综述：在人-寄生线虫Strongyloides stercoralis中的转基因技术和靶向突变技术

《Frontiers in Parasitology》：Transgenesis and targeted mutagenesis in the human-parasitic nematode Strongyloides stercoralis

　　**摘要**
Strongyloides stercoralis 是一种通过土壤传播的蠕虫，据估计在全球范围内导致3亿至6亿人感染，主要发生在热带和亚热带国家的贫困地区。迄今为止，S. stercoralis 是唯一一种可以生成稳定转基因或突变系的人类寄生线虫，这些系可以通过实验室宿主——蒙古沙鼠进行无限期维持。由于其健康意义和易于进行基因操作，S. stercoralis 迅速成为理解线虫寄生性的分子和细胞基础的重要模型系统。在这篇简短综述中，我们讨论了生成转基因和突变 S. stercoralis 的方法，重点介绍了生成稳定转基因或敲除系的技术。我们还探讨了这些方法如何为这些高度致病性、有时甚至致命的人类寄生虫的基本生物学研究提供新的见解。

**引言**
土壤传播的蠕虫（STHs）是一类通过摄入感染性卵或幼虫，或接触受粪便污染的土壤中的感染性幼虫而传播的寄生线虫（Buonfrate 等，2023；Czeresnia 和 Weiss，2022；Loukas 等，2021）。STHs 包括 Necator 和 Ancylostoma 属的钩虫、巨型肠道圆线虫 Ascaris lumbricoides、鞭虫 Trichuris trichiura 以及人类丝虫 Strongyloides stercoralis（Buonfrate 等，2023；Czeresnia 和 Weiss，2022；Loukas 等，2021）。这些胃肠道蠕虫感染了全球超过15亿人，导致慢性衰弱性疾病，而在免疫系统受损的个体中，S. stercoralis 感染可能是致命的（Buonfrate 等，2020；Chen 等，2024；Fleitas 等，2022；Loukas 等，2021；Riaz 等，2020）。此外，感染 STHs 的儿童可能会出现生长迟缓或营养缺乏，从而导致终生的健康问题（Fauziah 等，2022；Forrer 等，2017）。生活在热带或亚热带地区、缺乏适当污水和卫生基础设施的经济弱势群体受 STHs 的影响尤为严重（Beknazarova 等，2016；Loukas 等，2021；Lynn 等，2021；Magalh?es 等，2023；McKenna 等，2017）。接触受 STH 污染土壤的个体要么通过粪-口途径（A. lumbricoides 和 T. trichiura），要么通过皮肤穿透（钩虫和 S. stercoralis）而被感染（Buonfrate 等，2023；Loukas 等，2021）。某些钩虫以及可能的 S. stercoralis 也可以在摄入感染性幼虫时引起感染（Buonfrate 等，2023；Loukas 等，2021）。虽然伊维菌素是标准的抗蠕虫治疗药物，但目前还没有针对任何 STH 的预防措施或疫苗，而且药物疗效不佳和耐药性是一个主要问题（Buonfrate 等，2023；Coffeng 等，2024；Fissiha 和 Kinde，2021；Ng’etich 等，2023；Sengthong 等，2021）。

S. stercoralis 是被忽视的热带疾病 strongyloidiasis 的病原体，全球约有3亿至6亿人感染（Buonfrate 等，2020；Fleitas 等，2022）。感染 S. stercoralis 的个体可能会经历胃肠道不适。然而，在免疫抑制的情况下，由于蠕虫负担过重或幼虫在体内扩散，可能会出现严重病例（Buonfrate 等，2023）。在自身感染的情况下，控制感染变得复杂，因为寄生虫会不断在同一宿主体内重新感染。治疗自身感染需要每周重复使用抗蠕虫药物；加上缺乏可靠的快速检测方法，这使得 strongyloidiasis 成为一种特别难以根除的疾病（Buonfrate 等，2023；Lo 等，2025；Luvira 等，2022；Tamarozzi 等，2023）。消除皮肤穿透性线虫的努力包括改善当地卫生基础设施、穿封闭式鞋子以及广泛的监测计划。然而，这些方法单独使用不足以减少慢性或扩散的感染（Buonfrate 等，2023；Lo 等，2025）。因此，了解驱动寄生虫致病性的分子机制对于优化针对性预防措施、诊断方法和治疗方法的开发至关重要。

