集成密度泛函理论（DFT）与循环伏安法结合的方法用于筛选具有潜在抗氧化特性的Knoevenagel加合物

《ACS Omega》：Integrated DFT and Cyclic Voltammetry Approach for Screening Redox-Active Knoevenagel Adducts with Potential Antioxidant Applicability

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在这项研究中，采用了一种结合量子化学和电化学的方法来评估合成的Knoevenagel加合物作为潜在的抗氧化剂候选者。分子几何结构在B3LYP/6-31 + G(d,p)水平上进行了优化，从B3LYP/6-311++G(2d,2p)水平上的单点计算中获得了电子描述符，包括最高占据分子轨道（HOMO）、最低未占据分子轨道（LUMO）、能隙（GAP）、电离势（IP）、单电子转移（SET）和分子静电势（MEP）图。通过对MEP图以及前沿分子轨道的分析，能够识别出富电子和缺电子区域，并有助于阐明参与基于电子转移的抗氧化剂筛选的优选氧化还原活性位点。理论结果表明，用作参考化合物的多巴胺在所分析的分子中具有最低的电离势（IP）。在Knoevenagel加合物中，化合物6表现出了最有利的性质，其IP为182.92 kcal mol–1，SET值为4.92 kcal mol–1。通过在KOH存在下用氰基乙酸与芳香醛衍生物进行微波辅助缩合，合成了一系列Knoevenagel加合物（1-6），产率为71–85%。结构鉴定通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）和核磁共振光谱（NMR）完成。对于化合物5和6，FTIR光谱确认了在2223和2221 cm–1处的特征C≡N伸缩带，以及1687和1716 cm–1处的C═O吸收带；化合物6还显示出与甲氧基取代相应的带。电化学验证是通过使用用化合物5和6化学改性的石墨/环氧复合电极进行的循环伏安法（CV）完成的。6/GRAPHITE/EPOXY电极表现出最高的氧化还原响应，阳极和阴极峰值电流分别为59.25和?40.37 μA，表明其电子转移效率高于5/GRAPHITE/EPOXY和未改性的电极。总体而言，这些结果证明，将基于密度泛函理论（DFT）的筛选与循环伏安法相结合是一种有效的策略，用于识别具有潜在抗氧化适用性的氧化还原活性Knoevenagel衍生物。

**引言**

自由基被定义为含有一个或多个未配对电子的化学物种，在许多生物和病理过程中起着核心作用，与氧化应激直接相关。(1,2) 在主要感兴趣的自由基中，如羟基自由基（•OH）、超氧阴离子（O2•-）和过氧自由基（ROO•）尤为突出，这些自由基在过量时会损伤脂质、蛋白质和核酸，引发包括癌症、神经退行性疾病和心血管疾病在内的一系列疾病。(3,4) 由于抗氧化行为是一个多因素现象，其评估不能仅依赖于单一的实验或理论参数。在这种情况下，密度泛函理论（DFT）被广泛用于估计与氧化还原反应和反应性相关的描述符，如电离势、电子亲和力、前沿轨道能量和分子静电势，这些对于合理解释电子转移倾向和识别潜在活性位点非常有用。

在这种情况下，氧化应激的特点是促氧化物质与抗氧化防御系统之间的不平衡，这推动了寻找能够清除自由基并减轻其有害影响的化合物的研究。(5) 从Knoevenagel反应得到的化合物由于具有共轭系统和官能团而引起了越来越多的兴趣，这些共轭系统和官能团可以促进自由基的稳定，并可能赋予抗氧化和杀虫活性。(6,7) Knoevenagel反应是最通用的C–C键形成方法之一，已广泛应用于生物相关分子的合成，包括药品、天然产物和聚合物材料。在这方面，Knoevenagel加合物衍生物（图1）被称为构建块，因为它们参与了具有抗菌、抗癌、抗菌和抗阿尔茨海默病活性的分子的合成。(7)

图1
图1. 使用B3LYP/6-31 + G(d,p)基组优化的多巴胺和Knoevenagel加合物（1–6）的结构。碳（灰色）；氢（白色）；氧（红色）；氮（蓝色）；溴（酒红色）；氯（绿色）；氟（青色）。

