《Frontiers in Immunology》：Integrating biocomputational techniques for vaccine development for glioblastoma multiforme: a possible way of enhancing precision
编辑推荐：
多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme, GBM）是成人中最具侵袭性的原发性脑肿瘤，尽管采用多模式治疗，其生存率仍然很低。肿瘤异质性、免疫逃逸和复发限制了当前治疗方法的有效性，因此需要新的治疗策略。基于疫苗的免疫疗法旨在诱导肿瘤特异
多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme, GBM）是成人中最具侵袭性的原发性脑肿瘤，尽管采用多模式治疗，其生存率仍然很低。肿瘤异质性、免疫逃逸和复发限制了当前治疗方法的有效性，因此需要新的治疗策略。基于疫苗的免疫疗法旨在诱导肿瘤特异性免疫反应，但一直受到抗原变异性和免疫抑制性肿瘤微环境的挑战。生物计算技术通过实现免疫原性表位和新抗原的精确鉴定，已经改变了疫苗开发的格局。反向疫苗学、免疫信息学和人工智能等方法促进了多表位和个性化疫苗的合理设计。多组学数据的整合进一步增强了靶点选择和治疗精准度。尽管取得了这些进展，预测准确性有限和转化障碍等挑战依然存在。总体而言，生物计算驱动的疫苗设计为GBM的精准免疫治疗和改善预后提供了一条有前景的途径。
本文旨在综述整合生物计算方法用于多形性胶质母细胞瘤疫苗开发，重点介绍当前进展、转化挑战以及未来机遇。
引言
GBM是成人中最具侵袭性和致命性的原发性脑肿瘤，其特点包括快速增殖、弥漫性浸润和显著的分子异质性。尽管神经外科技术、放疗和化疗有所进展，但预后依然很差，诊断后的中位生存期很少超过15-18个月。目前的护理标准是最大限度的安全手术切除，随后进行放疗和替莫唑胺化疗，但由于肿瘤固有的耐药性、复发以及高度免疫抑制性肿瘤微环境的存在，其生存获益有限。这些挑战凸显了迫切需要能够实现持久肿瘤控制的创新治疗策略。癌症疫苗是促进针对癌细胞肿瘤特异性免疫反应的有前景的免疫治疗策略。GBM疫苗方法聚焦于体细胞突变产生的患者特异性新抗原以及肿瘤相关抗原。然而，肿瘤异质性、抗原逃逸和宿主免疫反应变异性阻碍了传统疫苗开发的成功。鉴于GBM生物学的复杂性，需要更精确和定制的疫苗设计策略。生物计算技术的最新进展，包括免疫信息学、反向疫苗学、结构生物信息学、机器学习（ML）和多组学整合，已经改变了疫苗开发的格局。这些工具能够高通量地识别免疫原性表位、预测主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex, MHC）结合亲和力、评估抗原性和群体覆盖率，并进行免疫应答的计算机建模。通过整合基因组、转录组和蛋白质组数据，计算平台促进了针对每个肿瘤独特分子谱的个性化、多表位疫苗的合理设计。
方法
本综述是一项全面的叙述性综合，包含系统文献评估要素，以评估生物计算技术在GBM疫苗开发中的作用。该方法旨在确保跨肿瘤学、免疫学和计算生物学相关跨学科研究的透明性、可重复性和广泛覆盖。检索策略是跨多个电子数据库进行的，核心检索词包括“胶质母细胞瘤”、“疫苗”、“免疫治疗”、“新抗原”、“肿瘤抗原”、“免疫信息学”、“计算疫苗学”、“反向疫苗学”、“机器学习”、“人工智能”及其组合。纳入标准包括聚焦于GBM、研究基于疫苗的免疫疗法、纳入计算方法以及发表在同行评审的英文期刊上。排除标准包括非英文出版物、无完整数据的会议摘要以及与疫苗开发或计算方法无关的研究。所有检索记录均经过独立筛选，然后进行全文审查。提取相关数据进行定性综合，并对纳入的研究进行严格评估。
