《Fungal Genetics and Biology》：Identification of a regulatory factor activating the xylanase promoter of the basidiomycetous yeast Pseudozyma Antarctica and its application to enhance endogenous biodegradable plastic-degrading enzyme production via transcription factor multiplexing
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三浦敦弘 | 田中卓海 | 坂井宏明 | 田中美月 | 森田智武 | 北本宏子日本国立农业食品研究机构农业环境科学研究所，茨城县筑波市Kannondai 3-1-3，邮编305-8604摘要担子菌酵母Pseudozyma antarctica分泌可生物降解的塑料降解酶PaE。P.
三浦敦弘 | 田中卓海 | 坂井宏明 | 田中美月 | 森田智武 | 北本宏子
日本国立农业食品研究机构农业环境科学研究所，茨城县筑波市Kannondai 3-1-3，邮编305-8604
摘要 担子菌酵母Pseudozyma antarctica 分泌可生物降解的塑料降解酶PaE。P. antarctica 中的木聚糖酶启动子pPaXyn1在木糖的作用下会被强烈诱导。一种携带pPaXyn1启动子-融合PaE基因（高产PaE载体）的P. antarctica 报告菌株在木糖存在下产生了大量PaE。因此，为了进一步提高PaE的产率，本研究旨在分离出该转录激活因子pPaXyn1。从P. antarctica 的全基因组序列中筛选出了109个具有Zn2 Cys6 型DNA结合结构的基因作为候选转录因子。从报告菌株中构建了一系列突变体，每个染色体上的候选转录因子基因都被敲除。在这些突变体中，只有缺乏PAN1_003r02005基因位点的菌株（基因ID：g2005）抑制了PaE的产生，并且没有显示出可生物降解塑料的降解活性。此外，含有多个g2005拷贝的报告菌株PaE的分泌量增加了1.6倍。这些结果表明g2005是木聚糖酶的转录激活因子；因此，将其命名为P. antarctica 木聚糖酶调节因子1（PaXyr1）。g2005的氨基酸序列仅存在于担子菌亚门（Ustilaginomycotina）中。
引言 可生物降解塑料（BP）产品被越来越多地用于解决环境中不可降解塑料垃圾积累的问题。理想的BP产品在使用过程中保持其强度，并在预期时间内降解。然而，现有的控制BP产品降解的技术还不够成熟。一种潜在的策略是使用能够降解这种材料的酶来加速其降解过程。之前在从水稻中分离出的担子菌酵母Pseudozyma antarctica 中发现了BP降解酶PaE（Kitamoto等人，2011年）。PaE可以降解聚丁酸丁二醇酯-共-己二酸酯（PBSA）、聚丁酸丁二醇酯和聚丁酸丁二醇酯-共-对苯二甲酸酯以及非晶态聚乳酸等BP材料，这些材料常用于蔬菜生产的覆盖膜中（Sato等人，2017年）。当在农田上铺设BP覆盖膜并在其表面处理PaE后，薄膜的强度会降低，并且次日早晨变得脆弱（Kitamoto等人，2023年）。为了实际应用这项技术，高效生产PaE是必要的。
担子菌一直被用作多种酶的遗传资源，但很少被用于蛋白质大规模生产系统的开发（Johnson，2013年）。P. antarctica 菌株在木糖培养基中会分泌大量的木聚糖酶（Watanabe等人，2015年）。基于这些发现，通过基因工程构建了一种能够大量生产PaE的P. antarctica 菌株。将PaE高产载体引入P. antarctica 的染色体中，使PaE基因（PaCLE1XYN1 ）的启动子pPaXyn1下游（Watanabe等人，2016年）。这种菌株在木糖培养基中分泌了大量PaE。
