由于其对灌溉和肥料的依赖性较高、夏季草坪质量较差以及在低温下易变色的特点，其作为草坪植物的应用不如其四倍体近缘种普通百慕大草（C. dactylon [L.] Pers.）广泛[2]。然而，非洲百慕大草因其独特的形态特征（如细腻的叶片质地、短的节间长度和高草坪密度）而受到重视，这些特征对于培育高品质的杂交百慕大草（C. dactylon × C. transvaalensis，2n = 3x = 27）至关重要[3]。当在过渡气候区（尤其是北纬36°以上）种植时，非洲百慕大草容易受到冬季死亡的影响[3]。冬季存活率低会导致春季返青延迟、杂草入侵增加以及草坪均匀性下降，尤其是在严冬或冻融循环之后。耐寒性是百慕大草耐寒性的关键因素。致命冰点温度（LT50，即杀死50%个体的温度）被用来量化百慕大草的耐寒性。Anderson等人首次开发了使用冷冻室可靠测定百慕大草LT50的实验方法[4]。通过这种方法可以确定并区分不同耐寒性的百慕大草基因型，从而为选择具有更强耐寒性的基因型提供决策依据[5]。然而，大规模的耐寒性评估耗时较长，且常受冷冻室可用性的限制。因此，通常通过观察春季再生情况（包括春季返青率和冬季死亡率）来间接评估百慕大草的耐寒性，并筛选出具有优良耐寒性的基因型[6]。在美国的过渡气候区，使用耐寒性强的百慕大草品种可以减少冬季死亡问题。俄克拉荷马州立大学的百慕大草育种计划的一个主要目标是提高其耐寒性。最新一代发布的杂交品种‘OKC3920’和‘OSU1337’在耐寒性方面有显著提升[7,8]。利用耐寒性强的亲本是培育耐寒性杂交百慕大草的重要手段。普通百慕大草分布于南纬45°至北纬53°之间的各大洲[1]，因其广泛的地理分布和丰富的遗传多样性而被认为对杂交百慕大草的耐寒性有重要贡献[2,6]。虽然非洲百慕大草通常被认为主要影响草坪的质量性状，但在其他性状方面的作用却常被忽视。然而，它实际上也能适应比其自然分布区更冷的气候。最近的研究表明非洲百慕大草在耐寒性方面存在显著的遗传变异，且耐寒性的遗传力中等至较高[1,9,10]。通过杂交耐寒性强的亲本，有望培育出更耐寒的杂交百慕大草品种，这突显了提高这一传统上被忽视的物种耐寒性的紧迫性。

**表型选择与分子标记**
虽然表型选择在百慕大草育种中取得了成功，但受多种环境因素（如疾病、害虫和干旱）年度波动的影响，从而降低了选择的准确性[11]。标记辅助选择（MAS）利用与关键基因相关的DNA标记，在将这些材料移植到田间之前筛选出具有理想等位基因组合的个体。对于由主要基因控制的性状，MAS特别有效。然而，MAS需要先建立合适的育种群体，再进行数量性状位点（QTL）的定位、验证以及可靠且适用于育种的分子标记（如基于PCR的标记）的开发[12]。已经开发出多种竞争等位基因特异性PCR（KASP）标记，并在小麦（Triticum aestivum L.）、水稻（Oryza sativa L.）和玉米（Zea mays L.）等作物中用于提高选择效率[13,14,16]。但在百慕大草育种中，常用的分子标记系统仍然是简单序列重复（SSR）标记[17]。虽然SSR标记准确且可重复，但由于通量有限，限制了连锁图谱的密度和后续的QTL检测[18]。目前还没有针对百慕大草特性的SSR标记可用于MAS，因此越来越多地采用KASP标记。与现有的SSR系统相比，KASP标记与目标基因或QTL的关联更紧密，且KASP基因分型的效率也更高。最近的一项QTL定位研究使用自交一代（S1）非洲百慕大草群体，基于单核苷酸多态性（SNP）构建的连锁图谱，鉴定出10个与耐寒性相关的QTL[10]，其中5个QTL解释了高达36%的表型变异。后续研究进一步分析了这三个QTL区域中的差异表达基因（DEGs），发现在8/2°C冷适应处理后12、24和48小时时，某些基因的表达发生上调或下调[19]。这些研究为开发用于MAS的分子标记和提高非洲百慕大草耐寒性奠定了基础。

