基于自然多样性的催化核心嵌合技术能够快速实现逆转录酶的改造，并使其具有耐抑制剂的特性

《Journal of Biological Engineering》：Natural diversity-guided catalytic-core chimerism engineers a rapid and inhibitor-tolerant reverse transcriptase

　　

摘要

背景

逆转录酶（RTs）是基于RNA的分子技术的重要组成部分，但其实际性能往往受到催化速度、热稳定性和对抑制物质的耐受性之间权衡的限制。传统的通过突变或定向进化进行优化方法通常能够改善单一特性，但难以将多种特性整合到同一酶中。在这里，我们利用催化核心重组技术，在自然序列多样性和诊断性能标准的指导下，恢复了通过单一特性优化难以获得的逆转录酶表型。

结果

从1,028个序列开始，我们选取了24个具有代表性的RT变体，通过将一个关键的405个残基的聚合酶结构域替换到一个经过验证的M-MuLV骨架中，生成了一个嵌合体文库。我们确定chRT V18为最佳候选者，其在宽广的温度范围（40–70°C）内表现出一致的活性。此外，chRT V18在高温条件下仅需1分钟即可实现高效且线性的cDNA合成，同时保持对临床相关抑制剂的强抵抗力。除了RT-qPCR之外，chRT V18还能在69°C的高温下支持RT-LAMP反应，而这一条件通常是传统逆转录酶无法满足的，从而提高了特异性并加快了扩增速度。当将其制成一步RT-qPCR混合试剂时，chRT V18实现了较低的检测限，并与IVD批准的检测方法完全一致，同时将逆转录时间缩短了90%，从而缩短了获得结果所需的时间。

结论

自然多样性引导的催化核心嵌合技术使得开发出一种快速、耐抑制剂的逆转录酶成为可能，这种酶具有广泛的温度适用性、微秒级别的逆转录速度以及对临床相关抑制剂的强抵抗力。除了chRT V18自身的特性外，这些结果还支持将进化优化的结构域进行模块化重组，作为一种在实际工程中整合复杂酶多种性能特性的实用策略。