木聚糖酶可以降解木聚糖（Biely，1985年）。木聚糖是一种以木糖为基础的多糖，是植物细胞壁中半纤维素的主要成分。植物主要由细胞壁多糖（如纤维素和半纤维素）以及储存多糖（如淀粉和葡甘露聚糖）组成。微生物产生的多糖降解酶的转录水平受到转录因子的调控。当环境中存在这些多糖时，细胞会检测到包括它们的降解产物在内的环境信号。这些信号传递给转录激活因子，从而激活酶的启动子并诱导编码多糖降解酶的基因转录。子囊菌中多糖降解酶的转录激活因子通常具有类似的基序结构和Zn
2 Cys
6 型DNA结合域。
中的木聚糖酶调节因子为Xyr1：
中的木聚糖降解调节因子为Xlr1：
中的木聚糖酶调节因子为XlnR（Marui等人，2002年；Rauscher等人，2006年）。在
中，淀粉酶的转录激活因子为AmyR，甘露聚糖酶的转录激活因子为ManR（Gomi等人，2000年；Ogawa等人，2012年）。它们都含有Zn2 Cys6 型DNA结合域；然而，它们的结构和功能各不相同。 子囊菌已被用作多种酶的大规模生产宿主和平台。虽然存在多种提高蛋白质产量的基因工程策略，但增加转录激活因子的剂量具有明显优势：它不需要修改目标蛋白的结构，并且可以与启动子的功能架构无关。例如，提高转录激活因子的水平可以增加目标蛋白的产量。在
中，含有多个拷贝的菌株在木糖培养基中增加了木聚糖酶的产量；而在含有魔芋葡甘露聚糖的培养基中，过量产生ManR的菌株增加了甘露聚糖酶的产量（van Peij等人，1998年；Ogawa等人，2012年）。然而，关于担子菌中的转录因子的信息仍然有限。担子菌的基因组数据显示了一组与子囊菌转录因子在结构上相似的基因，这些基因被归类为候选转录因子。然而，它们的功能效果尚不清楚。因此，本研究旨在鉴定P. antarctica 中木聚糖酶的转录激活因子，并通过在一个含有PaE高产载体的菌株中多重表达该转录因子来提高PaE的产量。
章节摘录 菌株和培养基 本研究中使用的菌株列于表1中。P. antarctica （最近被分类为Moesziomyces antarcticus ）GB-4(0)是从稻壳中分离出来的（Kitamoto等人，2011年），并存储在NARO基因库（日本茨城县的国家农业食品研究机构基因库）中，该基因库是生物资源的公共培养收集库（登录号MAFF 306999）。本研究中使用的菌株是从P. antarctica GB-4(0)改造而来的。此外，还使用了Ustilago maydis
先前的研究表明P. antarctica 对木糖有响应，并能产生大量的PaE和木聚糖酶。然而，编码这些酶的基因的转录水平尚未被研究。因此，进行了微阵列分析。按照补充材料和方法中描述的实验方法，P. antarctica GB-4(0)菌株在含有8%木糖的液体基础培养基中摇床培养了1天、2天、3天或6天。 用BPs替代传统的不可降解塑料是减少开放环境中塑料积累的一种有前景的策略。足够耐用的BP产品在使用过程中保持其强度，并在使用后缓慢降解。需要一种能够加速其降解的技术（SAPEA，2020年）。本研究提出了一种使用P. antarctica 中的降解酶PaE来处理BP产品的方法。我们开发了一种利用强效木聚糖酶大规模生产PaE的方法 三浦敦弘： 撰写——初稿，实验研究。田中卓海： 撰写——审阅与编辑，实验研究，概念构思。坂井宏明： 实验研究。田中美月： 撰写——审阅与编辑，方法学，概念构思。森田智武： 撰写——审阅与编辑，实验研究。北本宏子： 撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，方法学，概念构思。本工作是由日本环境省资助的“面向低碳社会的塑料资源循环系统示范项目”（FY2019-FY2021）完成的。 我们感谢日本产业技术综合研究所的Koike Hideaki进行微阵列分析。同时，我们也感谢Editage（www.editage.jp