**基因组选择**
与仅关注少数具有显著效应的位点的MAS相比，基因组选择（GS）利用全基因组的分子标记来估计所有标记的效应，无论这些标记是否显著，从而计算复杂性状的基因组估计育种值（GEBVs）[20,21]。GS依赖于包含表型和基因型数据的训练群体来推断标记效应，进而用于缺乏表型记录的群体[20,21]。基因组最佳线性无偏预测（GBLUP）将基因组标记纳入线性混合模型，以生成精确的育种值估计[22]。传统的GS模型（如GBLUP和岭回归最佳线性无偏预测（rrBLUP）在实践中应用最广泛[23,24]，但在处理非线性关系、上位性或现代测序平台产生的高维数据集时存在局限性[25]。机器学习（ML）的进展为GS提供了新的方法，能够自动从数据中学习模式以建立预测模型[26,27]。基于树的ML基因组选择模型（如随机森林（RF）、贝叶斯加性回归树和梯度提升机不需要对底层性状做出假设（例如效应加性、交互作用的数量或程度或交互作用深度），能够有效建模复杂的非线性关系[28]。随机森林结合了自助聚合（bagging）和随机特征选择，提高了预测准确性并减少了过拟合现象，在生态学和生物信息学等领域得到广泛应用[27,30,31]。例如，RF在捕获基因间和基因与环境间的复杂交互作用方面表现出色[27,31]。基因组选择首先应用于奶牛育种[32]，随后在许多作物育种中也显示出潜力[27,33,34,35]。对于多年生作物而言，GS的应用更为吸引育种者，因为它可以缩短育种周期[36]。在多年生黑麦草（Lolium perenne L.）的育种中，GS已被用于提高抽穗期、营养价值、饲料质量和种子产量等性状[37,38,39,40,41,42]。然而，关于草坪植物性状的GS实证数据较少。非洲百慕大草的遗传和基因组研究为整合MAS和GS提供了机会。因此，本研究的目标是：(a) 开发与非洲百慕大草耐寒性相关的KASP标记；(b) 利用GBLUP和RFGS模型预测其耐寒性。

**材料与方法**
**KASP标记的开发**
基于之前使用自交一代（S1）非洲百慕大草群体（‘OKC1163’）进行的QTL定位研究[10]，春季返青情况通过1到9的评分标准进行视觉评估，其中1表示没有返青，9表示完全返青[43]。同时使用Light Box拍摄数字图像，并通过Turf Analyzer 1.01软件计算春季返青的绿色覆盖率[44,45]。冬季死亡情况则通过评估冬季低温导致的地面覆盖损失百分比来评定。共鉴定出7个与春季返青相关的QTL和3个与冬季死亡相关的QTL。其中三个与耐寒性QTL重叠的基因组区域在至少两年内保持一致，能够解释高达36%的表型变异。Cevallos等人进行的转录组研究进一步鉴出了几个与耐寒性相关的候选基因，包括染色体3上的evm.TU.LG03.4542（细胞色素P450）和evm.TU.LG03.4609（乙烯响应转录因子）、染色体1上的evm.TU.LG01.621（乙烯响应转录因子）以及染色体9上的evm.TU.LG09.1271（铁氧还蛋白-1），这些基因在8/2°C昼夜冷适应处理后12、24和48小时显著上调[19]。这些DEG被选为开发KASP标记的候选基因。此外，还根据每个QTL区域的LOD值（对数比值）选择了相应的SNP标记。使用Bedtools v 2.27.1从非洲百慕大草参考基因组中提取每个SNP上下游300 bp范围内的序列[46,47]。KASP标记的设计遵循以下规则：引物长度约为20 bp，GC含量为40%–60%，退火温度为55–60°C。为了提高成功率，每个SNP设计了多个KASP检测。FAM（5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′）和HEX（5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′）序列被添加到选定的SNP上游和下游序列中。