GBM的分子和免疫学特征
多形性胶质母细胞瘤（GBM）高度免疫抑制的肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）和显著的分子异质性使得治疗干预和疫苗开发充满挑战。在基因组层面，GBM显示出多种与致癌信号通路相关的改变，包括TP53突变、PTEN缺失、EGFR扩增和突变，以及PI3K/AKT/mTOR轴失调。GBM根据异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate Dehydrogenase, IDH）突变状态进一步分为生物学上不同的亚型。此外，烷化剂化疗的疗效受O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT）启动子甲基化的影响，说明了遗传学与治疗结果之间错综复杂的关系。推动克隆进化的瘤内和瘤间异质性增加了抗原变异性，严重阻碍了统一的疫苗靶向。除了遗传改变，GBM的免疫学特征以强大的免疫逃逸机制为标志。TME富含调节性T细胞（Regulatory T cells, Tregs）、肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages, TAMs）和髓源性抑制细胞（Myeloid-Derived Suppressor Cells, MDSCs），它们共同抑制细胞毒性T淋巴细胞活性。GBM细胞还上调免疫检查点分子如PD-L1，导致T细胞耗竭和抗肿瘤免疫受损。此外，免疫抑制细胞因子如TGF-β和IL-10的分泌抑制免疫活化并促进肿瘤进展。血脑屏障和有限的淋巴引流进一步限制了免疫细胞在中枢神经系统的运输和抗原呈递。理解这种复杂的分子和免疫学环境对于合理的疫苗设计是必要的。整合基因组突变、转录组表达谱和免疫浸润特征的生物计算技术为在GBM中寻找可行新抗原和克服免疫抵抗机制提供了一个框架。
GBM疫苗策略概述
基于疫苗的免疫疗法已成为应对GBM相关持久治疗挑战的一个引人注目的策略。与旨在直接破坏肿瘤细胞的细胞毒性疗法不同，癌症疫苗旨在利用和放大宿主免疫系统识别肿瘤特异性抗原并产生持久免疫记忆的能力。在由于浸润性生长和残留微小病变而复发几乎普遍存在的GBM中，疫苗提供了长期免疫监视的理论优势。在过去的二十年中，多种疫苗平台，包括基于肽的、基于树突状细胞的、基于核酸的以及个性化新抗原疫苗，已在临床前和临床环境中进行了评估。尽管有令人鼓舞的免疫原性信号，但临床结果并不一致。GBM生物学的复杂性，包括显著的瘤内和瘤间异质性、抗原逃逸以及中枢神经系统的免疫抑制，阻碍了一致的治疗成功。然而，早期试验的关键见解仍被用于指导下一代疫苗接种计划，特别是与多组学和计算技术相结合时。
肽疫苗
这是GBM中最受研究的免疫治疗方法之一。这些疫苗使用来源于肿瘤相关抗原（Tumor-Associated Antigens, TAAs）或肿瘤特异性突变的合成肽来引发细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte, CTL）反应。其中一个著名例子是Rindopepimut，它靶向EGFRvIII突变。然而，更大的临床试验揭示了局限性，包括在未选择的人群中缺乏显著的总体生存获益。一个主要挑战是抗原异质性和丢失，即肿瘤细胞在免疫压力下下调或消除靶向表位。此外，肽疫苗受到人类白细胞抗原（Human Leukocyte Antigen, HLA）特异性的限制，限制了广泛适用性。虽然它们相对安全、成本效益高且易于制造，但其临床疗效可能需要与免疫检查点抑制剂或佐剂联合以克服免疫耐受和耗竭。