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此外，基于DFT的计算化学工具能够预测与抗氧化反应性相关的分子参数，包括前沿分子轨道能量[最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占据分子轨道（LUMO）]、IP、电子亲和力和自由基物种中的自旋密度分布。(8) 多巴胺由于含有儿茶酚基团（邻位二羟基苯），表现出高抗氧化能力，主要通过单电子转移（SET）、氢原子转移（HAT）和顺序质子损失电子转移（SPLET）机制发挥作用，特别是在生理pH条件下，酚基团的去质子化有助于电子转移并通过芳香环内的共振稳定产生的自由基。(8) 然而，Knoevenagel加合物具有α,β-不饱和系统，这些系统与吸电子基团共轭，也可能包含酚基取代基，不仅可以通过传统的SET、HAT和SPLET机制发挥抗氧化活性，还可以通过Michael类型的自由基加成途径发挥作用，其中亲核自由基加成到共轭系统的β-碳上，产生稳定产物，并有助于减轻氧化应激。(9,10)

化学化合物的抗氧化活性可以通过多种分析方法进行评估，其中传统的比色测试，如DPPH（2,2-二苯基-1-吡啶肼）、ABTS（2,2′-偶氮双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）、FRAP（铁还原抗氧化能力）和ORAC（氧自由基吸收能力）因其简单性、低成本和适用于复杂基质而得到广泛应用。(11?13) 然而，这些方法存在一些局限性，包括溶剂依赖性、易受干扰物质的影响、非生理实验条件以及区分不同抗氧化机制的能力有限。在这方面，循环伏安法作为一种有价值的补充电分析方法出现了，它可以提供氧化还原参数，如氧化电位、转移的电子数和自由基-产物稳定性，同时还能实时评估这些过程的动力学和热力学。(14?16) 这种理论-实验相结合的方法为将基于DFT的电子转移描述符与循环伏安法的氧化还原参数相关联提供了合理的筛选框架，从而支持识别最具氧化还原活性的Knoevenagel加合物及其潜在的抗氧化适用性。在这项工作中，主要创新之处在于直接使用用合成的Knoevenagel加合物改性的石墨/环氧复合电极，而不依赖于电分析平台中常用的多组分架构或纳米材料。此外，尽管与Knoevenagel反应相关的芳基马来腈和氰基乙酸酯衍生物之前已在传统的抗氧化测试中进行了研究，但针对这类化合物结合使用基于DFT的描述符筛选和循环伏安法的电化学验证仍较少探索。因此，本研究为基于机制指导的Knoevenagel衍生物筛选提供了一种有用的方法学贡献。(17,18)

**结果与讨论**

FMOs被用于比较整个系列中电子供体（HOMO）和电子受体（LUMO）区域的空间分布。HOMO主要分布在芳香/共轭π-框架上，在羟基化衍生物中，还显示出氧孤对（nO）对π-系统的贡献，这与更容易氧化（电子供体）一致。相比之下，LUMO主要局域在α,β-不饱和部分的缺电子段（β-碳和羰基/氰基区域），表明这是电子吸收的优选位点（π特性）。(19?21) 从这一点来看，图2中显示了相应的轨道。

图2
图2. 多巴胺和Knoevenagel加合物衍生物的HOMO、LUMO和MEP。

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数据揭示了多巴胺和Knoevenagel衍生物芳香环内的亲核区域。这一特征是预期的，因为碳原子之间的π键通过共振促进了整个环内的电子离域。(22,23) 观察到的相互作用相对较弱，表明稳定性较低。因此，在另一分子存在的情况下，这些键可能会断裂，生成以碳为中心的阴离子物种而不是释放氢。此外，甲基显示出不太明显的富电子区域，表明这些部分在电子上比分子的其他区域更中性。进一步，所得结果允许计算GAP、IP和SET，如表1所示。

表1. 使用B3LYP/6-311++G(2d,2p)理论的分子的量子化学性质
分子 HOMO (eV) LUMO (eV) GAP (eV) IP (kcal/mol) SET (kcal/mol)
多巴胺 8.90–4.87 4.03 178.00 0.00 1–7.2 3.00 4.24
20 5.70 27.70 2–7.1 3.20 4.01
20 2.00 24.00 3–7.2 3.20 4.06
20 3.60 25.60 4–7.4 3.22 4.20
20 9.92 31.92 5–6.9 4.12
19 8.87 20.87 6–6.4 1–2.7 3.64
18 2.92 4.92