S. stercoralis 具有复杂的生命周期，包括自由生活阶段和寄生阶段（图1A）。发育受阻的土壤中的第三期感染性幼虫（iL3）利用宿主发出的信号线索（如体温和气味分子）来定位人类宿主（Bryant 等，2018, 2022；Castelletto 等，2014；Ekobol 等，2025；Gang 等，2020；Lopez 等，2000；Safer 等，2007）。当 iL3 释放富含蛋白酶的分泌产物并穿透宿主皮肤时，寄生生命周期开始（Czeresnia 和 Weiss，2022；Dishnica 等，2023；Gomez Gallego 等，2005；Hunt 等，2016；McKerrow 等，1990；Moser 和 Hallem，2024）。然后 iL3 重新开始发育，这一过程称为激活，并通过宿主的循环系统和呼吸系统迁移，最终在小肠隐窝中定殖为单性生殖的成年雌性寄生虫（Buonfrate 等，2023）。这些成年雌性的后代可以：1）发育成再次感染同一宿主的幼虫（称为自身感染）；2）以 L1 幼虫的形式通过粪便排出宿主体外并直接发育成 iL3；和/或 3）离开宿主体外，经历一个由可进行有性繁殖的成年雄性和雌性组成的自由生活世代，其后代全部发育成 iL3（图1A）。

**图1**
S. stercoralis 的独特生命周期允许将外源 DNA 导入自由生活的成年雌性体内。（A）S. stercoralis 具有宿主体内和环境中的生命阶段。发育受阻的土壤中的第三期感染性幼虫（iL3）是唯一的感染阶段（由黄色危险符号表示）。iL3 穿透皮肤，通过真皮组织迁移，并重新开始发育（“激活”为 iL3as）（Buonfrate 等，2023）。在宿主体内，这些蠕虫通过血液和呼吸系统循环，最终在小肠中成为单性生殖的成年雌性。成年寄生虫产卵，这些卵孵化成 L1 幼虫，其中一些通过粪便排入环境。这些 F1 幼虫（称为后寄生 L1）可以直接发育成 iL3（左侧；灰色箭头），或者发育成自由生活的成年雄性和雌性（右侧；棕色箭头）。自由生活的成年个体在环境中进行有性繁殖，它们的所有后代都发育成 iL3（右侧）。此外，一些成年寄生虫的后代不会离开宿主体内，而是发育成自身感染的幼虫（aL3），在同一个宿主体内完成生命周期（白色箭头）（Buonfrate 等，2023）。L1-L4 = 第一至第四期幼虫阶段。（B）S. stercoralis 的自由生活成年个体的合胞生殖腺（深蓝色）可以通过微注射外源 DNA 来生成转基因或突变 iL3 后代，这使得 S. stercoralis 非常适合进行分子遗传操作（Castelletto 和 Hallem，2021；Junio 等，2008；Li 等，2006；Shao 等，2017）。

S. stercoralis 的自由生活成年个体可以使用从自由生活模型线虫 Caenorhabditis elegans 中改编的技术进行转基因和定向突变（图1B）（Castelletto 等，2020；Mendez 等，2022）。这些方法得益于 S. stercoralis 基因组的测序和注释，以及高质量 RNA 测序数据集的生成（Howe 等，2017；Hunt 等，2018, 2016, 2017）。在这里，我们回顾了 S. stercoralis 中转基因和定向突变技术的发展。我们还讨论了最近的技术进步如何使得首个稳定的转基因和敲除系 S. stercoralis 的生成成为可能（Banerjee 等，2025a；Patel 等，2025, 2024），从而极大地促进了这些寄生虫的基因功能研究。

