《Frontiers in Microbiology》：Recent advances in rapid multiplex detection of nucleic acid markers using RPA and CRISPR-Cas
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重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR-Cas系统的整合已成为一种强大的快速多重核酸检测平台。与定量聚合酶链式反应（qPCR）和新一代测序（NGS）相比，RPA-CRISPR可在等温（37 °C–42 °C）条件下运行，所需设备最少，并可通过附带切割在20–
重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR-Cas系统的整合已成为一种强大的快速多重核酸检测平台。与定量聚合酶链式反应（qPCR）和新一代测序（NGS）相比，RPA-CRISPR可在等温（37 °C–42 °C）条件下运行，所需设备最少，并可通过附带切割在20–90分钟内达到阿摩尔级灵敏度。最近的多重策略，即两管法、空间分离的单管法以及均相一锅法，已克服串扰问题，并能够在复杂的食品基质（如禽肉、牛奶和生菜）中实现高度多重检测。这些方法特别适用于食源性病原体筛查（例如，沙门氏菌、李斯特菌）、抗菌素耐药性分析和现场监测，符合食品微生物诊断前沿研究的范畴。尽管取得了进展，但在标准化、基质抑制和监管审批方面仍然存在挑战。本篇综述总结了RPA-CRISPR多重检测领域的最新进展（2020–2025年），概述了其临床实施和食品安全部署的未来方向，并为这些领域实际应用的后续研究提供了指导。
论文主体内容总结
1. 引言
现代食品安全监测和应用微生物学的基石性挑战之一是微生物病原体的快速可靠检测。每年全球估计有约9380万例食源性疾病发生，造成经济损失超过1100亿美元。食源性疫情已成为系统性威胁，其中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌和致病性大肠杆菌是最常涉及的病原体。随着农业和贸易的全球化，传统的监测方法已显滞后。培养法作为病原体鉴定的“金标准”，耗时长达3-7天。分子诊断如定量聚合酶链式反应（qPCR）尽管灵敏度高，但依赖于热循环仪和受控实验室环境，限制了其在现场的应用。下一代测序（NGS）尽管功能强大，但成本高昂且计算密集，不适合大规模常规筛查。等温核酸扩增技术填补了便携性空白，其中重组酶聚合酶扩增（RPA）因其快速动力学反应而脱颖而出，可在37 °C–42 °C下10–20分钟内完成，设备需求极简。然而，RPA单独使用缺乏多重检测所需的特异性，非特异性扩增可能导致假阳性。CRISPR-Cas系统为此提供了变革性解决方案，其具有附带切割活性，可将靶标识别转化为可测量信号。将RPA与CRISPR结合可创建协同工作流程：RPA等温扩增靶标核酸，CRISPR通过gRNA引导的切割和报告分子激活验证特异性。这种结合解决了RPA的速度和便携性，以及CRISPR无与伦比的特异性这两个关键问题。食品基质很少只被单一病原体污染，传统多重检测方法面临引物干扰和信号重叠等限制。基于CRISPR的系统在这方面表现出色，正交核酸酶和光谱不同的报告分子可消除串扰。RPA-CRISPR的另一个优点是对食品基质抑制剂的耐受性。鉴于这些特性，多重RPA-CRISPR有望成为食品微生物学的新一代工具。
2. 多重RPA-CRISPR检测的工程策略