引物由Eurofins Scientific（卢森堡市）合成。所有KASP检测均使用来自S1 OKC1163群体的23个随机选择个体的DNA进行，水作为空白对照。DNA提取方法参照Yu等人的步骤[48]。Opentrons OT2机器人平台（Opentrons Labworks Inc., 长岛市, NY）用于制备含有20 ng基因组DNA、2 μL PACE 2.0 Genotyping Master Mix（Rox含量较低，3CR Bioscience Ltd, 剑桥, 英国）、各等位基因特异性引物各3.6 μM以及通用引物9 μM的4-μL反应混合物。PCR在30°C预热1分钟后升至94°C预热15分钟，随后进行40个循环：94°C 20秒、60°C 1分钟，最后在30°C下保温1分钟以收集荧光信号[13]。KASP数据通过QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR软件进行分析，将观察到的基因型与初始测序数据中的SNP标记数据进行比对，以验证KASP标记的诊断效果。根据Yu等人[10]提供的表型数据，每种耐寒性状的平均值在每个标记内的三种等位基因类型之间进行了比较。比较是使用成对的t检验（p < 0.05）进行的，结果使用GraphPad Prism（v.9.2，GraphPad Software Inc.）进行了可视化。基因组预测采用了2018年至2020年收集的春季返青数据和2018年至2021年收集的冬季枯死数据，与上述用于KASP标记开发的数据类似。总共从该群体中生成了94,909个SNP标记，使用的是基因分型测序[48]技术。基因组数据经过过滤，去除了所有缺失值。用于GS的分析数据集包含19,460个没有缺失值的SNP。根据初步结果，预测准确性较低，这可能是由于基因型数据质量较低造成的。随后我们过滤掉了低质量的SNP标记，并创建了两个新的数据集。第一个数据集将每个等位基因的读取深度为1的数据转换为缺失数据，然后移除了所有具有缺失数据的SNP。第二个数据集将每个等位基因的读取深度≤2的数据转换为缺失数据，然后也移除了所有具有缺失数据的SNP。使用R包lme4估计了耐寒性状的最佳线性无偏估计（BLUE）值，其中基因型被视为固定效应，年份被视为年际变异的随机效应。使用R包rrBLUP[23]中的GBLUP模型和Python中的Scikit-learn包[49]中的RF模型，利用BLUE值进行了预测。GBLUP模型的公式为y = 1μ + Zg + ε，其中y是耐寒性状的向量，1是全1的向量，μ是均值，Z是关联观测值和随机效应的关联矩阵，g是代表每个基因型的GEBV的随机加性遗传效应向量，ε是残差向量。RF模型的公式为y = f(x)，其中y是耐寒性状的向量，x是SNP标记得分，f是拟合的映射函数。为了评估GBLUP和RF的预测准确性，对每种耐寒性状进行了100轮五折交叉验证和留一法交叉验证（LOOCV）。在五折方法中，群体被随机分为五个子集，然后使用四个子集（80%的群体大小）训练GBLUP和RF模型来预测第五个子集（20%的群体大小）。在每次重复实验中，预测准确性是通过GBLUP和RF模型预测的GEBV与测试集观测表型值之间的Spearman相关系数的平均值来计算的。总体预测准确性是基于100次重复实验的平均值。在LOOCV中，从训练群体中排除了一个个体（108株植物），然后使用剩余植物训练的GBLUP和RF模型预测该植物的GEBV。对所有109株植物都进行了这一操作，109个预测的准确性是通过预测的GEBV与观测表型值之间的相关性来计算的。所有预测都使用了三个SNP标记数据集、两个GS模型和两种验证方法。