**Caenorhabditis elegans 作为 S. stercoralis 的比较模型**
作为一种成熟的遗传模型系统，自由生活的线虫 Caenorhabditis elegans 为理解 S. stercoralis 和其他寄生线虫的生物学提供了强有力的起点。例如，在 C. elegans 中，通过胰岛素受体 Dauer Formation-2（DAF-2）进行的胰岛素信号调节进入和退出 dauer 幼虫阶段的过程，dauer 幼虫阶段是一种发育受阻的第三期幼虫阶段，与寄生线虫的 iL3 阶段同源（Hu，2007；Viney 等，2005）。S. stercoralis 有一个 daf-2 同源物， Aptazyme 干扰 Sst-DAF-2 会阻碍 iL3 在类似宿主条件下的发育恢复（Zhang 等，2025）。因此，胰岛素信号在 C. elegans 和 S. stercoralis 中都调节幼虫发育。同样，C. elegans 和 S. stercoralis 中的二氧化碳（CO2）检测都需要受体 guanylate cyclase GCY-9（一种假设的 CO2 受体）和 BAG 感觉神经元（因其袋状树突末端而得名）（Banerjee 等，2025a；Hallem 等，2011；Smith 等，2013）。然而，需要注意的是，C. elegans 和 S. stercoralis 是来自不同线虫支系的远缘物种，C. elegans 和 S. stercoralis 之间的基因通常没有一一对应关系（Ahmed 等，2022；Blaxter 等，2016，1998）。例如，astacin 基族锌金属蛋白酶同时存在于 C. elegans 和 S. stercoralis 中；然而，C. elegans 有40种 astacins，而 S. stercoralis 有超过200种（Hunt 等，2016，2017；M?hrlen 等，2003；Moser 和 Hallem，2024；Park 等，2010）。S. stercoralis 中 astacin 基族的扩展表明这些蛋白质在线虫寄生中起着重要作用（Hunt 等，2016，2017；Moser 和 Hallem，2024），并突显了完全依赖 C. elegans 来研究寄生线虫的局限性。直接研究寄生线虫对于揭示它们成功寄生于人类宿主的特定分子和细胞适应机制至关重要。

幸运的是，许多用于构建转基因和突变线虫的分子遗传工具最初是在 C. elegans 中开发的，已被证明也适用于 S. stercoralis。在 C. elegans 中，可以通过将外源 DNA 注射到年轻成年雌性的合胞生殖腺中来生成转基因和敲除系，然后该 DNA 被吸收到发育中的卵细胞中（Evans，2006；Kim 等，2022）。在转基因的情况下，线性 DNA 和质粒 DNA 都可以整合到 F1 后代的染色体外阵列中，并遗传给后代（Evans，2006）。在 CRISPR 干扰基因组编辑的情况下，编码单导向 RNA 和 Cas9 内切酶的 DNA 质粒或由 Cas9 蛋白和单导向 RNA 组成的核糖核蛋白复合物被引入成年雌性中，以在 F1 后代中产生可遗传的突变（Kim 等，2022）。如果没有修复模板，Cas9 引导的双链断裂会通过非同源末端连接进行修复，通常会导致小的插入缺失，从而破坏基因功能。然而，如果微注射混合物中包含含有修复模板的 DNA，则双链断裂可以通过同源定向修复精确修复，从而使 DNA 序列被整合（Kim 等，2022）。CRISPR 干扰基因组编辑的用途包括破坏或编辑基因、内源性标记基因以及通过靶向整合将转基因插入基因组（Dickinson 和 Goldstein，2016；El Mouridi 等，2022；Kim 等，2022）。

**S. stercoralis 的转基因**
与 C. elegans 成年个体一样，S. stercoralis 的自由生活成年个体也有合胞生殖腺；因此，可以使用从 C. elegans 中改编的技术通过 intragonadal 微注射引入外源 DNA（图2A）（Castelletto 和 Hallem，2021；Junio 等，2008；Li 等，2006；Shao 等，2017）。通过 intragonadal 微注射生成转基因在缺乏自由生活（因此难以接触）成年阶段的寄生线虫（如钩虫）中尚未实现。然而，通过 intragonadal 微注射实现的可遗传转基因已成功应用于大鼠寄生线虫 Strongyloides ratti 和负鼠寄生线虫 Parastrongyloides trichosuri，这两种线虫的生命周期都包含类似 S. stercoralis 的自由生活成年阶段（Grant 等，2006；Li 等，2011；Lok，2012；Lok 等，2017；Shao 等，2012）。成功的转基因需要使用内源性启动子和调控元件（Junio 等，2008；Li 等，2006），并且通过优化转基因的密码子可以提高转基因效率（Bryant 和 Hallem，2021；Patel 等，2024）。值得注意的是，手动处理 S. stercoralis 基因对于确保适当的转基因设计也非常重要（Bryant 等，2024）。