多重RPA-CRISPR检测面临三个相互关联的挑战：首先是扩增竞争，多个引物对竞争有限的酶资源，降低了低丰度靶标的检测效率；其次是引物干扰，引物形成二聚体或结合脱靶序列，增加假阳性；第三是报告分子串扰。目前主要有多重策略，每种策略在集成度、复杂性和性能之间取得平衡。
2.1 两管法顺序工作流程
两管法策略将RPA扩增和CRISPR检测分离到不同的容器中进行。在第一管中，RPA在优化条件下同时扩增所有靶标核酸。然后将扩增产物转移至含有CRISPR试剂的第二管中进行孵育以触发切割。两管法可以实现每个步骤的独立优化，以获得最佳性能，并减少抑制剂干扰，因为食品基质对CRISPR酶的抑制通常比RPA聚合酶更强。自动化可以解决两管法工作流程的主要限制，即手动样品转移带来的污染风险。然而，两管法工作流程需要精确的移液和转移步骤，增加了手动操作时间，并且存在扩增子残留污染的风险。
2.2 空间分离的单管系统
空间分离策略将扩增和检测保留在单一设备中，但利用物理屏障（如微流控腔室、离心芯片）来隔离反应。例如，离心芯片可能包含用于RPA的“样品室”、用于CRISPR的“反应通道”以及用于光学读出的“检测窗”，疏水阀控制流体流动。在离心过程中，RPA试剂在样品室中混合，扩增产物通过毛细作用力或离心力被迫进入反应通道。阀门按顺序打开以引入CRISPR试剂，确保扩增先于检测。这种架构平衡了集成度和特异性。增加隔室可以在不增加设备体积的情况下检测更多靶标，提高了可扩展性。跳过手动转移步骤可以减少污染。这些设备通常是密封且一次性的，可与手持式读卡器配合使用，非常适合现场应用。然而，微加工增加了成本，并且阀门定时必须精确以避免过早混合。
2.3 均相一锅法系统
一锅法检测在单一反应混合物中同时进行RPA和CRISPR反应，最大化集成度并最大限度地减少操作步骤。所有试剂在开始时混合，扩增和检测顺序发生（先RPA，后CRISPR激活）。正交核酸酶的使用有助于避免交叉反应性，例如Cas12a、Cas12b和Cas13a。优化后的一锅法反应在灵敏度上可与两管法相媲美，通过省略转移步骤，该方法对操作者技术要求低，成本也因消耗品使用减少而降低，并且易于扩展到96孔板进行批量测试。然而，扩增竞争是一个障碍，因为高浓度的优势引物组会排挤其他引物，从而限制稀有靶标的检测。报告分子串扰是另一个问题，激活的Cas12a可能会切割用于Cas13a靶标的报告分子。解决方法包括使用酶靶向阻断剂或通过化学修饰增强报告分子的稳定性。
3. 在食品安全和临床诊断中的应用
多重RPA-CRISPR平台已在多种食品基质中得到验证，并进一步应用于临床诊断。
3.1 主要食源性病原体的检测
禽肉是沙门氏菌和弯曲杆菌的主要储存库。有研究开发了多重RPA-CRISPR检测方法，用于在鸡肉组织中同时检测沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌，该方法采用一锅法反应方案，结合Cas12a和Cas13a以及侧向流试纸条进行光学结果评估，显示出比定量PCR更高的灵敏度和特异性。生牛奶和奶酪是单核细胞增生李斯特菌和高风险基质。有研究采用空间分离的微流控芯片检测巴氏杀菌奶中的这些病原体，芯片上的疏水阀确保RPA在CRISPR检测之前进行，并加入了MnO2纳米片以吸附抑制性蛋白质，从而提高了扩增效率。该方法能够检测符合欧盟监管限值的病原体水平。还有研究开发了LM-RPA-Cas12a-LFA检测方法，结合适配体功能化磁珠富集靶标，在复杂食品基质中将检测限降低至1.35 CFU/mL，显示出优异的重复性和稳定性。
3.2 监测抗菌素耐药性基因