KASP标记：总共合成了192对引物，用于96个KASP测定，基于30个SNP。在从该群体中随机选择23个基因型进行筛选后，有64个（66.7%）KASPs能够被扩增。基于三个目标耐寒性QTL区域的六个SNP的8个（8.3%）KASPs被用作诊断标记，用于对随机选择的非洲百慕大草基因型进行基因分型，与测序数据相比，错误基因型的数量较少（表1，补充图S1）。我们还使用了多年的数据进行了表型分析，以确定哪种等位基因对应更好的耐寒性（图1）。对于冬季枯死，标记TP183580、TP16800和TP21857在等位基因型之间显示出显著差异。尽管在统计上没有差异，但我们观察到了其他标记在表型平均值上的数值差异。对于春季返青，所有标记在三种等位基因型之间都显示出显著差异，可以用于筛选出更耐寒的非洲百慕大草基因型。对于SGPGC的表型平均值也观察到了类似的趋势，但标记TP83433和TP12397的不同等位基因在统计上没有差异。根据表型分析，TP183580的纯合A、TP16800的纯合A、TP48420的纯合G和TP21857的纯合G一致表现出更多的冬季枯死和春季返青延迟。

表1. 与非洲百慕大草参考基因组中耐寒性QTL紧密连接的基于SNP的KASP标记列表，以及它们的假定物理位置。
KASP标记 | QTL | 染色体位置 | 等位基因 | 特异性引物 | 非特异性引物
——— | ------- | -------- | -------- | ---------- | --------------
TP183580-KASP1 | QCTSG3/QCTWK2 | 3 | 56,078,869 | A/G | ACGCCACTGCCGTAAGAGCT | Ga/g | ACCTGCGGTACCAGATGCTTCT |
TP16800-KASP1 | QCTSG1/QCTWK1 | 9 | 16,202,201 | A/C | AGTCGTCGGGCAGCACGGGa/c | CGGTCGTCCACCATCCCTGCATT |
TP16800-KASP3 | QCTSG1/QCTWK1 | 9 | 16,202,201 | A/C | GAGTCGTCGGGCAGCACGGGa/c | GCGCTGTCTTCAGGTCACAGT |
TP83433-KASP1 | QCTSG3/QCTWK2 | 3 | 55,932,542 | A/G | AGTCCGGACGCAAATGGCTGAa/g | CGCTGCAGCGCGATTCATGATG |
TP83433-KASP3 | QCTSG3/QCTWK2 | 3 | 55,932,542 | A/G | CGGATTTTTGCGGTTGGATGTt/c | ACCAAAGCCTACGCTCCTGAC |
TP48420-KASP2 | QCTSG2 | 1 | 8,390,517 | C/G | CACGGAAGACAAACCGTAATTCCc/g | CGCCTCCGTTCTTTGGTAAGTCGTT |
TP48420-KASP3 | QCTSG2 | 1 | 8,390,517 | C/G | GTGATAAAAAGGGTCCAGCGAc/g | CCAGAAATAATTCCACGGCC |
TP48420-KASP4 | QCTSG2 | 1 | 8,390,517 | C/G | GTGATAAAAAGGGTCCAGCGAc/g | CGAAAGCAACGTCTGGTACTG |
TP4427-KASP2 | QCTSG2 | 1 | 8,174,024 | C/T | CACCACCACGTAGCTCCCc/t | CAGACGGGAACTGACAAAACTCGC |
TP21857-KASP1 | QCTSG1/QCTWK1 | 9 | 16,588,718 | A/G | GCCCGGAAGAGCTAGCGCTt/c | TCAAGTGCCTGGAGACGAGAG |