**图2**
生成 S. stercoralis 转基因和敲除稳定系的方法。类似的方法也可以用于生成稳定的转基因和敲除系，主要区别在于微注射到自由生活成年生殖腺中的质粒混合物。（A）为了生成稳定的转基因系，微注射混合物包含以下成分：一个包含转基因的载体，该载体两侧有反向末端重复序列（ITRs），以及一个高活性的 piggyBac 转座酶（hyPBase）表达载体。同时注射这两种质粒载体将使转基因以半随机的方式通过 hyPBase 整合到基因组中的 5′-TTAA-3′ 识别位点（Patel 等，2024；Sandoval-Villegas 等，2021；Yusa，2015；Yusa 等，2011）。转基因F1后代从粪便-木炭平板中收集，并在进行体外激活之前筛选转基因的表达情况。激活后的iL3通过口腔灌胃的方式接种到沙鼠体内。一旦沙鼠怀孕，就收集其粪便并混合到粪便-木炭平板中。然后分离F2/F3代的iL3，筛选转基因的表达情况，并在体外进行激活。这些激活后的iL3再次通过灌胃方式接种到新的沙鼠体内，以建立并维持稳定的转基因S. stercoralis品系（Patel等人，2024年）。(B) 一种表达Sst-act-2p::strmScarlet-I转基因的转基因S. stercoralis寄生成虫，该基因驱动mScarlet-I在体壁肌肉中的表达。比例尺 = 100 μm。图来自Patel等人，2024年。(C) Sst-act-2p::strmScarlet-I转基因品系已被用于观察iL3在皮肤上的行为。图像显示了一条Sst-act-2p::strmScarlet-I iL3，其头部正在推动皮肤表面。箭头指示虫体的头部。由于iL3正在主动推动皮肤，虫体的头部在插图中放大且模糊不清。比例尺 = 100 μm；插图放大了4倍。图来自Patel等人，2025年。(D) 为了生成稳定的敲除品系，显微注射混合物包含以下成分：一种编码针对特定CRISPR位点的引导RNA的质粒；Cas9内切酶表达载体；以及两种同源导向修复（HDR）构建体之一，其中包含Sst-act-2p::strmScarlet-I或Sst-act-2p::strGFP报告基因，后者可在体壁肌肉中驱动红色或绿色荧光（或者，这些报告基因可以与驱动蓝色荧光的报告基因结合使用）(Banerjee等人，2025a, 2025b；Patel等人，2025)。含有红色HDR构建体或绿色HDR构建体的质粒分别注射到不同的自由生活雌性群体中。生成稳定敲除品系的过程与生成稳定转基因品系类似，不同之处在于收集具有红色或绿色荧光的F1代iL3，将它们混合、激活，然后通过口腔灌胃到同一沙鼠体内。该沙鼠产生的自由生活红色或绿色F2后代将在粪便-木炭平板上交配，产生同时具有红色和绿色的F3代iL3；这些F3代iL3是纯合敲除体，红色荧光蛋白整合到目标基因的一个等位基因中，绿色荧光蛋白整合到另一个等位基因中。(E) 一种含有酪氨酸羟化酶基因Sst-cat-2纯合破坏的S. stercoralis iL3，该基因参与多巴胺的生物合成。这种iL3的一个等位基因中整合了Sst-act-2p::strmScarlet-I转基因，另一个等位基因中整合了Sst-act-2p::strGFP转基因，因此在整个体壁肌肉中观察到红色和绿色荧光。比例尺 = 100 μm。图像来自Patel等人，2025年。(F) 一个例子展示了如何利用敲除iL3来了解行为的分子基础。图表显示了皮肤穿透行为实验的结果，其中将iL3放置在人类皮肤上，并记录其行为，随后进行分析。Sst-cat-2-/- iL3在穿透人类皮肤的能力方面有缺陷：对照组约80%的iL3在10分钟内穿透皮肤，而Sst-cat-2-/- iL3中只有约20%能够穿透。这些结果表明多巴胺信号在驱动皮肤穿透行为中起着关键作用。每个基因型有15条iL3。p = 0.0007，双尾Fisher精确检验。图表来自Patel等人，2025年。对于B、C和E，“str”表示荧光蛋白基因已针对Strongyloides物种进行了密码子优化(Banerjee等人，2025a, 2025b；Patel等人，2025)。A和D中的示意图改编自Patel等人，2024年和Banerjee等人，2025b (Patel等人，2024；Banerjee等人，2025b)。虽然秀丽隐杆线虫(C. elegans)可以从世代间通过外染色体阵列表达转基因(Evans，2006)，但S. stercoralis不具备这一特性。在Strongyloides中，外染色体阵列在F1代后会被沉默(Junio等人，2008；Lok，2013；Shao等人，2012)。