对照组分子是多巴胺，所使用的参数值是基于文献中获得的DFT方法优化结果得出的。(24) 与具有高抗氧化潜力的对照组分子相比，所有Knoevenagel加合物的HOMO和LUMO值都较低。从能量差（EQ）的角度来看，它决定了化学实体的反应性，观察到化合物5的模数较高，而对照组则处于中间值。

IP可以定义为将电子从所属原子中撕裂所需的最小能量。(25,26) 从这个角度来看，移除电子所需的能量越低，分子的抗氧化潜力越大。因此，化合物6在Knoevenagel衍生物中显示出最低的电离能，值为182.92 kcal mol–1。这一发现对于这类化合物来说是相关的，尽管其值略高于多巴胺观察到的值（178.00 kcal mol–1）。SET与保持自由基的能力相关，当其值尽可能低时，与抗氧化活性直接相关。(27,28) 化合物6在分析的分子中显示出最低的值。尽管如此，多巴胺显示出更大的自由基清除潜力，这可能归因于其分子结构，因为它有利于电亲电区域的脱氢。此外，静电势图（EPMs）显示羟基具有更正的氢原子，表明更倾向于均裂键断裂。(29,30) 因此，由于存在两个羟基（–OH），多巴胺比本研究中研究的化合物更容易被氧化。尽管如此，化合物6显示出有希望的结果，可以通过结构修改或分子简化进一步完善。因为生物系统中的抗氧化行为是多因素的，所以本研究的结论仅限于在实验条件下获得的氧化还原描述符和电化学响应。

分子5的红外光谱显示了 Cyan基团（C≡N）轴向键形成的带在2223.6 cm–1处，以及C═O相互作用在1687.8 cm–1处。此外，芳香环C═C键的振动带在1580.6 cm–1处被阻断。739.8 cm–1处的带还揭示了四个氢在同一芳香区域形成的键。根据文献中的结果对获得的带进行了分类（表2）。分子5的质子核磁共振（500 MHz，DMSO-d6）显示，在8.27 ppm（s，1H）处是乙烯基氢，在7.93 ppm（d，J = 8.0 Hz，2H）处是属于芳香环的氢，在7.39 ppm（d，J = 8.0 Hz，2H）处也是属于芳香环的氢，在2.38 ppm（s，3H）处是一个单峰，对应于甲基中的氢。

表2. 傅里叶变换红外光谱（FTIR）中发现的带的分类
分子 λ (cm–1) 参考文献(7和31)
5 6 4H 739
--- CN 2223 2221 2229 2223
C═C (ARO) 1580 1576 1604 1581
C–O–H 1409 1421 1422 C═O 1687 1716 1728
C–O–C- 1250 -- --

化合物6的红外光谱显示了C≡N基团的伸缩振动带在2221.5 cm–1处，以及C═O伸缩振动带在1716.6 cm–1处。与化合物5类似，也检测到了与芳香环C═C伸缩振动相关的带在1576.5 cm–1处。1421.9 cm–1处的带与C–O–H振动相关，结合1716.6 cm–1处的羰基吸收，表明存在羧酸官能团。此外，1250.9 cm–1处的带表明存在与芳香环相互作用的甲氧基。(2)

因此，分子6的质子核磁共振（500 MHz，DMSO-d6）显示在8.28 ppm（s，1H）处是乙烯基氢的单峰，在7.49 ppm（s，2H）处是芳香环氢的特征峰，在3.87 ppm（s，6H）处是甲氧基氢的特征峰，在3.78 ppm（s，3H）处也是甲氧基氢的特征峰。使用循环伏安法（CV）在未修饰和修饰过的碳糊电极上获得了多巴胺（DP）的氧化-还原伏安图，DP浓度为1 mM，支持电解质为0.1 M的HClO4（高氯酸）。因此，进行了循环伏安实验，使用经过Knoevenagel加合物5和6改性的电极以及未经改性的GRAPHITE/EPOXY电极，以评估这些化合物对电极改性的影响，进而研究它们的氧化还原行为和潜在的抗氧化相关性，如图3所示。图3显示了在改性的（─）5/GRAPHITE/EPOXY、（─）6/GRAPHITE/EPOXY和（─）未经改性的电极上多巴胺的循环伏安曲线。高分辨率图像。下载MS PowerPoint幻灯片。