抗菌素耐药性（AMR）是食源性病原体中日益增长的威胁。多重RPA-CRISPR能够同时检测病原体和AMR基因。有研究开发了一种一锅法检测猪肉中沙门氏菌以及blaNDM-1和mcr-1基因的检测方法，使用了Cas12a和两种Cas13a酶，以及不同荧光标记的报告分子。加标样品的检测显示出对两种基因的高灵敏度。该平台有助于监管机构跟踪AMR从牲畜到人类的传播。
3.3 便携式和即时检测平台
现场部署需要小型化和用户友好性。研究人员已将RPA-CRISPR与手持式荧光检测器集成。有研究使用手掌大小的设备检测鸡粪中的沙门氏菌，该设备通过光纤读取荧光，结果在触摸屏上显示。便携式即时检测平台促进了“样本进，结果出”的分析。其中一个系统采用离心微流控技术，在单个芯片内整合了磁珠核酸提取、重组酶辅助扩增和CRISPR/Cas13a检测，能够在45分钟内对多种样本进行多重病毒识别。电化学传感器平台，例如微流控电化学RPA-CRISPR生物传感器，能够快速、灵敏、同时地检测复杂基质中的食源性病原体，检测限低至3 CFU/mL，检测时间在65分钟内，为现场食品安全监测提供了实用工具。
4. 讨论
尽管RPA-CRISPR检测在快速检测食源性病原体方面前景广阔，但在多重检测、基质干扰和监管方面仍面临显著障碍。
4.1 技术挑战
在多重RPA中，靶向高丰度序列的引物可能会在竞争中胜过靶向低丰度靶标的引物，从而降低检测灵敏度。可以通过数学模型优化引物浓度来解决此问题。另一种方法是Cas辅助扩增，但增加了实验复杂性。激活的Cas12a可能会无意中切割用于Cas13a靶标的报告分子。缓解此类脱靶活性的策略包括添加核酸酶特异性抑制剂，或设计具有与非靶标核酸酶不匹配序列的报告分子。高浓度的脂质、蛋白质和酚类化合物仍可能抑制RPA-CRISPR反应。先进的样品制备策略已被开发以减轻这些影响，例如使用纳米材料增强剂或使用适配体功能化磁珠进行选择性病原体捕获。
4.2 监管验证
诊断方法必须证明可重复性和稳健性才能获得监管批准。国际框架如ISO 16140和AOAC国际官方方法有具体的样品测试要求。目前很少有RPA-CRISPR检测完成全面验证，大多数平台仍处于研究阶段，尚未获得正式的ISO 16140认证。
4.3 未来方向
具有改进正交性的新型CRISPR核酸酶将扩展多重检测能力。例如，Cas14和Cas12f可实现更小的反应体积和每个检测中更多的靶标。机器学习越来越多地用于优化CRISPR引导RNA设计。深度学习模型可以提高CRISPR基RNA靶向系统的特异性。芯片实验室设备将实现“样本到结果”工作流程的自动化。机器学习算法将简化数据解释，特别是对于复杂的多重信号。未来的诊断芯片有望集成全自动的“样本进-结果出”功能，允许用户只需引入食品匀浆，设备即可在无需人工干预的情况下完成核酸提取、扩增和CRISPR检测。同时，生物传感器集成的持续发展可能实现在单一检测中真正的多分析物检测。
5. 结论
多重RPA-CRISPR系统代表了食品微生物学的范式转变：它们将等温扩增的速度和便携性与CRISPR的特异性相结合，能够在复杂基质中快速、灵敏、多重地检测食源性病原体。工程技术创新，包括两管法工作流程、空间分离和均相一锅法系统，解决了扩增竞争、引物干扰和报告分子串扰等关键挑战。在禽肉、乳制品、海鲜和农产品等领域的应用证明了其实际效用。在技术领域、监管验证和成本等实际因素方面仍然存在关键障碍。然而，酶工程、微流控和机器学习的进展有望克服这些障碍。经过适当的验证和监管批准，多重RPA-CRISPR可能成为全球食品安全监测的支柱，实现疫情的早期检测、针对性召回和积极的公共卫生保护。随着食品供应链日益复杂，这些工具将确保快速检测与快速分销的速度相匹配，这是实现更安全、更具韧性的食品系统和临床路径实施的关键要求。最终，它可以为实施“One Health”提供重要的监测和保护。