因此，在Strongyloides中实现可遗传表达需要将转基因整合到基因组中。这可以通过使用piggyBac系统来实现(Lok，2013，2012；Shao等人，2012，2017)。piggyBac转座酶最初来源于卷心菜菜蛾Trichoplusia ni(Yusa，2015)，它通过切除两侧带有反向末端重复序列(ITRs)的DNA片段，并将它们整合到含有TTAA基序的基因组位点来实现染色体整合(Sandoval-Villegas等人，2021)。使用piggyBac系统整合转基因时，需要同时注射两种质粒：一种质粒编码带有ITRs的转基因，另一种质粒编码piggyBac转座酶。piggyBac系统的优点包括能够整合超过100 kb的大转座子以及高拷贝数的转基因，从而实现稳定的转基因表达(Sandoval-Villegas等人，2021)。在S. ratti中，转基因拷贝数估计为每个基因组约30-50个(Shao等人，2012)。直到最近，即使使用piggyBac，也只能在S. ratti中生成可以无限世代维持的稳定转基因品系，而在S. stercoralis中则无法实现(Lok，2012)。这是因为维持S. stercoralis需要将感染性幼虫通过实验室宿主（如蒙古沙鼠(Meriones unguiculatus)传递，并且每只沙鼠需要皮下注射1,000-2,000条iL3才能建立感染(Nolan等人，1993)。S. stercoralis的转基因率相对较低（通常，转基因幼虫占F1代iL3群体的不到5%），这使得生成约1,000条转基因F1代iL3变得不切实际(Castelletto和Hallem，2021)。在一项研究中，虽然收集到了足够的转基因S. stercoralis F1代iL3并成功感染了一只沙鼠，但在F2代中只获得了两条转基因幼虫，因此无法进一步进行宿主传递(Lok，2012)。因此，对S. stercoralis的转基因研究受限于少量的转基因F1代iL3。最近克服了这些限制，首次生成了稳定的S. stercoralis转基因品系(图2A)(Patel等人，2024)。通过几项对原始转基因协议的修改实现了稳定的转基因：1) 使用了高活性的piggyBac转座酶hyPBase进行基因组整合，因为发现hyPBase在哺乳动物细胞中的整合率大约高出9倍(Yusa等人，2011)；2) hyPBase转基因已针对S. stercoralis进行了密码子优化；3) 转基因iL3经过体外激活，即让iL3暴露在类似宿主的环境中以促使它们在宿主体外开始发育(Gang等人，2020；Stoltzfus等人，2014，2012)；4) 通过口腔灌胃而不是皮下注射将iL3引入沙鼠体内(Patel等人，2024)。随后从沙鼠粪便中分离出转基因幼虫(Patel等人，2024)。通过口腔灌胃将激活后的iL3接种到沙鼠体内，可将建立感染所需的幼虫数量从约1,000条减少到约100条，从而更容易通过腹腔内显微注射获得足够数量的转基因幼虫(Patel等人，2024)。利用这种方法，可以在沙鼠中世代繁殖具有稳定转基因表型的转基因S. stercoralis。生成稳定转基因品系带来了许多实验优势，包括能够无限世代地在沙鼠宿主体内繁殖转基因幼虫、减少镶嵌表达模式，以及能够生成任何生命阶段的转基因幼虫的大数量(图2B)(Patel等人，2024)。转基因S. stercoralis被广泛用于许多不同的研究。表达转录报告构建体的S. stercoralis iL3利用内源性启动子序列驱动荧光蛋白基因的表达，已被用于在多种情况下研究基因表达模式(Banerjee等人，2025a；Bryant等人，2018，2022；Castelletto等人，2009；Cheong等人，2021；Lok，2012；Patel等人，2025，2024；Stoltzfus等人，2012；Zhou等人，2023)。转基因S. stercoralis还被用于通过表达显性负等位基因来研究基因功能(Castelletto等人，2009)，以及最近利用核酸酶来生成条件性基因敲降(Zhang等人，2025)。转基因技术还被用于针对特定神经元亚群进行研究，包括结合定量行为分析的神经元沉默(Banerjee等人，2025a；Bryant等人，2022；Patel等人，2025)和神经活动的体内钙成像(Banerjee等人，2025a；Bryant等人，2022)。最后，表达体壁肌肉中荧光蛋白mScarlet-I的稳定转基因品系对于研究皮肤穿透至关重要，因为这使得通常透明的蠕虫能够在皮肤表面上被可视化(图2C)(Abell等人，2025；Patel等人，2025)。