针对SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro，亦称3CLpro）抑制剂开发的紧迫需求，研究人员开发了一种基于目标特异性深度学习的工作流程。该研究利用不断扩充的实验性Mpro-抑制剂数据集，结合微调后的抑制剂预测模型、溶解度（logS）与亲脂性（logP）模型、分子相似性分析及文献挖掘，从超过50万种可购化合物库中筛选出24个候选物进行实验验证。生化分析鉴定出一种新型小分子共价抑制剂片段（A02），其表观IC50值为1.5 μM。1.76 ?的晶体结构显示A02共价修饰了催化半胱氨酸（C145），并独特地占据了未被充分利用的MproS3′口袋。该研究证明了目标特异性深度学习方法在加速发现新型抑制剂先导化合物或药物骨架方面的潜力。

《ACS Chemical Biology》：A Novel Covalent Inhibitor Fragment for the SARS-CoV-2 Main Protease Identified by Target-Specific Deep Learning

　　

针对SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro，亦称3CLpro）持续进化的威胁，研究人员开发了一种目标特异性的深度学习工作流程，以加速发现新的Mpro抑制剂化合物及片段状起始点。该工作流程结合了微调后的抑制剂预测模型、溶解度（logS）与亲脂性（logP）模型、分子相似性分析及文献挖掘，用于优先筛选新型、类药候选物。将该策略应用于包含超过500,000种化合物的可购买库，该方法迅速识别出24个候选物进行实验测试。生化分析揭示了一种新型的、小的共价抑制剂片段（A02），在未经任何合成优化或衍生化之前，其表观IC50为1.5 μM。Mpro与A02结合的1.76 ?晶体结构证实了与催化Mpro半胱氨酸（C145）的共价修饰、与未被充分利用的MproS3′口袋的独特结合，以及该骨架衍生物在未来优化工作中与其他Mpro口袋相互作用的潜力。这些结果共同证明了目标特异性深度学习方法在指导快速筛选和发现新抑制剂先导物或药物骨架方面的潜力。

基于目标特异性深度学习的SARS-CoV-2主蛋白酶新型共价抑制剂片段发现

研究背景

尽管COVID-19疫苗取得了巨大成功，但SARS-CoV-2及相关冠状病毒仍对免疫功能低下个体构成严重威胁，并可能成为未来大流行的源头。SARS-CoV-2主蛋白酶（M^pro，又称3CL^pro）因其在病毒复制中的关键作用、在冠状病毒中的高度保守性以及缺乏相近的人类同源物，成为极具吸引力的抗病毒靶点。目前临床上广泛使用的奈玛特韦（Nirmatrelvir）虽有效，但已出现耐药突变，凸显了对新型抑制剂骨架的需求。随着大量M^pro实验数据的积累，特别是高通量筛选和基于片段的晶体学数据，为目标特异性机器学习模型的开发提供了基础。

研究方法概述

研究人员采用了一种综合性的计算与实验验证策略。首先，利用知识图谱增强的分子对比学习结合功能提示（KANO）模型，分别构建了针对M^pro抑制剂活性的分类模型、溶解度（logS）回归模型和亲脂性（logP）回归模型。这些模型基于NIH 3CL检测、COVID Moonshot及文献来源的13,484个化合物数据集进行训练。随后，将该工作流程应用于Asinex虚拟库（575,302个化合物），通过预测概率、类药性过滤（logS: -5至0，logP: 0至5）、分子相似性（Tanimoto系数 < 0.85）及文献检索，最终筛选出24个候选化合物进行生化验证。关键技术手段还包括荧光共振能量转移（FRET）生化分析、X射线晶体学结构解析以及AlphaSpace2口袋分析。

研究结果

2.1. KANO微调模型的开发与评估

研究人员开发了三种基于KANO的模型用于虚拟筛选。M^pro-抑制剂分类模型在测试集上达到了0.883的精确率（Precision），意味着近88%被预测为阳性的化合物在回顾性测试中确为抑制剂。尽管召回率（Recall）较低（0.308），但在虚拟筛选中高精确率对于减少后续昂贵的实验验证成本至关重要。KANO-logS模型在大型数据集上的均方根误差（RMSE）为0.78，皮尔逊相关系数（PCC）达0.94；KANO-logP模型的RMSE为0.366，均表现出优异的性能，为下游化合物筛选提供了可靠的理化性质依据。