TP21857-KASP3 | QCTSG1/QCTWK1 | 9 | 16,588,718 | A/G | GGCCCGGAAGAGCTAGCGCTt/c | AGATGTTCACGTGGGGCACGT |
TP12397-KASP3 | QCTSG3/QCTWK2 | 3 | 54,083,563 | A/G | AGCACCACGTTGTGCTCGGAc/t | GCTTCAACGAGAGCCTGCTCT |
TP12397-KASP5 | QCTSG3/QCTWK2 | 3 | 54,083,563 | A/G | AGCACCACGTTGTGCTCGGAc/t | TCCGTGGCCATACTCTTGGATC |

图1. 基于Yu等人[10]报告的耐寒性数据的SNP标记的表型分析，包括冬季枯死（a）、春季返青（b）和春季返青百分比覆盖率（c）。x轴是SNP标记等位基因，y轴是每种性状的平均表型。条形图中的点表示植物的表型值。在每个SNP标记内，不同的字母表示根据成对t检验，在0.05的概率水平上，每种等位基因类型的平均表型值有显著差异。

基因组预测：使用了三个SNP标记数据集进行GS分析。没有质量控制的数据集包含19,460个SNP，其中19,298个与参考基因组对齐。第二个数据集包含609个SNP，其中597个与参考基因组对齐。第三个数据集包含153个SNP，其中148个与参考基因组对齐，并且在整个基因组中分布有较大的间隙（补充图S2）。使用GBLUP，通过五折交叉验证和LOOCV观察到冬季枯死、春季返青和SGPGC的预测准确性范围较广（表2，补充图S3，S4）。冬季枯死的预测准确性较低（-0.10到0.14），并且随着标记质量的提高，准确性有所提高（表2）。使用19K和153个SNP的数据集时，LOOCV的预测准确性为负值。对于春季返青和SGPGC，预测准确性较高（0.18–0.43）。与数字图像分析相比，对于视觉评估的数据，春季返青的预测准确性更高。此外，在所有数据集中，LOOCV的预测准确性低于五折交叉验证。与冬季枯死不同，对于春季返青和SGPGC，使用更多的标记可以获得更高的预测准确性。对于RF模型，预测准确性范围为0.22到0.56（表2，补充图S5，S6）。与GBLUP不同，使用较少标记时，冬季枯死的预测准确性显著提高。然而，对于SGPGC，使用较少的标记时，预测准确性降低。总体而言，在RF模型中，使用LOOCV的预测准确性较高，但在GBLUP模型中，使用五折交叉验证获得了更高的预测准确性。

表2. 使用基于三个标记数据集的基因组最佳线性无偏预测（GBLUP）和随机森林（RF）模型，根据冬季枯死（WK）、春季返青（SG）和春季返青百分比覆盖率（SGPGC）测量的基因组预测准确性。
数据集 | 性状 | 交叉验证方法 |
——— | ------- | -------- |
19K | WK | 五折 | 0.11 ± 0.06 | 0.24 ± 0.06 | LOO | -0.10 | 0.22 |
SG | 五折 | 0.43 ± 0.04 | 0.48 ± 0.06 | LOO | 0.43 | 0.52 |
SGPGC | 五折 | 0.29 ± 0.05 | 0.38 ± 0.06 | LOO | 0.25 | 0.42 |
609 | WK | 五折 | 0.14 ± 0.06 | 0.35 ± 0.05 | LOO | 0.00 | 0.37 |
SG | 五折 | 0.43 ± 0.04 | 0.50 ± 0.05 | LOO | 0.43 | 0.56 |
153 | WK | 五折 | 0.13 ± 0.05 | 0.47 ± 0.04 | LOO | -0.06 | 0.53 |