尽管使用piggyBac系统生成转基因品系简单高效，但这种方法也有几个缺点。首先，piggyBac的整合是半随机的，可能会造成意外的基因破坏(Sandoval-Villegas等人，2021；Yusa，2015)。此外，整合到基因组中的转基因拷贝数无法控制，因此无法模拟内源性表达水平(Sandoval-Villegas等人，2021；Yusa，2015)。最后，由于转基因以高拷贝数整合，很难在每个整合位点都使转基因成为纯合子，从而获得真正的纯合品系。因此，维持稳定的转基因品系需要定期选择亮度较高的转基因个体，以确保非转基因或低表达的蠕虫在连续的宿主传递过程中不会增加频率。下面描述的CRISPR/Cas9介导的基因组整合提供了一个强大的替代方法，适用于需要较低拷贝数或可接受较低转基因表达的情况。S. stercoralis也适用于使用相同的腹腔内显微注射技术进行CRISPR/Cas9介导的目标 mutagenesis(Gang等人，2017；Lok等人，2017)。通常，将编码目标基因的单一引导RNA、Cas9内切酶以及编码荧光报告基因的同源定向修复(HDR)模板的质粒注射到自由生活雌性的合胞生殖腺中；随后可以在F1代中找到纯合iL3(Banerjee等人，2025a；Bryant等人，2018，2022；Cheong等人，2021；Gang等人，2017，2020)。在S. stercoralis和C. elegans中，导致有效编辑的Cas9靶点相同(Banerjee等人，2025b；Farboud，2017)，使得靶点选择变得简单。在注射雌性的F1代后代中，可以根据荧光标记物的表达来识别候选突变体，然后通过单条蠕虫PCR基因分型来识别纯合突变体(Gang等人，2017)。CRISPR诱导的突变也可以通过将CRISPR组件作为核糖核蛋白复合物(RNP)注射来实现(Adams等人，2019；Gang等人，2017)；然而，在某些情况下，使用质粒而不是RNP时，同源定向修复似乎更有效(Gang等人，2017)。此外，不需要包含同源定向修复模板；但是，在没有修复模板的情况下，观察到了大范围的删除而不是小的插入删除(Gang等人，2017)。在这些早期的CRISPR研究中，并未生成稳定的突变品系。相反，对注射雌性的F1代iL3后代进行荧光报告基因的表达筛选，然后通过单条蠕虫显微镜检查或行为分析，并事后进行基因分型以识别纯合敲除体(Banerjee等人，2025a；Bryant等人，2018，2022；Cheong等人，2021；Gang等人，2017，2020)。这种方法耗时且劳动密集，因为大多数候选突变体不是纯合敲除体——有些是突变体的杂合子，有些是镶嵌体，还有一些是野生型但表达来自外染色体阵列的荧光报告基因。从每次显微注射实验中只能获得少数纯合敲除体，因此需要多次重复CRISPR流程才能获得足够的样本量。最近，开发了一种方法来生成第一个稳定的敲除品系(图2D)(Banerjee等人，2025a，2025b；Patel等人，2025)，该方法是对生成稳定转基因品系方法的改进(Patel等人，2024)。为了创建稳定的基因敲除品系，需要并行地对两组自由生活的雌性寄生虫进行显微注射：一组注射含有红色荧光蛋白的HDR构建体的混合物，另一组注射含有绿色荧光蛋白的HDR构建体的混合物（或者可以用蓝色荧光蛋白替代红色或绿色荧光蛋白）。从这两组雌性寄生虫中产生的F1代iL3后代会经过 screening，以检测其是否具有红色或绿色荧光特性，随后将这些具有特定荧光特性的iL3个体合并在一起。采用与创建稳定转基因品系相同的方法（Patel等人，2024年），这些红色或绿色的iL3个体在体外被激活并合并后，通过口服喂食的方式引入沙鼠体内。当沙鼠怀孕后，它将产下F2代后代，其中一些会发育成具有红色或绿色荧光特性的自由生活成虫。这些自由生活的成虫会通过交配产生带有红色/绿色双色荧光特性的F3代iL3个体。这些双色iL3个体是纯合子，其中一个等位基因中整合了红色荧光蛋白，另一个等位基因中整合了绿色荧光蛋白（图2E）。值得注意的是，由于在S. stercoralis中F1代之后染色体外扩增区域会被沉默，因此后续世代的所有荧光表现都来自整合的转基因片段，因此所有的红色/绿色蠕虫都是纯合子敲除体。这些纯合子可以通过在沙鼠体内连续传代来繁殖（图2D）。另外，在某些情况下，如果纯合子表现出感染缺陷，也可以通过将红色自由生活的雌性与绿色自由生活的雄性进行交配来获得纯合子（Banerjee等人，2025b；Patel等人，2025年）。