树突状细胞疫苗
树突状细胞（Dendritic Cell, DC）疫苗提供了一种更个性化和免疫学上更全面的策略。在这种方法中，从患者体内提取自体DC，在体外负载肿瘤裂解物、肽或RNA，然后回输以刺激肿瘤特异性T细胞反应。与单一肽方法相比，DC疫苗可能通过展示多种肿瘤抗原来更有效地应对瘤内异质性。多项临床研究表明，接受DC疫苗的特定患者亚组，特别是在最大手术切除后给药的情况下，生存期得到延长。尽管结果令人鼓舞，但DC疫苗开发面临逻辑和生物学难题。生产过程是劳动密集型的，需要在严格的监管条件下进行个体化细胞处理，这使得成本更高、更复杂。DC的质量、抗原负载效率以及患者免疫系统的功能差异也会影响治疗反应。此外，GBM中的免疫抑制性TME可能会削弱活化T细胞的效果，强调了联合策略的必要性。
核酸疫苗
基于核酸的疫苗，如DNA和mRNA平台，是GBM免疫治疗中一个快速发展的研究领域。这些疫苗包含肿瘤抗原，并依赖宿主的细胞机制在体内产生蛋白质以引发免疫反应。mRNA疫苗因其不整合到基因组、安全性良好且可快速生产而特别有吸引力。它们允许在单个构建体中包含多个表位，从而可能增强免疫广度。此外，可以使用脂质纳米颗粒或DC靶向平台来递送mRNA疫苗，以改善抗原呈递。然而，需要解决的问题包括确保跨生物屏障的良好递送、保持抗原表达以及克服脑部的局部免疫抑制。持续改进递送系统和佐剂组合对于临床转化仍然至关重要。
个性化新抗原疫苗
个性化新抗原疫苗是基于通过新一代测序（NGS）确定的患者特异性体细胞突变而设计的。与共享的肿瘤相关抗原不同，新抗原仅出现在恶性细胞中，降低了中枢免疫耐受的风险并增加了肿瘤特异性。计算算法用于预测高亲和力的MHC结合表位，然后合成为肽、RNA或基于DC的疫苗制剂。早期临床研究表明，个性化疫苗可以引起强烈的CD4+和CD8+ T细胞反应，并可能帮助一些患者延长无进展生存期。但GBM的肿瘤突变负荷相对较低，这给寻找高免疫原性新抗原带来了挑战。此外，制备所需的时间和成本可能限制其广泛应用。为了使个性化的GBM疫苗开发更快、更准确，需要生物计算流程和实时测序技术的协同工作。
疫苗设计中的生物计算技术
生物计算技术的整合已经彻底改变了疫苗开发。传统疫苗发现严重依赖实验筛选，这在高度异质性的肿瘤中耗时、资源密集且通常效率低下。相比之下，计算方法能够系统地挖掘基因组、转录组和蛋白质组数据集，以识别具有高免疫原性潜力的候选抗原。通过结合免疫信息学、结构建模、系统生物学和人工智能，研究人员可以设计出针对肿瘤特异性分子谱的合理的、个性化疫苗构建体。
反向疫苗学
反向疫苗学使抗原发现发生了范式转变。这种方法从基因组和蛋白质组数据开始，而不是培养的病原体或肿瘤裂解物。通过分析全外显子组和RNA测序数据集，在GBM中寻找过表达、突变或肿瘤特异性的蛋白质，这些蛋白质可能是免疫原性靶点。计算筛选流程可消除与正常组织高度同源性的蛋白质，以减少脱靶自身免疫。反向疫苗学工作流程通常包括抗原筛选、亚细胞定位预测、跨膜结构域分析和表位作。在GBM中，可以使用突变数据库和表达谱分析来优先考虑如EGFRvIII或IDH1变体等肿瘤特异性突变。这种系统的高通量方法加速了候选物选择，减少了实验负担，使其特别适合于个性化疫苗设计。
免疫信息学方法
免疫信息学工具是基于表位的疫苗开发的核心。这些算法基于与MHC分子的结合亲和力预测T细胞和B细胞表位。MHC I类结合预测对于识别CD8+ CTL表位至关重要，而MHC II类预测则与CD4+辅助T细胞反应相关。高级算法使用在实验验证的结合数据集上训练的机器学习模型来提高预测准确性。除了MHC结合，计算工具还评估抗原性、过敏性、毒性和群体覆盖率。例如，表位保守性分析可确保特定肽在肿瘤亚克隆中保持稳定，从而降低抗原逃逸风险。群体覆盖率分析评估整个地理区域HLA等位基因的分布，以最大化疫苗的适用性。这些分层分析协同工作，可在实验室验证前改进表位选择。