SG | 五折 | 0.36 ± 0.04 | 0.37 ± 0.05 | LOO | 0.35 | 0.35 |
SGPGC | 五折 | 0.23 ± 0.05 | 0.30 ± 0.05 | LOO | 0.18 | 0.30 |

讨论：不确定的气候对草坪管理构成了威胁，并迫切需要开发更具气候适应性的草坪品种。在过渡气候区，有需求培育耐寒的百慕大草。长期以来，人们最常用的是通过表型选择春季返青和冬季枯死来提高耐寒性。尽管这种方法有效，但耗时较长，需要多次选择循环才能获得显著的遗传改良。Yu等人[50]报告称，过去十年通过育种获得的早期春季返青（耐寒性的最重要指标）的遗传增益仅为12%，与20世纪60年代发布的长期行业标准品种Tifway相比，表明在百慕大草中提高耐寒性的遗传增益较低。DNA测序技术的迅速发展使得基于DNA标记的基因分型系统得以开发，并在植物育种中实现了GS模型[51]。这一突破使育种者能够根据植物的遗传和基因组组成进行选择，而不仅仅基于其表型表现，后者在选择效率和强度方面存在 plusieurs 限制。在这项研究中，我们开发了与耐寒性QTL紧密相关的KASP标记，并研究了将GS整合用于预测育种和选择耐寒非洲百慕大草的潜力。标记辅助选择已成为提高主要作物遗传质量的日益流行和强大的工具。随着基因分型和表型技术的快速发展，已经设计和验证了4,000多个用于水稻基因分型的引物[52]。在百慕大草中，SSR是最广泛使用的标记系统。一些实验室已经开发了可以准确基因分型百慕大草、评估群体遗传多样性和构建连锁图的SSR标记[17,18,53]。尽管已经报道了基于SSR的常见百慕大草的建立率和形态性状的QTL定位[18,53]，但由于标记间隔较大和基因组覆盖不完整，这些标记的实用性受到了限制。因此，这些研究中的任何SSR标记都不足以用于MAS。百慕大草育种者迫切需要一个新的标记系统来改进作物。在这项研究中，成功开发的与性状相关的KASP为在MAS中利用有利的耐寒性QTL等位基因以提高非洲百慕大草的耐寒性提供了示范。第一个耐寒性QTL的发现来自S1非洲百慕大草群体。然而，QTL区域的范围较大，主要是由于冬耐寒性的环境变异较大以及标记密度不一致，这使得标记的选择变得复杂[10]。通过转录组学方法，发现这些QTL区域内的几个基因在冷适应条件下表现出差异表达[19]。TP183580-KASP1是基于一个高质量的SNP设计的（每个个体的读深度较高），该SNP与选定的基因evm.TU.LG03.4609相距304 bp，并被注释为乙烯响应性转录因子[19]。该区域开发的其他KASP标记则是基于使用多年数据在QTL分析中具有峰值LOD值的SNPs。TP183580-KASP1的准确性高于该区域的其他KASP标记集（图1），这表明结合QTL映射和转录组学方法在确定候选基因和开发与该基因相关的KASP标记方面更为有效。除了标记的准确性外，将SNP转化为诊断性KASP的成功率较低（8.3%）。引物对的设计是开发KASP检测的关键步骤，往往决定了其最终的成败。我们将我们手动设计的引物与Primer 3.0（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0）设计的引物进行了比较，大多数引物只有少量的碱基对不匹配。我们观察到某些SNP比其他SNP更容易转化为KASP标记。基因组的冗余性和与参考基因组不同的特定基因型可能在将基于测序的SNP转化为KASP标记时造成内在困难。需要进一步使用Sanger测序进行研究，以了解为什么某些SNP难以转化为KASP标记，以及为什么一些KASP标记无法正确地对植物进行基因分型。TP183580、TP16800和TP48420是三个在OKC1163群体中选择冬耐寒性非洲百慕大草非常有效的SNP。这些标记可以单独使用或组合使用，在MAS（分子标记辅助选择）中提高冬耐寒性的选择效率。