利用这种方法可以大量获得任何生命阶段的纯合子突变体。最近，这一方法被用来证明受体鸟苷酸环化酶基因Sst-gcy-9在调节CO2响应中的作用（Banerjee等人，2025a），以及酪氨酸羟化酶基因Sst-cat-2在驱动皮肤穿透行为中的作用（图2E、F）（Patel等人，2025年）。现在应该可以利用这种方法研究S. stercoralis中的几乎所有非致死性基因。

**结论与未来发展方向**
能够创建稳定的转基因和敲除品系极大地加速了对这些寄生虫的机制研究。然而，未来仍有几个重要的技术发展方向：首先，S. stercoralis目前还不能脱离动物宿主进行培养，而宿主传代既昂贵又耗时。一个体外培养系统对于低成本维持稳定的敲除和转基因品系将非常宝贵。其次，尽管现在大多数基因都可以通过CRISPR进行突变诱导，但适用于S. stercoralis富AT基因组的最佳Cas9靶点（包括5′-GN(17)GG-3′ consensus序列和5′-NGG-3′ protospacer motif，PAM）数量有限（Banerjee等人，2025b；Farboud，2017；Farboud和Meyer，2015）。因此，使用更偏好富AT序列的其他Cas蛋白（如Cas12蛋白，Yang等人，2024年）可能会提高S. stercoralis的基因组编辑效率。此外，引入其他CRISPR/Cas系统以激活或抑制转录、编辑RNA序列或改变RNA水平（Knott和Doudna，2018）将进一步扩展S. stercoralis的分子遗传学工具箱。其他用于条件性抑制基因功能的方法（如生长素诱导的降解系统，Ashley等人，2021；Zhang等人，2015）也将非常有用，尤其是在基因敲除会导致死亡的情境中。第三，像Cre/Lox（Flavell等人，2013）、Q（Monsalve等人，2019）和Split cGAL（Wang等人，2017）这样的双部分表达系统将有助于精确、可诱导地针对特定细胞或细胞亚群进行基因修饰。这些方法应该可以很容易地应用于S. stercoralis，使用现有的转基因或CRISPR编辑技术。第四，开发新的转录报告基因作为CRISPR突变的标记物，将使得通过依次引入多个突变来生成双重和三重敲除品系变得简单。第五，识别S. stercoralis基因组中的安全位点将使得能够使用CRISPR进行特异性、靶向的转基因整合，而不会干扰相邻基因或导致基因拷贝数失控；这种方法在C. elegans中已被常规使用（El Mouridi等人，2022；Malaiwong等人，2023；Yoshina等人，2016）。最后，随着越来越多的S. stercoralis稳定转基因和敲除品系的产生，高效的冷冻保存方案将变得至关重要，因为目前在沙鼠体内维持这些品系成本高昂且劳动密集。对于一些寄生线虫（包括钩虫，Li等人，2023；Vacca等人，2024）已经存在冷冻保存方案，这些方案也可能适用于S. stercoralis。将这些方法加入到S. stercoralis的研究工具箱中，将大大促进对寄生线虫如何寻找、侵入和感染人类宿主的分子和细胞机制的研究。