数据显示，6/GRAPHITE/EPOXY电极的阴极峰电流（Ip）是未经改性电极的2.87倍。同样，5/GRAPHITE/EPOXY电极也显示出增强的阴极峰电流，比未经改性的电极高出1.85倍；然而，其响应仍然低于使用化合物6改性的电极，这与计算机模拟的结果一致。复合材料的改性增强了系统的电催化行为，较高的阴极峰电流与增加的电子转移速率常数（Ks）相关，与未使用Knoevenagel加合物改性的电极相比。

关于峰分离，未经改性的GRAPHITE/EPOXY电极的ΔEp为0.39 V，小于复合材料5和6的ΔEp值，分别为0.52 V和0.40 V。阳极电位（Epa）、阴极电位（Epc）、峰分离（ΔEp）以及阳极（Ipa）和阴极（Ipc）峰电流的数值与Freire（2015）报告的结果一致，如表3所示。

确定氧化还原过程动力学的研究范围是在10到650 mV s–1的扫描速度之间，结果显示随着速度的增加，峰电流（Ip）呈现线性变化。因此，Ip的增加支持了5/GRAPHITE/EPOXY和6/GRAPHITE/EPOXY电极上的氧化还原过程可逆性的假设，尽管这些峰并未显示完全对称性（图4）。根据电化学参数，可以计算出阳极（Epa）和阴极（Epc）峰电位，并据此计算出峰电位差（ΔEp），该差值随扫描速率的增加而增大。

为了了解多巴胺在改性电极中的质量传递情况，得到了峰电流与扫描速度平方根以及峰电流与速度对数的关系图，如图5所示。结果表明，峰电流与v1/2成线性关系（R2 > 0.98），表明该过程更为可逆。改性电极5（C）和6（D）的线性回归中角系数（δ log (ip)/δ log(v)）为0.43，这表明过程仅受扩散控制，因为其接近0.5。（32,33）因此，该过程是扩散性的，并且改性电极表面没有吸附现象。

Knoevenagel加合物的结构和化学活性如图1所示，它们是通过氰乙酸与不同芳香醛衍生物的反应获得的。所有结构的几何优化使用B3LYP/6-31 + G(d,p)级别的DFT计算进行。基于B3LYP/6-311++G(2d,2p)级别的双ζ和三ζ基团的额外计算，分析了化学结构与抗氧化活性（电子性质）之间的关系。（34?36）所有理论计算，包括MEP的可视化，都是使用Gaussian 16计算软件完成的。（37）化合物的化学活性基于前线轨道（HOMO和LUMO）的能量进行评估，这些能量分别与亲核性和亲电性参数相关联。（38）全局反应性参数是根据LUMO和HOMO轨道之间的能量差（gapLUMO–HOMO）估算的，如方程1所示，同时还进行了自旋密度分析。

研究氧化还原过程动力学的扫描速度范围为10至650 mV s–1，数据显示峰电流（Ip）随速度的增加而线性变化。因此，Ip的增加支持了5/GRAPHITE/EPOXY和6/GRAPHITE/EPOXY电极上氧化还原过程可逆性的假设。根据电化学参数，可以计算出峰电位差（ΔEp），该差值随扫描速率的增加而增大。

图4显示了伏安参数随电位扫描速度（V）的变化情况。高分辨率图像。下载MS PowerPoint幻灯片。

通过扫描速度的平方根和速度的对数对峰电流进行绘图，以了解多巴胺在改性电极中的质量传递情况。图5表明，峰电流与v1/2成线性关系（R2 > 0.98），这表明该过程更为可逆。改性电极5（C）和6（D）的线性回归中的角系数（δ log (ip)/δ log(v)为0.43，这是仅受扩散控制的过程的条件，因为它接近0.5。（32,33）