显然，未来在MAS中应避免使用TP183580和TP16800的A等位基因以及TP21857的G等位基因。非洲百慕大草已被广泛用于与普通百慕大草杂交，以创造杂交百慕大草。理想的KASP需要能够对杂交百慕大草进行基因分型，特别是区分其亚基因组。杂交百慕大草有一个来自非洲百慕大草的染色体，而普通百慕大草是一个异源四倍体物种，其一个基因组与非洲百慕大草的相似度更高[54,55]。因此，未来的工作需要确保KASP设计使用基于这三个SNP的基因组特异性标记来区分杂交百慕大草每个亚基因组上的等位基因。对于百慕大草，尤其是普通百慕大草，需要更多的遗传学研究，因为其在冬耐寒性方面存在显著变异[56]。然而，与普通百慕大草的冬耐寒性相关的遗传资源尚未得到充分探索。到目前为止，只有Yu等人[57]报告了普通百慕大草的九个春季返青QTL，为使用MAS开发KASP标记提供了基础。此外，目前还没有科学证据表明非洲百慕大草和普通百慕大草的等位基因如何影响杂交百慕大草的冬耐寒性。开发基因组特异性KASP标记可以提供关于基因组成如何影响杂交百慕大草表现力的遗传学见解，并有助于百慕大草的育种。本研究中的基因组预测显示了足够的准确性，证明可以实施GS（基因组选择）来提高培育冬耐寒性非洲百慕大草的遗传增益率。使用OKC1163 S1群体的基因型和表型数据，冬枯死的预测准确性最高为0.53，春季返青为0.56，SGPGC（春季生长点）为0.42。对于冬耐寒性状的预测准确性较为中等。Tihou等人[58]报告称，使用家族内方法和基于后代的交叉验证方法，柳枝稷（Panicum virgatum L.）的冬季存活预测能力为0.52。此外，Poudel等人[59]发现低地柳枝稷的冬季存活预测准确性范围在0.02到0.91之间。Cao等人[60]报告称，玉米在发芽阶段的耐寒性预测准确性为0.44，而小麦的耐寒性预测准确性为0.83[61]。非洲百慕大草的预测准确性较低可能是由于冬耐寒性的遗传力较低、标记密度、群体多样性和规模以及GS模型等因素造成的。该群体中冬耐寒性的遗传力范围从0.36（春季返青）到0.54（冬枯死）[10]。不同群体和实验设置下的冬耐寒性遗传力有所不同。在一项评估34个优秀百慕大草基因型在美国南部八个地点三年春季返青情况的研究中，春季返青的可靠性很高，为0.8[50]。然而，在冬季受到更严重的低温胁迫和夏季干旱胁迫时，春季返青的可靠性降至0.13[11]。非洲百慕大草较低的遗传力可能会降低基因组预测的准确性。另一方面，遗传力较低的性状和较小的标记效应更适合基因组预测，因为高遗传力（较简单的）性状可以通过少数具有较大效应的标记来预测[51]。除了遗传力外，群体规模也会影响预测准确性。本研究使用了OKC1163的自交群体。由于非洲百慕大草的种子严重碎裂和自交抑制，该群体中植物的数量相对较少，限制了训练群体的规模。我们观察到在五倍交叉验证的每次迭代中预测准确性存在显著差异（补充图S3、S5），表明优化训练群体可以提高预测准确性，但受到本研究中群体规模的限制。有文献记载，训练群体应包括具有多样遗传背景的个体，以涵盖感兴趣性状的广泛等位基因变异，从而捕获遗传效应并做出可靠的预测[62]。由于OKC1163是冬耐寒性的非洲百慕大草，这些分离个体的遗传相关性可能会使预测准确性偏向于改善方向。然而，增加与冬耐寒性训练群体遗传上相距较远的非冬耐寒性个体的多样性会负面影响预测准确性[63]。非洲百慕大草尚未被广泛驯化和改良用于草坪种植，因此关于该物种的遗传多样性的信息很少。未来的研究需要在不同气候条件下使用更大的多样化群体来进行，以了解气候条件、遗传力和非洲百慕大草预测准确性之间的关系。在本研究中，标记的密度和分布会影响预测准确性。在远交作物中，连锁不平衡会迅速衰减，这需要高度密集的SNP标记，特别是对QTL有贡献的标记，以达到最佳的预测准确性[64]。