新抗原鉴定
新抗原发现依赖于整合肿瘤-正常测序数据来识别非同义体细胞突变。变异调用流程过滤原始测序读数以检测高置信度的突变，然后将其翻译成突变的肽序列。这些候选新抗原经历计算评估，以确定其MHC结合亲和力和免疫原性潜力。在GBM中，相对于黑色素瘤或肺癌，其肿瘤突变负荷相对较低，这带来了独特的挑战。因此，结合DNA测序和RNA表达数据对于确保候选新抗原被主动转录至关重要。HLA分型算法通过使表位选择适应个体患者基因型，进一步个性化预测。这种以精准为导向的方法增加了产生具有临床意义的免疫反应的可能性。
结构生物信息学与分子建模
结构生物信息学通过评估表位与免疫受体之间的三维相互作用来加强疫苗设计。分子对接模拟模型肽-MHC结合构象，估计结合稳定性和相互作用能。这些模拟有助于验证免疫信息学预测并识别结构上有利的表位。分子动力学模拟通过评估生理条件下复合物随时间变化的稳定性，提供了进一步的见解。当实验结构不可用时，蛋白质结构预测工具能够对突变的肿瘤抗原进行建模。在多表位构建体中，结构验证可以指导接头选择并确保最佳表位呈递。免疫相关信号级联的途径富集分析进一步揭示了与特定抗原相关的信号通路。整合来自转录组去卷积算法的免疫浸润数据有助于优先考虑在免疫活跃的肿瘤区域表达的靶点。系统生物学框架通过描绘免疫成分和肿瘤细胞之间的相互作用，促进选择具有生物学相关性和治疗可行性的疫苗靶点。
系统生物学与网络分析
系统生物学方法将候选抗原置于更广泛的细胞网络背景中。蛋白质-蛋白质相互作用网络识别参与GBM发病机制的中心基因和关键信号节点。靶向中心网络组件可能通过同时破坏多种致癌通路来增强治疗效果。途径富集分析阐明了与特定抗原相关的免疫相关信号级联。结合转录组去卷积算法的免疫浸润数据有助于优先考虑在免疫活跃的肿瘤区域表达的靶点。系统生物学框架通过阐明肿瘤细胞和免疫成分之间的相互作用，促进识别具有生物学意义和治疗可行性的疫苗靶点。
机器学习与人工智能
机器学习（ML）和人工智能（AI）技术越来越多地应用于优化疫苗设计。监督学习模型基于序列特征、结合亲和力和结构参数预测表位免疫原性。深度学习算法通过识别大数据集中的非线性模式，提高了MHC结合预测和新抗原优先级排序的准确性。AI驱动的方法也促进了多组学数据的整合，包括基因组学、转录组学、蛋白质组学和单细胞测序。预测模型可以估计患者特定的疫苗反应概率，从而实现风险分层和精准免疫治疗规划。此外，正在探索强化学习框架，以基于模拟的免疫反应反馈迭代优化疫苗构建体。
多表位疫苗设计框架
多表位疫苗的开发代表了GBM免疫治疗的一种合理且高度靶向的策略。与单抗原疫苗不同，多表位构建体将源自肿瘤相关抗原和新抗原的多个免疫原性区域整合到一个平台中。这种方法增强了免疫覆盖范围，解决了肿瘤异质性问题，并降低了免疫逃逸的可能性。生物计算工具在设计这些疫苗中发挥着核心作用，能够在实验和临床评估之前实现表位的精确选择、优化和验证。
表位选择与优先级排序
精确鉴定免疫原性表位是多表位疫苗设计的基石。计算流程预测MHC I类和II类结合肽，分别保证激活CD8+ CTL和CD4+辅助T细胞。为防止自身免疫反应，特定表位需进一步筛选高抗原性、低过敏性、无毒性和与人类自身蛋白的最小同源性。在GBM中，优先考虑源自过表达致癌蛋白或肿瘤特异性突变的表位，以最大化肿瘤特异性。还纳入了群体覆盖率分析，以确保所选表位与不同HLA等位基因相关。这对于开发广泛适用的疫苗或优化个性化构建体尤为重要。此外，评估表位在肿瘤亚克隆中的保守性，以最小化肿瘤进化过程中抗原丢失的风险。
疫苗构建体设计