Knoevenagel加合物的结构和化学活性如图1所示，它们是通过氰乙酸与不同芳香醛衍生物的反应获得的。所有结构的几何优化使用B3LYP/6-31 + G(d,p)级别的DFT计算进行。基于B3LYP/6-311++G(2d,2p)级别的双ζ和三ζ基团的额外计算，分析了化学结构与抗氧化活性（电子性质）之间的关系。（34?36）所有理论计算，包括MEP的可视化，都是使用Gaussian 16计算软件完成的。（37）化合物的化学活性基于前线轨道（HOMO和LUMO）的能量进行评估，这些能量分别与亲核性和亲电性参数相关联。（38）全局反应性参数是基于LUMO和HOMO轨道之间的能量差（gapLUMO–HOMO）估算的，如方程1所示，同时还进行了自旋密度分析。

KNOEVENAGEL加合物的化学性质

KNOEVENAGEL加合物的结构如图1所示，是通过氰乙酸与不同的芳香醛衍生物反应得到的。所有结构的几何优化使用B3LYP/6-31 + G(d,p)级别的DFT计算进行。化学结构与抗氧化活性（电子性质）之间的关系的分析是基于B3LYP/6-311++G(2d,2p)级别的双ζ和三ζ基团的额外计算进行的。（34?36）所有理论计算，包括MEP的可视化，都是使用Gaussian 16计算软件完成的。（37）化合物的化学活性是基于前线轨道（HOMO和LUMO）的能量进行评估的，这些能量分别与亲核性和亲电性参数相关联。（38）全局反应性参数是根据LUMO和HOMO轨道之间的能量差（gapLUMO–HOMO）估算的，如方程1所示，同时还进行了自旋密度分析。

IP与电子或氢的捐赠有关。IP是中性分子（ArOH）与相应的阳离子自由基（ArOH•+）之间的能量差，如方程2所示。自由基稳定性通过相关的稳定能量来确定，如方程3所示，适用于单电子转移（SETs）和与多巴胺（DOH）相比的机制。

化学：苯醛（>99%）（100–52–7），4-溴苯醛（99%）（1122–91–4），4-氯苯醛（97%）（104–88–1），4-氟苯醛（98%）（459–57–4），4-甲基苯醛（99%）（104–87–0），4-硝基苯醛（99%）（555–16–8），4-羟基苯醛（98%）（123–08–0），3,4,5-三甲氧基苯醛（98%）（86–81–7），4-甲氧基苯醛（97%）（123–11–5），3-氟苯醛（97%）（456–48–4），2-氟苯醛（97%）（446–52–6），2-硫代苯甲醛（98%）（98–03–3），糠醛（99%）（98–01–1）和氰乙酸（99%）（372–09–8）从Sigma-Aldrich（巴西）购买，未经进一步纯化使用。KOH（99%）（1310–58–3）和HCl（37%）（7647–01–0）从Synth（巴西迪亚德马）购买。氘代溶剂丙酮-d6（99%）（666–52–4）和DMSO-d6（99%）（2206–27–1）从Cambridge Isotope Laboratories（巴西里约热内卢）购买。溶剂己烷（99%）（110–54–3），乙酸乙酯（99%）（141–78–6），甲醇（99%）（67–56–1）和乙醇（99%）（64–17–5）从Aldrich、Synth和Vertec（巴西圣保罗）购买，未经进一步纯化使用。

分子的合成

这些分子是在圣卡洛斯化学研究所（IQSC/USP）的有机化学和生物催化实验室合成的，并使用1H、13C NMR和FTIR等光谱技术进行了化学鉴定。将1 mmol的醛、1 mmol的氰乙酸和5 mL的水加入微波反应器（55 W）中，然后加入0.7 M的KOH溶液（5.0 μL），在75 °C下搅拌20分钟。通过使用EtOAc/己烷（8:2）作为流动相的薄层色谱（TLC）监测反应进度。完成后，加入1 mL的3 M HCl，再搅拌30分钟。所得混合物用乙酸乙酯（3 × 25 mL）提取，合并的有机层在减压下浓缩至干燥。粗产品用硅胶（230–400目）柱层析纯化，使用与TLC相同的洗脱系统（支持信息-图S1–S6和表S1和S2）。分子结构被用作输入文件（mol和sdf）进行量子化学研究，以优化几何结构和研究抗氧化能力。在计算机模拟步骤中定义的具有最佳抗氧化潜力的分子（IP e SET）被选为使用循环伏安（CV）技术测试其氧化还原电位的实验对象。