2.2. 虚拟筛选工作流程结果

将训练好的模型应用于Asinex虚拟库，初步预测出425个活性化合物。经过类药性评估和新颖性过滤（Tanimoto相似度 < 0.85），并通过文献检索排除已知化合物后，剩余76个候选物。最终，研究人员根据预测概率排序，选取了前24个候选化合物（A01-A24）进行生物测定。这些候选物的平均预测概率为0.625，平均logP和logS值分别为3.13和-4.39，显示出良好的类药性和低相似性。

2.3. 实验性M^pro抑制筛选

利用荧光肽底物裂解实验对24个候选物进行初筛。结果显示，化合物A02、A08、A22和A24表现出潜在的抑制活性。进一步的确认筛选表明，A02表现出显著的剂量和时间依赖性抑制效果，而其他三个化合物仅表现出微弱的抑制活性。这表明A02是其中最强有力的M^pro活性抑制剂。

2.4. 候选物A02作为共价M^pro抑制剂的验证

抑制实验显示A02的抑制活性具有强烈的时间依赖性，这与A02通过其氯乙酰基（chloroacetyl）功能团与M^pro活性位点半胱氨酸发生共价反应的机制相符。测定结果显示，M^pro与A02预孵育1小时的表观IC₅₀为1.5 μM；而将预孵育时间延长至24小时后，在所有测试浓度下均观察到完全抑制，表明其表观IC₅₀远小于1.5 μM，确证了A02是一种共价抑制剂。

2.5. M^pro-A02晶体结构

研究人员解析了A02与M^pro结合的1.76 ?高分辨率晶体结构。电子密度图清晰地显示了A02共价结合在M^pro二聚体两个活性位点的催化残基C145上。A02的甲氧基苯基（methoxyphenyl）占据M^pro的S3′口袋，与T25、H41、S46和M49等残基发生堆积作用。同时，A02的羰基与G143和C145的主链NH基团形成氢键，甲氧基苯基氧原子则通过水分子介导与M^pro形成氢键网络。

2.6. A02作为新型SARS-CoV-2 M^pro共价抑制剂骨架

通过对PDB数据库的结构调查，研究人员量化了配体与S3′口袋（由Thr25、Cys44和Met49定义）的相互作用。分析发现仅有极少数配体能紧密结合该口袋。对PubChem中已测试的M^pro化合物进行骨架搜索，仅发现两种含有1-苯基吡咯（1-phenylpyrrole）基团的化合物，但它们均为肽模拟物，且取向与A02相反或未占据S3′口袋。这突显了A02作为一种独特的、能占据S3′口袋的新型共价抑制剂骨架的地位。

2.7. AlphaSpace2口袋分析揭示A02的优化潜力

利用AlphaSpace2进行的口袋分析显示，A02主要占据S3′位点（口袋#1）。然而，位于A02邻近的高评分口袋#3（S3位点）和#4（S1位点）的占有率分别仅为35.4%和12.21%。这表明A02当前的骨架尚未充分利用M^pro活性位点周边的空间，存在巨大的化学衍生化和优化潜力，未来可通过延伸骨架与这些相邻口袋形成额外相互作用，以提高亲和力和选择性。

结论与讨论

本研究通过连接目标特异性深度学习优先级排序与实际生化测试和晶体学验证，展示了一种高效的抗病毒药物发现模式。研究人员利用深度学习工作流程从575,302个化合物中筛选出24个候选物，并成功鉴定出A02这一具有低微摩尔级表观效力和独特结合模式的共价抑制剂片段。M^pro-A02复合物的晶体结构揭示了其通过与催化半胱氨酸C145形成共价键以及与S3′口袋结合而发挥作用的机制。结合口袋占据率和AlphaSpace分析，A02不仅是一个全新的化学骨架，更为后续通过结构引导的优化以改善亲和力、选择性和药代动力学性质提供了明确的起点。这项工作证明了将先进的计算方法与严格的实验验证相结合，能够有效应对像SARS-CoV-2这样持续演变的病原体所带来的药物研发挑战。该研究成果发表于《ACS Chemical Biology》。