高质量表位被组装成一个单一嵌合构建体。为了保持单个表位的结构完整性并实现抗原呈递细胞的适当加工和呈递，战略性地使用短肽接头。常用接头如AAY或GPGPG序列，可减少连接处免疫原性并增加表位切割。佐剂被添加到构建体中以增强免疫活化，这些可以是细胞因子序列、Toll样受体（TLR）激动剂或增加抗原呈递和免疫识别的载体蛋白。在设计过程中还考虑了理化特性，如稳定性、溶解性和分子量，以确保有效表达和递送。
结构建模与验证
疫苗构建体的三维构象使用结构生物信息学工具建模。此阶段确保整体结构在生理条件下稳定，并且表位仍可用于免疫识别。分子对接研究评估表位与MHC分子或TLR的相互作用，提供结合亲和力和免疫原性潜力的信息。分子动力学模拟通过评估构建体在模拟生物环境中的随时间稳定性，进一步优化。通过识别潜在的结构缺陷并在后续研究前指导优化，这些分析降低了失败率。
密码子优化与计算机克隆
对于基于核酸的疫苗平台，使用密码子优化来提高选定宿主系统中的基因表达。这涉及修改密码子使用以适应宿主偏好，从而提高翻译效率和蛋白质产量。还优化了GC含量和mRNA稳定性等其他参数。通过计算机克隆技术模拟优化基因序列插入表达载体的过程，确保与调控元件和限制性酶切位点的兼容性。此阶段加速了从计算设计到实验生产的过渡，简化了实验室工作流程。新兴的计算机建模框架为了解和优化疫苗诱导的免疫反应与GBM中抑制性TME之间的相互作用提供了强大手段。基于智能体的模型（ABMs）能够在空间异质性肿瘤环境中模拟单个细胞行为，捕获与Tregs、TAMs和MDSCs的相互作用。互补地，系统生物学模型使用微分方程和基于网络的方法来表示调节免疫抑制和肿瘤进展的信号通路。这些计算工具使研究人员能够测试假设的疫苗策略，预测不同治疗组合下的免疫动态，并确定有利于有效抗肿瘤免疫的条件。重要的是，此类模型可以整合患者特定数据，从而在临床验证之前进行指导疫苗设计、给药策略和联合疗法的个性化模拟，从而提高转化效率。
免疫模拟与验证
计算机免疫模拟平台预测宿主对预期疫苗的免疫反应。这些模型计算疫苗接种后抗体产生、T细胞活化、细胞因子释放和免疫记忆形成的情况。研究人员可以通过模拟不同的给药方案来预测长期疗效并优化疫苗接种计划。多表位疫苗设计框架结合了免疫信息学、结构生物学和系统建模，以创建高度定制且可能成功的GBM疫苗。这种计算驱动的方法提高了精确度，缩短了开发时间，并增加了成功临床转化的可能性。
与多组学数据的整合
多组学数据的整合是开发GBM精准疫苗的关键组成部分。由于GBM具有显著的瘤间和瘤内异质性，单层分析通常无法捕捉肿瘤生物学的全部复杂性。多组学方法，包括基因组学、转录组学、蛋白质组学、表观基因组学和新兴的空间技术，能够全面表征肿瘤特异性改变和免疫相互作用。通过整合这些数据集，研究人员可以找到高置信度的疫苗靶点，并创建具有更高疗效和特异性的定制免疫治疗策略。
基因组学与转录组学
基因组分析，特别是通过全外显子组测序，提供了对产生肿瘤特异性新抗原的体细胞突变的关键见解。在GBM中，识别非同义突变可以预测仅在肿瘤细胞中独特表达的候选表位。然而，并非所有突变都具有生物学相关性或表达水平足以引发免疫反应。因此，整合来自RNA测序的转录组数据对于确认基因表达和优先考虑功能活跃的靶点至关重要。转录组学还有助于发现肿瘤微环境中差异表达的基因和免疫相关特征。基因表达谱可以显示免疫检查点分子、细胞因子和帮助免疫系统逃避检测的通路的上调。这些数据指导疫苗靶点选择和潜在的联合策略，包括将疫苗与免疫检查点抑制剂配对。
蛋白质组学与表观基因组学
蛋白质组分析通过验证源自候选基因的蛋白质的实际存在和数量，提供了额外的验证层。因为蛋白质表达最终决定了抗原被免疫识别的可用性，蛋白质组学有助于缩小通过基因组和转录组分析发现的疫苗靶点列表。质谱等方法还可以发现MHC分子上天然存在的肽，这为免疫