图6显示了KNOEVENAGEL加合物（1–6）的合成范围。高分辨率图像。下载MS PowerPoint幻灯片。

通过FTIR进行化学表征

使用Shimadzu IRAffinity-1光谱仪（Shimadzu，圣保罗圣卡洛斯）记录了傅里叶变换红外（FTIR）光谱。分析使用的是含有KBr的压缩片剂盘。透射率以4000至450 cm–1波段内的cm–1表示。

1H和13C NMR

核磁共振（NMR）光谱是在Agilent Technologies 500/54 Premium Shielded或Agilent Technologies 400/54 Premium Shielded光谱仪上记录的，使用DMSO-d6或丙酮-d6作为溶剂，四甲基硅烷（TMS）作为内标（Agilent Technologies，圣保罗圣卡洛斯）。化学位移以ppm表示，耦合常数（J）以Hz表示。化学位移（δ）以百万分之一（ppm）表示，并参考四甲基硅烷内标（TMS）信号和使用的氘代溶剂DMSO-d6（δH: 2.50，δC 39.52）。对于1H NMR光谱，扫描次数为120次；对于13C NMR，扫描次数为881次。

石墨/环氧树脂复合电极的制备

碳糊电极是由石墨（导体）和特定规格的树脂（粘合剂）组成的复合电极。（39）石墨/环氧复合电极采用35%环氧树脂和65%石墨的比例制备。（<20 μm，sigma-aldrich，德国施泰因海姆）。将0.6789 g的环氧树脂sq-2126（avipol，圣保罗）和15 μl的硬化剂sq-3024与1.2608 g的石墨混合，形成碳糊。（40）然后将碳糊放入三个1 mL的塑料注射器中，并在活塞尖端加入铜线，以建立复合电极与电位计之间的电接触。使用手动压机对复合电极施加压力，保持一天以固化电极。最后，用60目和120目的砂纸对电极进行抛光活化。

电分析试剂和溶液

使用的试剂为分析纯度等级，可用于制备电化学溶液。电解液由高氯酸[HClO4]（êxodo Científica）作为支持电解质，浓度为0.1 M，以及多巴胺（DP）[C8H11NO2]（Sigma-Aldrich），浓度为1 mmol L–1，用作电化学探针。用于修饰工作电极的溶液为无水酒精[C2H6O]（Dinamica），因为化合物5和6不溶于水，其Log P >1（分配系数）。

循环伏安法的应用

循环伏安测量在阿马帕联邦大学（UNIFAP）的原子吸收和生物探测实验室（LAAB）进行，使用连接到Metrohm Autolab电位计/ Galvanostat PGSTAT302N的电化学单元，该电位计由Nova软件版本2.1.5控制，适用于建立、编译和处理数据及参数（表4）。

表4. 循环伏安法使用的参数

电化学单元由一个经过化学改性的工作电极（GRAPHITE/EPOXY复合电极）组成，包含两层5 μL的测试分子，一个微型化的Ag|AgCl|KCl(sat)参比电极，以及一个铂电极作为辅助电极。（42）然后使用OriginPro软件版本9.65处理获得的数据。（43）

结论

在B3LYP/6-311++G(2d,2p)级别进行的量子化学计算用于结构优化和能量最小化，结果令人满意，因为它们能够评估从化合物5和6中移除电子所需的最小能量。循环伏安图证实了这些系统的氧化还原行为，与计算出的电子损失参数一致。就电子转移而言，用这些化合物改性的电极显示出比未经改性的石墨/环氧电极更高的阴极峰电流值，表明在相同的扫描速率条件下，电子从电极表面的转移增强。此外，计算结果表明电荷转移主要通过羟基进行，因为MEP图显示这些位置有利于亲核攻击，这一点也适用于多巴胺的两个羟基，与其更大的抗氧化潜力一致。因此，所采用方法的可靠性得到了进一步支持，旨在减少试剂消耗并提高筛选新型潜在抗氧化剂的效率。然而，目前的发现应被视为计算-电化学筛选结果，而非最终的生物学证据，因为没有进行基于细胞的或体内的实验。此外，KNOEVENAGEL加合物的溶解性和介质兼容性限制可能影响电分析响应，并限制其生物学可转化性。因此，未来的研究应包括正交的抗氧化测试（DPPH、ABTS和FRAP），制定提高溶解性的配方策略，并在相关实验模型中进行生物学验证。