《Protein Expression and Purification》：Purification and Characterization of Rabbit Polyclonal Immunoglobulin G Using DEAE Ion-Exchange Chromatography and Dynamic Light Scattering.
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S.H.S. Mariam | Roslan Noorain | W.S. Tan | A. Arbakariya | O.A. Janna
马来西亚化学与生物工程技术研究所，吉隆坡大学，Lot 1988，Bandar Vendor Taboh Naning工业区，78000，A
S.H.S. Mariam | Roslan Noorain | W.S. Tan | A. Arbakariya | O.A. Janna
马来西亚化学与生物工程技术研究所，吉隆坡大学，Lot 1988，Bandar Vendor Taboh Naning工业区，78000，Alor Gajah，Melaka，马来西亚
摘要
弱阴离子交换色谱法（AEC）为抗体纯化提供了一种比硫酸铵（AS）沉淀法更为温和的替代方法，但在复杂的血清体系中的作用机制仍不明确。本研究评估了pH依赖性的DEAE流式纯化法对兔抗HBcAg IgG的效果，并将其与AS沉淀法进行了比较。在pH 8.0时，DEAE色谱法的回收率为94%，纯度为83%，这表明IgG与树脂的相互作用减少，且能选择性地保留阴离子血清蛋白。电导率分析显示，与AS处理样品相比，离子强度降低了69%，这与结构均匀性的提高相关。动态光散射实验显示，DEAE纯化的IgG的流体力学直径约为10纳米，而AS沉淀法产生的IgG分布呈多峰状，表明发生了聚集。这些结果阐明了pH值、离子强度和蛋白质-蛋白质相互作用如何影响弱AEC过程中IgG的行为。研究结果表明，DEAE色谱法是一种温和的、能减少聚集的、可扩展的方法，适用于生产高质量的Polyclonal抗体，适用于诊断应用。
引言
Polyclonal免疫球蛋白G（IgG）在免疫诊断、传染病监测和疫苗相关血清学研究中是关键的试剂。在这些应用中，针对乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的抗体对于检测过去的或正在进行的乙型肝炎病毒（HBV）暴露以及评估临床诊断和流行病学研究中的免疫反应模式至关重要（Shi, 2023; Hassebroek et al., 2023）。IgG的结构和生化质量，包括单体完整性、纯度和聚集特征，直接影响诊断检测的敏感性、稳定性和可重复性。然而，从复杂的生物样本（如血清）中制备高质量IgG仍然是一个主要的下游加工挑战。
由于其简单性、低成本和可扩展性，硫酸铵（AS）沉淀法仍然是标准的教学实验室和小型生产方法（Fishman, 2019; Rattana et al., 2011）。然而，AS沉淀法会使免疫球蛋白暴露在极高的离子强度下，从而破坏水化层，压缩静电排斥力，并增加疏水表面的暴露。这些理化效应会促进聚集，改变构象平衡，并可能降低抗原结合的准确性（Kwan et al., 2022; Shrivastava et al., 2023）。通常需要通过大量的缓冲液交换来去除残留盐分，这增加了时间和劳动力，并导致批次间的一致性差异。在需要长期检测稳定性和低聚集水平的诊断生产中，AS沉淀法的局限性成为生产高性能IgG试剂的显著障碍。
离子交换色谱法（IEC）通过利用IgG与血清蛋白之间的电荷差异提供了一种更为温和和选择性的方法。像二乙氨基乙基（DEAE）树脂这样的弱阴离子交换树脂特别具有吸引力，因为IgG在弱碱性pH下通常表现出接近中性或略微正的电荷，使其能够被回收在流式组分中，而像白蛋白这样的强阴离子蛋白则会被留在树脂上（Liang et al., 2022; Fishman, 2019; Widayanti et al., 2024）。尽管有这些优势，但由于性能的变异性以及血清蛋白相互作用的复杂性，IEC在血清中纯化Polyclonal IgG的应用仍然有限。
多种因素导致了这种变异性，包括Polyclonal IgG的异质性、亚类电荷性质的差异、糖基化的变化以及与其他血清蛋白的相互作用。特别是白蛋白-IgG的相互作用可能会影响IgG的有效电荷和色谱行为，从而影响分离效率（Bourel, 2024）。此外，已知离子强度会影响蛋白质-蛋白质相互作用和聚集行为，但其在纯化条件与生物物理稳定性之间的关联作用尚未得到充分探索。
本研究旨在通过结合色谱性能、离子强度分析和生物物理表征，揭示弱阴离子交换色谱过程中IgG行为的机制。通过将色谱分析与电导率测量和动态光散射（DLS）相结合，本研究探讨了纯化条件如何影响IgG的结构稳定性和聚集行为。
在本研究中，我们评估了弱阴离子交换色谱法对兔血清中抗HBcAg Polyclonal IgG的纯化效果，并以AS沉淀法作为基准。将色谱性能指标与离子强度分析和DLS表征相结合，全面了解了pH值、电荷相互作用和盐条件如何共同影响IgG的回收率、纯度和单体稳定性。这些发现为将弱AEC方法应用于研究和诊断工作流程中生产高质量抗体提供了理论基础。
章节片段
原料准备
含有PR1-11E质粒的大肠杆菌 W3110IQ菌株（该质粒编码截短的HBcAg，Sah et al., 2020）在添加了0.1 mg/mL氨苄西林的Luria Bertani（LB）培养基中培养。当OD600 nm达到0.8时，加入0.5 mM异丙基-β-D-噻巴糖苷（IPTG）以诱导HBcAg的表达。然后在4°C下使用Avanti JLA-16 250转子（Beckman, USA）以3752 × g的离心力离心15分钟，将细胞沉淀物重新悬浮在Tris-HCl缓冲液中（50
弱阴离子交换色谱法的pH依赖性选择性和IgG-白蛋白相互作用的作用
本研究的首要目的是评估pH值如何调节弱阴离子交换色谱法（AEC）过程中Polyclonal IgG的分离行为，重点关注IgG与白蛋白之间的相互作用，这两种血清蛋白具有不同的理化性质。SDS-PAGE结果显示（图1a），在pH 7.0时，只有少量的IgG出现在流式组分中（第2道泳道），而白蛋白则被强保留于DEAE树脂上，并在盐洗后洗脱出来（第5道泳道）。
结论
本研究评估了弱阴离子交换色谱法（AEC）对血清中Polyclonal IgG的纯化效果，并与传统的硫酸铵（AS）沉淀法进行了比较。结果显示，在弱碱性pH下，DEAE色谱法能够有效分离IgG和阴离子血清蛋白，在pH 8.0时由于IgG与阴离子交换树脂的相互作用降低，回收率得到提高。与在高温下操作的AS沉淀法相比
CRediT作者贡献声明
Sharifah Mariam Sayed Hitam：写作 – 审稿与编辑、方法学、实验设计、数据分析、概念化。Roslan Noorain：写作 – 审稿与编辑、方法学、实验设计、数据分析。Wen Siang Tan：写作 – 审稿与编辑、监督、资源管理、方法学。Arbakariya Ariff：实验设计、数据分析、数据管理。Janna Ong Abdullah：写作 – 审稿与编辑、概念化
致谢
作者感谢吉隆坡大学（MICET）和Majlis Amanah Rakyat（MARA）提供的财政支持。