选择特定性状的最佳标记子集是提高GS（基因组选择）准确性的一种有前景的方法[65]。Filho等人[66]发现，使用来自GWAS研究的高效标记子集可以获得更高的预测准确性。在本研究中，使用了三种不同质量的标记子集进行基因组预测。使用未过滤的低质量数据集（包含大量WK SNPs）时，预测准确性最低。然而，使用该数据集时，使用GBLUP模型获得了最高的SGPGC预测准确性。一般来说，使用中等质量的标记子集可以略微提高预测准确性。我们使用不太严格的标准过滤SNP数据集，但去除了所有与标记子集用于连锁分析时缺失基因型的SNP。这个中等质量的标记子集中有49%的SNP位于先前鉴定的QTL区域内。使用高质量数据集时，预测准确性略有下降，这可能是由于移除了更多位于QTL区间内的SNP。我们的结果总体上与先前的研究结果一致，即优化标记密度和选择最佳标记子集有利于提高预测准确性[65,67]。在本研究中，我们使用了两种基因组选择模型GBLUP和RF，显示出不同的预测性能。使用GBLUP时，春季返青的预测准确性高于WK，这表明对于冬耐寒性这一性状，应使用特定性状的预测模型才能获得最高的预测准确性。作为GS的基准模型，GBLUP能够生成精确的育种值估计，特别是对于主要由加性遗传效应控制的性状[22]。较高的预测准确性可能是由于与春季返青相关的QTL表现出更多的加性遗传效应，而之前报道的WK QTL则表现出更多的显性遗传效应[10]。使用RF模型时，观察到预测准确性呈上升趋势，尤其是在WK预测方面优于GBLUP。Montesinos-López等人[22]也报告称，基于ML（机器学习）的模型在预测准确性方面通常优于GBLUP。ML的优越排名准确性表明其能够更好地模拟复杂的非线性基因组相互作用，并检测出传统方法如GBLUP经常忽略的细微模式。在过去20年中，已经开发了37种以上的GS模型，还有更多的模型正在被提出以改进预测准确性[51,68]。根据“没有免费午餐”的定理，没有单一的统计机器学习模型能够优于其他现有算法，最高可能的预测准确性应通过实证研究来验证[69]。应该对非洲百慕大草的更复杂性状测试更多的GS模型，以实现更准确的预测。

结论
本研究的结果强调了MAS（分子标记辅助选择）和GS（基因组选择）在选育优良冬耐寒性非洲百慕大草中的开发和应用。基于QTL映射和转录组学结果，开发了与七个基因组区域相关的KASP标记，这些标记可以区分冬耐寒性和冬敏感性的非洲百慕大草基因型。此外，观察到两种GS模型对三个冬耐寒性性状的预测准确性较低至中等。GBLUP在预测冬枯死方面的表现较差。总体而言，RF在大多数研究的性状上略优于GBLUP。更大的群体规模、适中的标记密度和不同的验证方法可以进一步提高预测准确性，具体取决于模型和性状。本研究的结果表明，MAS和GS在非洲百慕大草的育种中具有潜在的应用价值，可以增加遗传增益，降低表型分析成本，并且更重要的是，加快品种开发的速度。

作者贡献
作者对论文的贡献如下：
- 构思、数据整理、形式分析、资金筹集、调查、方法论、软件、验证、可视化、写作——原始草稿：Yu S；
- 调查、方法论、软件、写作——审阅和编辑：Shi Z；
- 方法论、软件、写作——审阅和编辑：Aoun M；
- 构思、写作——审阅和编辑：Xiang M；
- 构思、资金筹集、资源、写作——审阅和编辑：Wu Y；
- 方法论、软件、写作——审阅和编辑：Fang T；
- 构思、写作——审阅和编辑：Fontanier C；
- 形式分析、软件、可视化、写作——审阅和编辑：Prakash LPY。
所有作者都审查了结果并批准了手稿的最终版本。

数据可用性
支持本研究发现的原始数据和R/Python脚本可向通讯作者索取。

致谢
本工作部分得到了俄克拉荷马州立大学草坪基金会和俄克拉荷马农业实验站的支持。

利益冲突
作者声明没有利益冲突。